NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất khác từ chi Alpinia (Zingiberaceae

đại học quốc gia hà nội trờng đại học khoa học tự nhiên

KHOA HểA HỌC

===  ===

CAO HOÀNG

NGHIấN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP

đại học quốc gia hà nội trờng đại học khoa học tự nhiên

KHOA HểA HỌC

===  ===

CAO HOÀNG

NGHIấN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP

LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hoáhọc các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hóa học, TrườngĐại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơnchân thành đến:

GS TSKH Phan Tống Sơn đã tạo các điều kiện nghiên cứu thuận lợi

giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

PGS TS Phan Minh Giang đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng

dẫn và tạo các điều kiện nghiên cứu thuận lợi tôi trong suốt thời gian thựchiện luận văn

Cử nhân khoa học Trần Thị Hiền đã cùng cộng tác với tôi trong việc

tiến hành các thí nghiệm thuộc đề tài luận văn

Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, cácnghiên cứu sinh, các bạn học viên cao học K18 và các em sinh viên trongPhòng thí nghiệm Hoá học các hợp chất thiên nhiên đã tạo môi trường nghiêncứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bản luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2009

Học viên

Cao Hoàng

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU ….… ….…… ……….….1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN … 2

1.1 Khái quát về chi Alpinia (Zingiberaceae)……….……… …….2

1.1.1 Đặc điểm thực vật học ………2

1.1.2 Chi Alpinia (Zingiberaceae) ở Việt Nam… ……… …… 3

1.1.3 Alpinia pinnanensis T L Wu et Senjen (Zingiberaceae) ………….5

1 2 Các nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic chi Alpinia (Zingiberaceae) ……….… ………6

1.3 Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất khác từ chi Alpinia (Zingiberaceae) ………21

CHƯƠNG 2: NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… … 25

2.1 Nhiệm vụ nghiên cứu ……… …25

2.2 Phương pháp nghiên cứu ……….……… 25

2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết …… ……….… 25

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất ……… …… 26

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc … ……… ………26

2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học chống oxi hóa …… …….…26

CHƯƠNG 3: PHẦN THỰC NGHIỆM ……… ………… ……28

3.1 Thiết bị và hoá chất ……….……….……… 28

3.2 Nguyên liệu thực vật… ….……… ……… 29

3.3 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis … … … 29

3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ……… ………30

3.4.1 Phần chiết n -hexan ( AP1 )……… … ……… 30

3.4.2 Phần chiết điclometan ( AP2 ) ……… ……… ……… 31

3.4.3 Phần chiết etyl axetat ( AP3 )……… ….… ……… 31

3.5 Phân tách sắc ký các phần chiết và phân lập các hợp chất ………… 31

3.5.1 Phân tách phần chiết n -hexan ( AP1 ) ……… ……… 31

3.5.2 Phân tách phần chiết điclometan ( AP2 ) 32

3.5.3 Phân tách phần chiết etyl axetat ( AP3 ) …….……… … 33

3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập…….… 34

3.7 Thử hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính quét gốc tự do DPPH………… 36

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… ………38

4.1 Đối tượng nghiên cứu … …… ……… 38

4.2 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis …… …… 38

4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết n -hexan ( AP1 )……… 40

4.3.1 Phân tích phần chiết n -hexan ( AP1 ) .……… ………40

4.3.2 Phân tách phần chiết n -hexan ( AP1 ) ……… ……… 42

4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết điclometan ( AP2 )… … 45

4.4.1 Phân tích phần chiết điclometan ( AP2 ) …….……… 45

4.4.2 Phân tách phần chiết điclometan ( AP1 )… ……… ………….… 46

4.5 Nghiên cứu thành phần hóa học của phần chiết etyl axetat ( AP3 ) … 48

4.5.1 Phân tích phần chiết etyl axetat ( AP3 )………… ……… ………… 48

4.5.2 Phân tách phần chiết etyl axetat ( AP3 )……….……… ……… 49

4.6 Xác định cấu trúc của các hợp chất được phân lập ………… ……51

4.7 Thử hoạt tính cống oxi hóa ……… ………60

KẾT LUẬN ………… … ………62

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………… ……….64

CÁC CHỮ VIẾT TẮT THƯỜNG DÙNG TRONG LUẬN VĂN

TLC : (Thin layer Chromatography): Sắc ký lớp mỏng

CC : (Column Chromatography): Sắc ký cột thường

FC : (Flash Chromatography): Sắc ký cột nhanh

Mini-C : (Minicolumn Chromatography): Sắc ký cột tinh chế

IR : (Infrared Spectroscopy): Phổ hồng ngoại

GC-MS : (Gas Chromatography - Mass Spectrometry): Sắc ký khí khối phổEI-MS : (Electron Impact Mass Spectroscopy): Phổ khối lượng va chạm điện

tử

1H-NMR : (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR : (Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT :(Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ DEPT

MỤC LỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Các loài Alpinia ở Việt Nam

Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (AP1)

Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết điclometan (AP2)

Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (AP3)

MỤC LỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1: Một số loài Alpinia (Zingiberaceae) của Việt Nam

Hình 2: Alpinia pinnanensis T L Wu et Senjen (Zingiberaceae)

Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các phần chiết n-hexan (AP1), điclometan

(AP2) và etyl axetat (AP3)

Sơ đồ 2: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết n-hexan (AP1)

Sơ đồ 3: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết điclometan (AP2)

Sơ đồ 4: Quá trình phân tách sắc ký phần chiết etyl axetat (AP3)

Sơ đồ 5: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.18

Sơ đồ 6: Sự phân mảnh EI-MS của AP1.22

Sơ đồ 7: Sự phân mảnh EI-MS của AP3.4

MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phổ IR của AP1.11

Phụ lục 2: Phổ EI-MS của AP1.15

Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của AP1.15

Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR và DEPT của AP1.15

Phụ lục 5: Phổ EI-MS của AP1.18.3

Phụ lục 11: Phổ 13C-NMR và DEPT của AP3.4

Phụ lục 12: Phổ EI-MS của AP2.18

Phụ lục 13: Phổ EI-MS của AP2.11.3.3

Phụ lục 14: Phổ EI-MS của AP2.16

Phụ lục 15: Phổ EI-MS của AP3.4

Phụ lục 16: Phổ EI-MS của AP3.13.3

LỜI MỞ ĐẦU

Chi Riềng (Alpinia, Zingiberaceae) là một chi lớn, gồm khoảng 230

loài phổ biến khắp vùng Châu Á nhiệt đới và cận nhiệt đới, tạo thành một chilớn nhất, phổ biến nhất và phức tạp về thực vật nhất của họ Zingiberaceae ỞViệt Nam, nhiều loài thuộc chi này là những cây thuốc cổ truyền trong Y học

Việt Nam như Alpinia galanga, Alpinia oxyphylla, Alpinia conchigera … Một

số loài Alpinia cũng mới được phát hiện gần đây ở Việt Nam và được đưa vào

chương trình nghiên cứu hóa học các loài thực vật họ Zingiberaceae của

chúng tôi như Alpinia gagnepainii, Alpinia naponensis, Alpinia maclurei, Alpinia pinnanensis… Nghiên cứu xác định các thành phần hoá học của chi

này có ý nghĩa đóng góp vào các hiểu biết về sự phân loại thực vật theo hoá

học của chi Alpinia cũng như các chức năng sinh học của các hợp chất được

phân lập Trong một nghiên cứu trước các cấu trúc tổng hợp (hybrid) thú vịgiữa chalcon và điarylheptanoit cùng với các hợp chất phenolic (2′,4′-dihydroxy-6′-methoxychalcon, 4′,6′-dimethylchalconavingenin, alpinentin,

naringenin 5-0-methyl ether và hepten) và phytosterol β-sitosterol, stigmasterol và β-sitosterol-3-O-ββ-D- glucopyranosid đã được phát hiện từ loài Alpinia pinnanensis được thu thập tại Vĩnh Phúc [24] Sau đó, cardamomin đã được phát hiện từ Alpinia conchigera là một tác nhân chống viêm đầy triển vọng qua các nghiên cứu sự

(3S,5S)-trans-3,5-dihydroxy-1,7-diphenyl-1-ngăn chặn của hợp chất này lên các đường truyền tín hiệu của yếu tố phiên mãNF-kappa B [14] Tiếp tục nghiên cứu các thành phần hóa học của loài

Alpinia pinnanensis được thu thập tại Lào Cai trong nghiên cứu của Luận văn

này, chúng tôi mong muốn đóng góp thêm những hiểu biết mới về hoá học và

hoạt tính sinh học của loài Alpinia pinnanensis vào chi Alpinia

(Zingiberaceae) của Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về chi Alpinia

1.1.1 Đặc điểm thực vật học [1, 2]

Các cây thuộc chi Alpinia (chi Riềng) thuộc loại thân thảo thẳng, cao từ

0,4 – 2,5 m Thân rễ khỏe bò dưới đất Lá hình mác hẹp hoặc hình xoan,thường có mũi nhọn, không cuống hoặc cuống ngắn Bẹ lá và lưỡi bẹ cuộnkín, dài Cụm hoa ở dạng bông hoặc hình truỳ, các nhánh gần như không có,

có khi rất ngắn, mang một hoa (ít khi có nhánh nhỏ) Các lá bắc của cácnhánh lớn như lá bắc con của hoa có hình ống, cái này lồng vào cái kia, códạng phẳng hoặc lõm, thường lớn hơn lá bắc bọc ngoài, cuống hoa thườngngắn hơn lá bắc của hoa Hoa tạo thành tràng có nhiều màu kết hợp trắng đỏhoặc hồng Đài hoa hình ống Tràng hoa có dạng ống ngắn, thuỳ hoa hìnhtrứng, lõm, dạng tù Bao phấn hình thuẫn Trung đới dày, có mào, nhị hai,ngắn, hình răng hoặc hình dùi lồng vào giữa chỉ nhị và cách môi hoặc khôngcách môi dài hơn nhị Các thuỳ của tràng hoa thường có dạng thuẫn, chiathành ba, rất lõm có dạng thuyền Hoa có hương thơm kém quyến rũ hơn sovới một số chi khác trong họ Gừng Zingiberaceae Noãn sào có số lượngkhông xác định Quả gồm một quả mọng, khô, mở đều hoặc không mở, nhiềuhạt, có ba góc do sức ép, được bao bởi một lớp áo hạt

Thân rễ chi Alpinia sinh trưởng khá nhanh Từ một chồi giống ban đầu,

chúng có thể phân nhánh, đâm chồi, tăng sinh khối, phát triển thành một bụilớn chỉ trong một vài năm

Ở nước ta chi Alpinia khá phong phú Chúng sinh trưởng trong vùng

rừng núi ở hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam Một số loài được coi là đặc hữu,

ví dụ như Alpinia phuthoensis Gagnep., Alpinia tonkinensis Gagnep…

1.1.2 Chi Alpinia ở Việt Nam

Chi Alpinia (chi Riềng) là một chi lớn của họ Gừng (Zingiberaceae) Theo Phạm Hoàng Hộ [4], ở Việt Nam có hơn 20 loài Alpinia khác nhau Các

loài này được liệt kê trong Bảng 1

Tuyên Quang,Ninh Binh, LâmĐồng

2 Alpinia breviligulata

Gagnep

Riềng mép ngắn,

3 Alpinia chinensis(Retz.) Roscoe. Riềng tàu,

Lương khương

Kontum, LâmĐồng, Lạng Sơn,

Hà Tây, Hà Tĩnh,Thừa Thiên -Huế

5 Alpinia gagnepainii K.Schum. Riềng Ganepain Hà Nam Ninh

6 Alpinia galanga (L.)Willd. Riềng nếp Các tỉnh miền Bắc

7 Alpinia globosa(Lour.) Horan. Sẹ, Mè tré

Cao Bằng, LạngSơn, Lai Châu,Vĩnh Phúc

11 Alpinia mutica Roxb. Riềng không múi Sài Gòn, Đồng Lai

12 Alpinia officinarum Riềng, Riềng thuốc Các tỉnh phía Bắc

17 Alpinia venlutina Ridl. Riềng lông

Bà Rịa

Trong dân gian các cây thuộc chi Alpinia không chỉ là gia vị quen

thuộc mà còn có mặt trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh như đau dạ dày,đau bụng, đầy hơi, khó tiêu, ỉa chảy, sốt rét, sốt nóng, nôn mửa, làm ấm tì vị

và kích thích tiêu hoá, còn được dùng để chữa các vết thương, vết loét…

Các loài Alpinia được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền Việt Nam là Alpinia bracteata Roxb., Alpinia breviligulata Gagnep., Alpinia chinensis (Retz.) Roscoe., Alpinia conchigera Griff., Alpinia galanga (L.) Willd., Alpinia globosa (Lour.) Horan., Alpinia malaccensis (Burm F.) Roscoe., Alpinia officinarum Hance., Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Sm.,

Alpinia oxyphylla Miq., Alpinia kadsumadai Hayt., Alpinia japonica Miq [3].

Alpinia conchigera Griff Alpinia purpurata K Schum.

Alpinia zerumbet (Pers.) B L Alpinia officinarum Hance.

Burtt & R M Sm.

Hình 1 : Một số loài Alpinia (Zingiberaceae) của Việt Nam

1.1.3 Alpinia pinnanenensis T L Wu et Senjen (Zingiberaceae)

Cây có cuống giả dài khoảng 1,5 cm, lá hẹp mảnh 30-60 x 5-9 cm.Nhánh hoa hình trụ 7-9 x 1,5-2,5 cm Hoa màu vàng Đài khoảng 3 mm, chỉnhị khoảng 4 mm, bao phấn khoảng 3 mm Quả nang đỏ, hình cầu, đường

kính khoảng 1-2 cm, khô và giòn, bầu nhụy dạng trứng ngược, khoảng 1 mm.Cây ra hoa vào tháng 7 cây mọc phổ biến ở Quảng Châu, Trung Quốc [7].

Hình 2 : Alpinia pinnanensis T L Wu et Senjen (Zingiberaceae)

Có rất nhiều nghiên cứu khoa học đã được thực hiện với các loài

Alpinia (Zingiberaceae) và đã được chúng tôi tổng kết trong một Luận án tiến

sĩ [6] Tổng quan sau tổng kết các kết quả nghiên cứu hoá học và hoạt tính

sinh học về chi Alpinia (Zingiberaceae) trong 10 năm gần đây (1999-2009).

1.2 Các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất

phenolic từ chi Alpinia (Zingiberaceae)

Bảy hợp chất đã được phân lập từ Alpinia officinarum Hance là

β-sitoterol, 1,7-diphenyl-5-ol-3-hepton (1), 1-phenyl-7-(3'-methoxy-4'-hyđroxy) phenyl-5-ol-3-heptanon, glandin (2), kaempferol-4'-methylether (3) và axit 3,4-dihydroxylbenzoic (4) Trong số các hợp chất này axit 3,4-

dihydroxylbenzoic là chất lần đầu tiên nhận được từ Alpinia officinarum

1-Phenyl-7-(3′-methoxy-4′-hyđroxy)phenyl-5-ol-3-hepton và một hợp chất mới,

1,7-diphenyl-3-5-heptandiol-phenyl-7-(3′-methoxyl-4′-hyđroxyl) heptadiol đã nhận được từ 1,7-diphenyl-5-ol-3-heptanon và 1-phenyl-7-(3′-methoxyl-4′-hydroxyl) phenyl-5-ol-3-heptanon bằng sự khử hóa [12].

1

Điarylheptanoit 7-(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3

-on (5) (HMP) là một chất hóa học có nguồn gốc thực vật được tìm thấy trong

Alpinia officinarum Các tính chất chống viêm của hợp chất này trên dòng tế

bào đại thực bào chuột RAW 264.7 và các tế bào đơn nhân máu người ngoại

vi (PBMC) đã được nghiên cứu in vitro Xử lý các tế bào 264.7 RAW với

HMP (6,25-25μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàyM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàycũng ức chế sự giải phóng các cytokin gây viêm interleukin-1β (IL-β) và

tumor necrosis factor-α (TNF-α) gây bởi LPS từ PB-MC người in vitro Hơn

nữa, Western blotting và sự phân tích phản ứng mạch polymerase- sự phiên

mã ngược chứng tỏ rằng HMP làm giảm protein iNOS (inducible nitric oxitsynthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) gây bởi LPS và sự biểu hiện mRNAtrong các tế bào RAW 264.7 Hơn nữa, điều trị HMP cũng làm giảm sự liênkết DNA của các NF-kappa B gây ra bởi LPS trong các tế bào RAW 264.7

Để định giá các cơ chế phân tử cho sự ức chế của các thực thể trung gian gây

viêm bởi HMP (25 μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàyM) tác dụng của HMP trên protein kinase được hoạt hóa

bởi mitrogen p38 và P44/42 (MAPK) gây bởi LPS đã được nghiên cứu Sựphosphoryl hóa của p44/42 MAPK trong các tế bào RAW 264.7 được hoạthóa bởi LPS đã làm giảm đáng kể bởi HMP, trong khi sự hoạt hóa của p38MAPK không bị ảnh hưởng Các kết quả này đã cho thấy HMP đã ức chế sự

sản sinh NO, IL-1β và TNF-α gây bởi LPS và sự biểu hiện gen iNOS vàCOX-2 bằng cách ức chế sự hoạt hóa NF-kB và sự phosphoryl hóa P44/42MAPK [38].

OCH3

OH O

5

Các tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn đã cho thấy phần chiết

etanol 40% từ thân rễ Alpinia officinarum Hance có thể ức chế Staphylococcus aureus, Streptococcus tan máu và Streptococcus preunoniae.

Reductase β-ketoacyl-ACP (FabG, EC.1.1.1.100) là một enzym chìa khóatrong các hệ Synthase axit béo dạng II trong các vi khuẩn và xúc tác cho sự

khử hóa β-ketoacyl-ACP Các phần chiết Alpinia officinarum đã ức chế FAbG

với một giá trị IC50 4,47±0,1 µg/ml và mạnh hơn các chất ức chế đã đượccông bố trước đó Các nghiên cứu động học đã cho thấy sự ức chế bao gồm cảthuận nghịch và không thuận nghịch Các phần chiết ức chế FAbG theo mộtcách thức cạnh tranh với NADPH Cho đến nay không có chất ức chế nàođược công bố có thể thể hiện ức chế không thuận nghịch FAbG, trong khiphần chiết etanol có thể ức chế FAbG không thuận nghịch Sự ức chế không

thuận nghịch cho thấy 2 pha Có thể là phần chiết Alpinia officinarum ức chế

FAbG và qua đó thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [17]

Điều trị sự kháng kháng sinh cho các bệnh nhiễm khuẩn thường dẫn đếnphản ứng viêm của vật chủ Các phân tử với các tính chất kháng khuẩn vàkháng viêm nhị chức có thể cho một giải pháp cho các biểu hiện lâm sàngnày Hoạt tính nhị chức của một điarylheptanoit, 5-hyđroxy-7-(4''-hyđroxy-3-

methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon (6) được phân lập từ Alpinia

officinarum đối với khuẩn gây bệnh đường ruột Escherichia coli (EPEC) đã

được thông báo Điarylheptanoit này cho các hoạt tính ức chế và diệt khuẩnEPEC được phân lập lâm sàng và ức chế hiệu quả sự viêm gây bởilipopolissacarit của EPEC trong các tế bào máu đơn nhân người ngoại vi.

Phân tích docking in silico cho thấy điarylheptanoit có thể tương tác với một đơn vị phụ A của DNA gyrase của E coli Các phân tử với hoạt tính nhị chức

như vậy có thể là các chất điều trị có tiềm năng cho các bệnh nhiễm khuẩn[35]

O

OCH3

OH OH

6

Phần chiết 80% axeton-nước từ thân rễ Alpinia officinarum đã được phát

hiện ức chế melanogenesis trong các tế bào khối u 4A5-B16 Trong số các

hợp chất được phân lập 4 điarylheptanoit, 5-hyđroxy-1,7-diphenyl-3-heptanon

(7), 7-(3'',4''-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-on (8), hydroxy-3''-methoxyphenyl)-1-phe-nyl-3-heptanon (9) và 3,5-dihyđroxy-1,7- diphenylheptan (10) và 2 flavonol kaempferid (11) và galangin (12) ức chế

5-hyđroxy-7-(4''-melanogenesis với các giá trị IC50 từ 10-48 µM và một số yêu cầu về cấu trúccủa các hợp chất có hoạt tính cho sự ức chế đã được làm rõ Ngoài ra 7-(4''-hyđroxy-3''-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-on, kaempferid và galangin

ức chế sự biểu hiện mRNA của tyrosinase, tyrosinase và các protein-1 và 2liên quan đến tyrosinase, và mức protein của một yếu tố phiên mã liên kết vớimicrophthalmia [23]

OH OH

O HO

OH OH

OCH3

10 11

O HO

OH

OH O

12

Phân tách theo định hướng thử nghiệm sinh học phần chiết metanol có

hoạt tính gây độc tế bào từ thân rễ Alpinia officinarum Hance đã phân lập

được 2 điarylheptanoit mới alpinoid D (13) và E (14), cùng với 15

điarylheptanoit đã biết khác Hoạt tính gây độc tế bào của các điarylheptanoit

được đánh giá đối với dòng tế bào u nguyên bào thần kinh người IMR-32

Các hợp chất trên đã được chứng tỏ là có hoạt tính mạnh nhất với các giá trị

IC50 là 0,83, 0,23 và 0,11 µM [36]

Hai điarylheptanoit mới,

(5S)-5-hyđroxy-7-(3,4-dihyđroxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon (15) và

(5R)-5-hydroxy-7-(3-methoxy-4,5-dihydroxyphe-nyl)-1-phenyl-3-heptanon (16), cùng với hai chất tương tự đã biết khác (17 và

18), đã được phân lập từ thân rễ của Alpinia officinarum Hợp chất 18 cho

hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào, HepG2, MCF-7 và SF-268,

trong khi đó các hợp chất 15-17 không có hoạt tính đáng kể [9].

Phân tách định hướng bằng thử nghiệm sinh học phần chiết ete của

Alpinia officinarum Hance đã phân lập được 2 hợp chất mới,

6-hydroxy-1,7-diphenyl-4-en-3-hep-tanon (19) và 6-(2-hydroxyphenyl)-4-methoxy-2-pyron (20) và 3 hợp chất đã biết, 1,7-diphenyl-4-en-3-heptanon (21), 1,7-diphenyl- 5-methoxy-3-heptanon (22) và apigenin (23) Cả ba điaryheptanoit 19, 21 và

22 cho hoạt tính ức chế hoạt tính liên kết thụ quan PAF (yếu tố hoạt hoá tiểu

cầu) mạnh với giá trị IC50 là 1,3, 5,0 và 1,6 µM Nghiên cứu này đã cho thấycác điarylheptanoit là một lớp chất đối kháng PAF mạnh mới [16]

O OCH3

O OCH 3

OH

OH

OH O

22 20 23

Một điarylheptanoit mới, cùng với 5 điarylheptanoit đã biết, đã được

phân lập từ thân rễ Alpinia officinarum Cấu trúc của hợp chất mới đã được xác định là trans,trans-1(3′-methoxy-4′-hydroxyphenyl)-7-phenyl-5-ol-4,6-

dien-3-heptanon (24) [10].

Trong nghiên cứu thành phần glycozit từ thân rễ Alpinia officinarum Hance, một este glycozit, 4′-hydroxy-2′-methoxyphenyl-β-βD-{6-O-[4′′-

hyđroxy-3′′,5′′-dime- thoxy(benzoat)]}-glucopyranosid (25) cùng với một

chất đã biết n-butyl-β-D- fructopyranosid (26), đã được phân lập Alpinosid A (25) là một chất mới và 26 đã được phân lập lần đầu tiên từ chi Alpinia [13].

Sáu điarylheptanoit được phân lập từ thân rễ Alpinia officinarum là các

chất ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào RAW 264.7 được hoạt hoábằng lipopolysacarit Một liên kết đôi C-4 của mạch liên kết giữa các vòngthơm đã được phát hiện là yếu tố cấu trúc cần thiết cho hoạt tính Hơn nữa,các điarylheptanoit đã ngăn chặn sự biểu hiện của protein và mRNA enzyminducible NO synthase Kết quả này đã cho thấy tác dụng truyền thống của

thân rễ Alpinia officinarum làm thuốc chống viêm đã được giải thích một

phần bằng hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào được hoạt hóa[21]

Phần chiết 80% axeton - nước từ thân rễ Alpinia officinarum đã được

phát hiện ức chế sự sản sinh nitơ oxit (NO) trong các đại thực bào màng bụngđược hoạt hoá bằng lipopolysacarit (LPS) Qua phân tách theo định hướng

hoạt tính sinh học đã phân lập được hai điarylheptanoit

7-(4′′-hydroxy-3′′-methoxyphenyl-1-phenylhept-4-en-3-on (27) và heptan (28) và một flavonol, galangin (29); các hợp chất này ức chế đáng kể

3,5-đihyđroxy-1,7-điphenyl-sự sản sinh NO với các giá trị IC50 từ 33-62 µM Để làm sáng tỏ mối quan hệcấu trúc - hoạt tính sinh học (SAR) của các điarylheptanoit, các điaryl-

heptanoit từ Curcuma zedoaria đã được nghiên cứu Các kết quả cho thấy liên

kết đôi hoặc phần enon ở các vị trí 1-7 là các yếu tố cấu trúc quan trọng chohoạt tính sinh học [22]

HO

OH

29

AIDS vẫn còn là một mối quan tâm tới sức khỏe toàn cầu và hiện nay còn

có các nhu cầu cấp thiết để phát triển một loại điều trị mới cho virut suy giảmmiễn dịch người (HIV) Trong một nghiên cứu định hướng vào các tác nhân

chống HIV, 1'S-1'-acetoxychavicol acetate (ACA) (30), một hợp chất phân tử

nhỏ được phân lập từ thân rễ Alpinia galanga có khả năng ức chế sự vận

chuyển Rev ở nồng độ thấp bằng cách kết hợp duy trì khu vực nhiễm sắc thể

1 và tích lũy HIV-1 RNA đủ độ dài trong nhân, kết quả là ngăn chặn quá trình

sao chép HIV-1 trong các tế bào máu đơn nhân ngoại vi Hơn thế nữa ACA

và didanosin tác dụng hợp đồng để ức chế sự sao chép HIV-1 Do đó, ACA

có thể đại diện cho một sự điều trị HIV-1, đặc biệt là cho sự kết hợp với cácthuốc chống HIV khác [40]

O O)

O

O H

30

Qua nghiên cứu SAR dựa trên 1’S-1’-axetoxychavicol axetat (30) đối

với hoạt tính chống dị ứng loại I bằng cách đánh chỉ số sự giải phóng β-β

hexosaminidase, một chất đánh dấu của sự mất hạt gây bởi kháng nguyênantigen IgE trong các tế bào RBL-2H3, một chất tương tự bền và có hoạt tínhmạnh hơn, 4-(methoxycacbonyloxy phenylmethyl)phenyl axetat đã được phát

triển Hợp chất này cũng ức chế mạnh TNF-α và sự sản sinh IL-4 gây bởi

kháng nguyên IgE [30]

Phân tách theo định hướng hoạt tính sinh học ức chế virut HIV-1 quangăn chặn vận chuyển protein điều chỉnh virut HIV-1 (Rev), đã phát hiện

được 1′-acetoxychavicol acetat (ACA) (30) từ rễ Alpinia galanga là một chất

ức chế mới sự chuyển nhân của Rev Phân tích cơ chế tác dụng với mẫu thử

(31) và một vài chất tổng hợp tương tự đã xác định được các phần quyết định trong cấu trúc của 32 cho hoạt tính ức chế Rev-export [18].

O O

O O

31

O O

1′-Acetoxychavicol acetat (30) đã được xác định là thành phần chủ yếu

của phần chiết axeton từ thân rễ Alpinia galanga quyết định cho hoạt tính

kháng plasmid qua nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học1′-acetoxychavicol acetat đã chứng tỏ khả năng điều trị plasmid được mã hóakháng kháng sinh trong nhiều chủng vi khuẩn kháng đa thuốc của các chủng

được phân lập từ bệnh viện như Enterococcus faecalis, Salmonella typhi, Pseudomonas aeraginosa, Escherichia coli và Bacillus cereus với hiệu quả

điều trị 66%, 75%, 70%, 32% và 6% ở SIC 400-800μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàyg/ml Một nghiên cứu đãxác định tác dụng gây độc tế bào và sự tổn thương DNA của phần chiết nước

từ Alpinia galanga trên 6 dòng tế bào người khác bao gồm các tế bào thông

thường và nguyên bào sợi p53, các biểu mô thường, u vú và ung thư phổi.Các hợp chất trong phần chiết đã được xác định bằng phương pháp phổ khốilượng là 1’-acetoxychavicol acetat và các dẫn xuất đeaxetyl của hợp chất này.Tuy nhiên, trong thử nghiệm trên các tế báo ung thư phổi người A-549, các

hợp chất này đã không quyết định cho hoạt tính gây độc tế bào gây ra bởiphần chiết nước [25].

Viêm xương khớp (OA) là một dạng phổ biến nhất của bệnh viêm khớp

và ảnh hưởng đến hàng triệu người người dân trên toàn thế giới Các bệnhnhân được điều trị theo truyền thống với các thuốc chống viêm không phảisteroid (NSAIDs), các thuốc này đều liên quan đến các tác dụng phụ đáng kể

Tinh chế phần chiết axeton của Alpinia galanga Lin cho

hydroxycinnamaldehyd (33) Bằng cách sử dụng sự nuôi cấy mô sụn,

p-hydroxycinnamaldehyd ngăn chặn sự mất axit uronic, kết quả giải là phónghyaluronan (HA), các glycosaminoglycan được sunfat hóa (s-GAG) và các

metall proteinase nền (MMP) p-Hydroxy- cinnamaldehyd và

interleukin-1beta (IL- 1β) được ủ trong các tế bào sụn gốc người, cùng làm giảm sự giảiphóng HA, s-GAG và MMP-2 Các kết quả đã cho thấy: (a) các mức biểuhiện của các gen dị hóa MMP-3 và MMP-13 đã được giữ nguyên và (b) cácmức độ biểu hiện của các gen đồng hóa của collagen II, SOX9 và aggrecan đã

được tăng lên Nghiên cứu cho thấy p-hydroxycinnaldehyd từ A galanga là

một tác nhân tiềm năng cho điều trị bệnh viêm khớp [29]

OH

O H

H H

lý các tế bào KB với các nồng độ khác nhau của các phần chiết AP (25-200µg/ml) dẫn đến các dãy hiện tượng gây bởi apoptosis, như sự mất sự sống của

tế bào, sự thay đổi hình thái, và sự phân mảnh AND giữa các nhân Sự chết tếbào được lập trình gây bởi AP gắn liền với sự mất thế năng màng ty lạp thể,

sự chuyển cytochrome C, sự hoạt hóa caspase-3 và 9 với sự thoái biến nhiềuADP-ribose polymerase (PARP) trong các tế bào KB Sự tăng apoptosis gâybởi AP này còn liên quan với một sự khử các mức của Bcl-2, một chất ức chếmạnh sự chết tế bào, và sự tăng protein Bax, chất mà mà nó tạo dime dị tô vàbằng cách đó ức chế Bcl-2 Hơn nữa các phần chiết AP gây ra một sự tăng

nồng độ oxy hóa (ROS) trong các tế bào KB Các phát hiện này cho thấy A pricei thể hiện tác dụng chống kháng sinh và ức chế sự phát triển trên các tế

bào ung thư biểu mô người KB qua con đường gây ra sự chết được lập trình

của các tế bào phụ thuộc vào ty lạp thể A pricei có thể có các tính chất chống

ung thư có giá trị cho các sản phẩm dược và trong thực phẩm [41]

Alpinia pricei Hayata được trồng khắp châu Á và là một cây đặc hữu ở

Đài Loan Lá và rễ của cây này được sử dụng truyền thống để gói thực phẩm

và là chất thay thế nấu ăn cho gừng tươi Ảnh hưởng chống viêm in vitro của các phần chiết etanol từ Alpinia pricei Hayata (EEAP) và các hợp chất

phenolic của nó đã được nghiên cứu Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho

thấy EEAP có chứa axit caffeic (34), axit chlorogenic (35), axit ferulic (36),

axit p-hydroxybenzoic (37), rutin (38), apigenin (23), curcumin (39) và

pinocembrin (40) EEAP và các hợp chất phenolic, apigenin, curcumin và

pinocembrin ức chế sự sản sinh nitơ oxide (NO) và prostaglandin E2 (PGE 2)được sinh ra trong các tế bào RAW 264.7 Hơn nữa, EEAP, apigenin,curcumin và pinocembrin làm giảm sự hoạt hóa của protein gây bởi LPS và

sự biểu hiện mRNA của iNOS (inducible nitric oxide) và COX-2(cyclooxygenase-2) ở các tế bào RAW 264.7 được gây ra bởi lipolyssacarit

(LPS) Ngoài ra EEAP và hoạt chất chính pinocembrin (40) cũng ức chế

mạnh sự chuyển nhân của yếu tố phiên mã NF-kappaB gây bởi LPS và sựbiểu hiện reporter gen EEAP và pinocembrin cũng ức chế mạnh sự sản sinhcác tiểu phân oxi hoạt động (ROS) nội bào gây bởi LPS trong các tế bàoRAW 264.7 Khi kết quả này được kết hợp lại, nó cho thấy EEAP vàpinocembrin ức chế sự sản sinh NO và PGE2 gây bởi LPS bằng cách ngănchặn sự chuyển nhân của yếu tố phiên mã NF-kappaB và sự sản sinh ROS[41]

Trong nghiên cứu thành phần hóa học có trong quả Alpinia oxyphylla

và hoạt tính gây độc tế bào của nó trên các dòng tế bào ung thư, 8 hợp chất đãđược phân lập bằng các phương pháp sắc ký cột từ phần chiết 70% Me2CO-

H2O quả cây A oxyphylla Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định là

(9E)-humulen-2,3,6,7-diepoxid (41), 3(12),7(13),9E-humulatriene-2,6-diol

(42), (-) oplopanon (43), yakuchinon A (44), yakuchinon B (45), tectochrysin

(46), isovanillin (47) và (2E,4E)-6-hydroxy-2,6-dimethylhepta-2,4-dienal

(48) Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 41, 42 và 45 trên các dòng tế

bào ung thư, A549, HT-29 và SGC-7901, đã được đánh giá bằng thử nghiệm

sulforhodamine B (SRB) Các hợp chất 41, 42, 47 và 48 đã được phân lập lần đầu tiên từ chi này và các hợp chất 41, 42, và 45 không thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư ở nồng độ 10 mg/L [37]

O O

OH

OH O

H O

46 47

Khả năng bảo vệ thần kinh của axit protocatechuic (PCA) (49), một

hợp chất phenolic được phân lập từ hạt Alpinia oxyphylla, đối với apoptosis

và sự oxy hóa gây bởi hydrogen peroxid (H2O2) trong các tế bào được nuôicấy PC12 đã được nghiên cứu Sự tiếp xúc của các tế bào PC12 với 0,4 mM

H2O2 gây ra một sự thoát lactate dehydrogenase (LDH) và giảm sự sống của

tế bào trong thử nghiệm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) PCA làm tăng sự sống tế bào của PC12 và làm giảm sự chết

tế bào được lập trình gây bởi H2O2 trong một sự phụ thuộc vào liều lượng.Phân tích flow cytometric cho thấy tác dụng mạnh của PCA đối với sự bảo vệcác tế bào PC12 đối với apoptosis gây bởi H2O2 Trong các tế bào này, cáchàm lượng của glutathione (GSH) và hoạt tính catalase đã được tăng cường,trong khi hoạt tính của glutathione peroxidase không thay đổi Hơn nữa, PCAcũng bảo vệ sự hư hại tế bào gây ra bởi H2O2 và Fe 2 +, chất này tạo ra các gốc

tự do hydroxyl (.OH) do phản ứng Fenton Các kết quả này cho thấy rằngPCA có thể là một chất hóa học thích hợp cho điều trị stress và các bệnh thoái

hóa thần kinh gây bởi sự oxy hoá [34]

Ba chất liên hợp monoterpen-chalcon, rubrain (50), isorubrain (51) và

sumadain C (52) đã được phân lập từ hạt Alpinia katsumadai Cấu trúc và cấu

hình tương đối của các hợp chất đã được chứng minh bằng phổ NMR và ray Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này đã được đánh giá trên cácdòng tế bào HepG2, MCF-7 và MAD-MB-435, và 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-

X-3-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon đã được chứng minh là có hoạt tínhgây độc tế bào [32].

O

OO

OH

OO

OH

50 51

Tám hợp chất đã được phân lập từ phần chiết etanol của Alpinia

katsumadai Hayata, dipheny-5-hydroxy-4,6-heptadien-3-on (52),

1,7-diphenyl-1,4,6-heptadien -3-on (53), pinocembrin, cardamomin (54), alpinetin

(55), 7,4-dihydroxy-5-methoxy flavanon (56) và β-sitosterol (57) Trong đó 2

hợp chất đầu và (58) đã được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này [42].

Tổng kết lại, các hợp chất phenolic mới vẫn tiếp tục được phân lập từ

các loài Alpinia officinarum, Alpinia galanga, Alpinia kadsumadai và Alpinia

oxyphylla Các hợp chất này cho một tỷ lệ cao các hoạt chất chống viêm,

kháng virut và chống ung thư

1.3 Các nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp

chất khác từ chi Alpinia (Zingiberaceae)

Các thành phần hóa học khác thường được phát hiện trong các thực vật

chi Alpinia (Zingiberaceae) là các hợp chất mono- và sesquitecpenoit trong

các tinh dầu từ các bộ phận lá, thân, rễ và quả Các đitecpenoit dãy labdanthường được phân lập và các hợp chất này cho các hoạt tính gây độc tế bàomạnh

Các tinh dầu từ lá khô, thân giả và thân rễ loài Alpinia conchigera

Griff được thu nhập từ tỉnh Jeli của Kelanta, bờ biển phía đông của bán đảoMalaysia, đã nhận được bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước Phân tích GC vàGC-MS đã nhận biết được 41 hợp chất, trong đó 13 thành phần đã được xácđịnh lần đầu tiên Ở lá, thân giả và thân rễ 40, 33 và 39 thành phần đã được

xác định Thành phần phổ biến nhất trong tinh dầu lá là β-bisabolen (15,3%), β-pinen (8,2%), β-sesquiphellandren (7,6%), chavicol (7,5%) và β-elemen (6,0%), trong khi β-bisabolen (19,9%), β-sesquiphellandren (11,3%), β- caryophyllen (8,8%) và β-elemen (4,7%), là các hợp chất chính trong tinh dầu thân giả Trong tinh dầu thân rễ, 1,8-cineol (17,9%), β-bisabolen (13,9%), β- sesquiphellandren (6,8%) và β-elemen (4,0%) là các hợp chất chính Các tinh

dầu đã được thử nghiệm hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn, tuy nhiên chỉ

có các sự ức chế yếu đối với các vi sinh vật thử nghiệm đã được phát hiện[29]

Trong liệu pháp điều trị thực vật, tinh dầu từ lá cây Alpinia zerumbet (Alpinia speciosa K Schum.) đã được sử dụng cho điều trị các triệu chứng

của bệnh thần kinh, như sự giảm thần kinh, stress, lo lắng, và các bệnh vềkinh niên liên quan đến sự mất cân bằng hoocmon sinh sản ở phụ nữ Thành

phần hoá học của tinh dầu đã được phân tích bằng GC-MS Các tính chất củatinh dầu gây ra sự thay đổi hành vi của chuột đã được nghiên cứu bởi cácquan sát hành vi và bài toán mê cung nâng cao (EPM) được sử dụng làmphương pháp để đánh giá các biểu hiện giảm căng thẳng Năm hợp chất chính,

p-cymen (28,0±5%), 1,8-cineol (17,9±4,2%), terpinen-4-ol (11,9± 6,3%),

limonen (6,3±2,2%) và camphor (5,2±2,1%) đã được xác định bằng GC vàGC-MS Đưa tinh dầu vào bằng đường hít (8,7 ppm) đã dẫn phản ứng nhảyduy nhất ở chuột Để nghiên cứu các cơ chế điều chỉnh hành vi của tinh dầu,

10 mg/kg 5-HTP hoặc 10 mg/kg fluoxetine đã được tiêm vào đường màngbụng trước khi cho hít tinh dầu Bằng các xử lý trước với 5-HTP hoặcfluoxetine, tần số nhảy đã giảm đáng kể Trong thí nghiệm EPM, tinh dầu(0,087 và 8,7 ppm) đã cho thấy rõ hoạt tính giảm căng thẳng ở chuột [19]

Kỹ thuật HSCCC bán điều chế đã được áp dụng thành công trong phân

lập và tinh chế nootkaton (59) từ tinh dầu quả Alpinia oxyphylla Miquel.

Mười hai hệ dung môi 2 pha, bao gồm có 7 hệ không nước và 5 hệ hữu cơnước-dung môi hữu cơ, với hệ số phân bố phù hợp của nootkaton mà còn hệ

số tách thích hợp giữa nootkaton và valencen, tạp chất chủ yếu trong tinh dầu

Hơn nữa trong HSCCC, hexaclorofom-axetonitril (10:1:10, v/v), và hexan-metanol-nước (5:4:1, v/v) đã được sàng lọc riêng biệt Tuy nhiên, n-

n-hexan-metanol-nước (5:4:1,v/v) được cho là tối ưu vì thời gian rửa giải rấtngắn và các dạng pic HSCCC tốt hơn Bằng cách rửa giải pha dưới của hệdung môi trong phương thức đầu-đuôi, 3,1 mg nootkaton đã nhận được với độtinh khiết 92,3% (GC-MS) từ 80 mg tinh dầu thô trong thao tác một bước vớithời gian ít hơn 4 giờ [24]

59

Nghiên cứu hoá học phần chiết CHCl3 từ hạt Alpinia zerumbet đã phân

lập được 2 labdan đitecpen mới (60 và 61) cùng với năm hợp chất đã biết 66) Tất cả các chất được phân lập đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế

(62-bào trên các dòng tế (62-bào ung thư THP-1, HL-60, A-375 và A-549 Hai hợp

chất 60 và 61 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh [23].

O

CHO

OH O

H OH

OH O OH O

OH

65 66

CHƯƠNG II NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nhiêm vụ nghiên cứu

Luận văn này nghiên cứu thành phần hoá học của cây Alpinia pinnanensis T L Wu et Senjen (Alpinia pinnanensis T L Wu et S J Chen)

(Zingiberaceae) được thu thập ở Lào Cai

Nhiệm vụ được đề ra cho nghiên cứu trong luận văn này gồm có:

1 Xây dựng quy trình chiết các hợp chất hữu cơ thiên nhiên có từ thân rễ cây

Alpinia pinnanensis;

2 Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) các phần chiết để định tính các phầnchiết và xác định các hệ dung môi thích hợp cho phân tách sắc ký cột;

3 Phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất thành phần chính bằngcác phương pháp sắc ký điều chế;

4 Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổhiện đại

5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phenolic nhận được

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và chiết

Mẫu thực vật sau khi được thu hái được rửa sạch, thái nhỏ và phơi khôtrong bóng râm, sau đó sấy ở 40oC và xay thành bột mịn Bột nguyên liệuthực vật được ngâm chiết với dung môi axeton ở nhiệt độ phòng Phần chiếtaxeton nhận được được phân bố chọn lọc bằng phương pháp chiết hai pha

lỏng lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần, n-hexan, điclometan

và etyl axetat

2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phầnchiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểmtra độ sạch của các hợp chất phân lập

Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc

ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chếcác hợp chất thiên nhiên

Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất không khí nén Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế lượng nhỏ (< 15mg) chất hữu cơ

Phương pháp kết tinh để tinh chế các chất rắn

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phươngpháp phổ:

Phổ hồng ngoại (IR);

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR);

Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT

2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

Các hợp chất phenolic được phân lập đã được đánh giá hoạt tính chống

oxi hóa in vitro theo phương pháp quét gốc tự do DPPH của S G Olga et al.

(2003)

Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa được thực hiện tại Phòng Sinhhọc thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học vàcông nghệ Việt Nam

CHƯƠNG III PHẦN THỰC NGHIỆM

3.1 Thiết bị và hoá chất

- Các phương pháp sắc ký

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trênnền nhôm Phát hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đó hơnóng bản mỏng ở 1200 và đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm

Sắc ký cột thường (CC)

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Chấthấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 µm (Merck, Darmstadt,CHLB Đức)

Sắc ký cột nhanh (FC)

Phân tách sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới áp suất nén Chất hấpphụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàym và 63-100 μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàym) (Merck,Darmstadt, CHLB Đức)

Các cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) có đường kính khác nhauđược sử dụng tùy theo khối lượng mẫu cần phân tách

Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)

Phân tách sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế các hợp chấthữu cơ Cột Pasteur pippet (0,7 cm i d × 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡhạt 15-40 μM) ức chế mạnh sự sản sinh nitơ oxit (NO) Hợp chất nàym) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C

Kỹ thuật nhồi cột ướt và đưa mẫu lên cột tẩm trên silica gel hoặc đưa mẫutrực tiếp đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký FC, CC và Mini-C

- Các phương pháp phổ

Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS)

Phổ EI-MS được đo trên thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MSEngine và Waters Autospec Premier

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Các phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trênthiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero

(δ = 0) Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm Tính bội của các

tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135

3.3 Điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

Mẫu bột khô thân rễ cây Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngâm chiết

trong dung môi axeton ở nhiệt độ phòng Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu đượcdịch chiết axeton đầu tiên Tiến hành lặp lại quá trình ngâm mẫu trong axetonthêm 4 lần nữa Cuối cùng lọc bỏ bã thực vật thu được dịch chiết axeton Dịchchiết sau 5 lần ngâm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung môi dưới

áp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để tránh làm biến chất cho đến khi thuđược phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt

Hoà loãng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch

nước nhận được với các dung môi n-hexan, điclometan và etyl axetat Các

dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đó được cất loại kiệtdung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được các phần chiết tương

ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và

AP3 (phần chiết etyl axetat)

Quy trình điều chế các phần chiết được nêu trên Sơ đồ 1, Mục 4.2;Chương 4: Kết quả và Thảo luận

Xác định khối lượng các phần chiết và tính hiệu suất so với lượng mẫukhô ban đầu Kết quả được trình bày ở Bảng 2.

Bảng 2: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%)

3.4 Phân tích thành phần các phần chiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck) trên nền nhôm Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọntrong các hệ dung môi triển khai khác nhau để cho các sắc ký đồ phân giải tốt

DC-các hợp chất trong DC-các phần chiết từ thân rễ cây Alpinia pinnanensis

3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1)

Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện

với các hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1,

v/v) Phát hiện các vệt chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc1%