Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của Chrysophanol trong đại hoàng dùng làm chất chuẩn
Tạp chí y - dợc học quân sự số 6-2011 Chit xut, phõn lp v xỏc nh cu trỳc húa hc ca chrysophanol trong i hong dựng lm cht chun Trnh Nam Trung*; V Bỡnh Dng*; Ch Vn Mn* Nguyn Vn Long*; Hong Vn Lng* Tóm tắt Chrysophanol l hot cht chớnh ca dc liu i hong (Rheum palmatum L., h Rau rm -Polygonaceae). Trong nghiờn cu ny, chrysophanol c chit xut, phõn lp v xỏc nh cu trỳc da vo cỏc c tớnh húa lý v d liu ph UV, IR, MS, NMR so sỏnh vi ti liu tham kho. Cht phõn lp cú tinh khit t 94%, iu kin lm cht chun, gúp phn tiờu chun húa dc liu i hong. * T khúa: i hong; Chrysophanol; Cht chun. Extraction, isolation and structural elucidation of chrysophanol from rheum palmatum for using as standard compound Summary Chrysophanol is the main component of Rhubarb (Rheum palmatum L., Polygonaceae). In this study, chrysophanol was isolated from Rhubarb and its chemical structure was identified by comparing the physicochemical properties and spectroscopic data (UV, IR, MS, NMR) to published values. The isolated compound with high purity (94%) will distribute to standardize the quality of Rhubarb. * Key words: Rheum palmatum; Chrysophanol; Standard compound. ặT VấN ề Nguyờn tc tiờu chun húa dc liu v ch phm t dc liu l da vo phõn tớch cht cú hot tớnh sinh hc trong dc liu ú. Nh vy, mun tiờu chun húa dc liu cng nh cỏc dng bo ch t dc liu thỡ phi cú cht chun. Do ú, vic phõn lp, tinh ch c cht tinh khit tiờu chun dựng trong phõn tớch l cn thit. Viờn nộn bao phim anthrin c bo ch t anthranoid ton phn trong cõy i hong (Rheum palmatum) v Chỳt chớt (Rumex wallichii), c th tỏc dng nhun trng trên lõm sng v cho hiu qu tt. Tuy nhiờn, vic tiờu chun hoỏ ngun dc liu, bỏn * Học viện Quân y Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Văn Minh thnh phm anthranoid cng nh ch phm bng phng phỏp phõn tớch hin i nh HPLC cũn gp nhiu khú khn do khụng cú cht chun. gúp phn nõng cao cht lng viờn anthrin, chỳng tụi tin hnh chit xut, phõn lp chrysophanol - thnh phn chớnh cú trong anthranoid chit t i hong - cú tinh khit cao lm cht chun. 7 T¹p chÝ y - dỵc häc qu©n sù sè 6-2011 VËT LIƯU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIªN C UỨ 1. Ngun vật liệu và thiết bị. * Ngun vật liệu: - Dược liệu Đại hồng (Rheum palmatum L., họ Rau răm - Polygonaceae) mua ở cửa hàng thuốc cổ truyền Trần Hưng Đạo, quận Hà Đơng, Hà Nội, được kiểm định theo tiêu chuẩn DĐVN IV (2010). - Chrysophanol chuẩn, 98% (Aldrich Chemical Company). - Các dung mơi: ethyl acetat, ether dầu hỏa, chloroform, methanol… đạt tiêu chuẩn p và pa. - Các hố chất: NaHCO 3 , Na 2 CO 3 , NaOH, HCl, silica gel . đạt tiêu chuẩn dược dụng. * Thiết bị, dụng cụ: - Hệ thống HPLC Alliance Water 2695D (Mỹ). - Máy fraction collector DC-1200 (Nhật). - Máy cất quay chân khơng Rotavapor R- 200 (Buchi, Đức). - Máy siêu âm Memmert GmbH (Đức). - Cột sắc ký và dụng cụ thủy tinh. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Chiết xuất, phân lập: Dựa trên ngun tắc: anthraquinone có độ tan khác nhau trong các dung dịch kiềm. Vì vậy, có thể thủy phân anthraglycosid bằng dung dịch axít sulfuric, rồi chiết xuất anthraquinone bằng chloroform. Sau đó, chiết xuất phân đoạn bằng dung dịch kiềm có độ kiềm tăng dần (dung dịch NaHCO 3 5%, Na 2 CO 3 5%, và NaOH 5%). Cuối cùng, tinh chế và phân lập anthraquinone bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel. Dung mơi rửa giải là hỗn hợp ether dầu hỏa và ethyl acetat với những tỷ lệ khác nhau. * Xác định cấu trúc hóa học: Chất phân lập được đem xác định các thơng số hóa lý: điểm chảy, phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập bằng cách so sánh với các dữ liệu đã cơng bố. * Đánh giá độ tinh khiết: Đánh giá độ tinh khiết của chất phân lập bằng cách so sánh với chất chuẩn trên sắc ký đồ theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Điều kiện sắc ký: + Máy HPLC: Alliance Water 2695D. + Cột: Spherisorb C18, 5 µm, 100 A, 125 x 4,0 mm. + Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 254 nm. + Pha động: hệ dung mơi axÝt phosphoric 0,1%: methanol (15:85). + Tốc độ dòng: 1 ml/phút. + Thể tích tiêm: 10 µl. - Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn: cân chính xác 1 lượng chrysophanol thử và chrysophanol chuẩn, hòa tan trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ 80 µg/ml. Lấy chính xác 2 ml của dung dịch trên để pha lỗng thành dung dịch có nồng độ 16 µg/ml. - Tiến hành: tiêm chính xác 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào cột, rửa giải và xác định hàm lượng các chất. 8 Tạp chí y - dợc học quân sự số 6-2011 KếT QU NGHI êN CứU V BN LU N 1. Kt qu nghiờn cu chit xut v phõn lp. * Chit xut: Bt r i hong khụ (200 g), chit xut vi 3 lớt hn hp dung mụi CHCl 3 /H 2 SO 4 20% (5:1, v/v) bng phng phỏp chit siờu õm. Mi m chit 3 ln, mi ln 20 phỳt. Dch chit c lc v cụ cũn 200 ml bng mỏy ct quay chõn khụng. Ra dch cụ bng nc ct un sụi loi tp (tanin) v axớt. Sau ú, chit ln lt dung dch chloroform cũn li bng dung dch NaHCO 3 5% (3 ln x 200 ml), Na 2 CO 3 5% (3 ln x 200 ml), NaOH 5% (3 ln x 200 ml). Axớt húa dch chit ny bng dung dch HCl 36% n pH = 1 - 2, lc thu ta bụng mu vng. * Phõn lp v tinh ch: T phõn on NaOH 5%, bng phng phỏp sc ký ct vi cht hp ph l silica gel v dung dch ra gii l h dung mụi ether du ha - ethyl acetate (5:1, v/v) ó thu c mt cht tinh khit mu vng. Cht phõn lp cú giỏ tr Rf tng ng vi giỏ tr Rf ca chrysophanol chun trờn sc ký (iu kin sc ký: bn mng silica gel GF 254 , h dung mụi khai trin Toluen: EtOH: AcOH = 7:2:1) di ỏnh sỏng t ngoi bc súng 365 nm nờn cú th s b xỏc nh cht ny l chrysophanol. Quy trỡnh chit xut, phõn lp v tinh ch chrysophanol t i hong c trỡnh by túm tt hỡnh 1. Hỡnh 1: Quy trỡnh chit xut v phõn lp chrysophanol t r i hong. 2. Kt qu xỏc nh cu trỳc húa hc ca cht phõn lp. Cht phõn lp nhn c di dng bt mu vng, im chy 193 - 194 o C. Thụng s ca cỏc loi ph: UV max (MeOH): 258 v 432 nm; IR (KBr) max cm -1 : 3.000, 1.650, 1.615, 1.560, 1.465 v 1.200; ESIMS m/z 255 [M+H] + . 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) : 7.77 (1H, dd, J = 8,0, 1,6 Hz, H-5), 7,64 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-6), 7,60 (1H, d, J = 1,6 Hz, H- 4), 7,25 (1H, dd, J = 1,6, 8,0 Hz, H-7), 7,05 (1H, brs, H-2), 2,44 (3H, s, 3-CH 3 ); 13 C-NMR (100 MHz, CDCl 3 ) : 192,6 (C-9), 182,0 (C- 10), 162,8 (C-1), 162,5 (C-8), 149,5 (C-3), 137,1 (C-6), 133,8 (C-4a), 133,4 (C-10a), 124,7 (C-7), 124,5 (C-2), 121,5 (C-4), 120,1 (C-5), 116,0 (C-8a), 113,8 (C-9a), 22,4 (3- CH 3 ). 9 T¹p chÝ y - dîc häc qu©n sù sè 6-2011 Hình 2: Hình ảnh các phổ của chrysophanol: UV (1), IR (2), ESIMS (3), 1 H-NMR (4), 13 C-NMR (5) và DEPT (6). So sánh với các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo [3, 4], có thể kết luận chất phân lập được là chrysophanol. Hình 3: Cấu trúc hóa học của chrysophanol. 3. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của các chất phân lập. Bằng phương pháp HPLC, đã đánh giá độ tinh khiết của chrysophanol phân lập được theo phương pháp ngoại chuẩn, so sánh diện tích píc của chất thử và chất chuẩn trên sắc ký đồ trong cùng điều kiện sắc ký (hình 4). Kết quả cho thấy, chrysophanol phân lập được đạt độ tinh khiết 94%. 10 (1) (2) (3) (5) (6) (4) T¹p chÝ y - dîc häc qu©n sù sè 6-2011 Hình 4: Sắc ký đồ của chrysophanol thử (a) và chuẩn (b). 11 (a) (b) KếT LUậN T dc liu i hong, bng phng phỏp dung mụi v sc ký ct ó chit xut, phõn lp v tinh ch c hot cht chrysophanol cú tinh khit 94%, t yờu cu lm cht chun. Kt qu ny s gúp phn tiờu chun húa v dc liu i hong bng phng phỏp HPLC. TI LIệU THAM KH O 1. B Y t. Dc in Vit Nam IV. NXB Y hc. 2010. 2. Nguyn Vn n, Nguyn Vit Tu. Phng phỏp nghiờn cu hoỏ hc cõy thuc. NXB Y hc. 1985. 3. Choi, S.Z, Lee, S.O, Jang, K.U. Antidiabetic stilbene and anthraquinone derivatives from Rheum undulatum. Arch. Pharm. Res. 2005, 28, pp.1027-1030. 4. Zhou, X, Song, B, Jin, L, Hu, D, Diao, C, Xu, G, Zou, Z, Yang, S. Isolation and inhibitory activity against ERK Phosphorylation of hydroxyanthraquinones from rhubarb. Bioorg Med Chem Lett. 2006, 16 (3), pp.563-568. . kết luận chất phân lập được là chrysophanol. Hình 3: Cấu trúc hóa học của chrysophanol. 3. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của các chất phân lập. Bằng. ether dầu hỏa và ethyl acetat với những tỷ lệ khác nhau. * Xác định cấu trúc hóa học: Chất phân lập được đem xác định các thơng số hóa lý: điểm chảy,