Phân lập và đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật chịu mặn phân lập từ đất trên quần đảo Trường Sa

Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật chịu mặn phân lập từ đất trên quần đảo Trường Sa từ đó lựa chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất để sản xuất phân hữu cơ vi sinh.

Nghiên cứu khoa học công nghệ PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHOSPHATE KHÓ TAN CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA Vũ Duy Nhàn1, Vũ Văn Dũng1*, Nguyễn Thị Nhàn1, Trần Thị Nguyệt1, Lê Đức Anh1, Nguyễn Huy Hoàng2, Đỗ Hữu Nghị3, Lê Thị Yến4, Nguyễn Thị Lý5 Tóm tắt: Từ 26 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả phân giải phosphate khó tan phân lập từ 46 mẫu đất quần đảo Trường Sa lựa chọn chủng D3 2.3 có khả phân giải phosphate mạnh ứng dụng sản xuất phân hữu vi sinh chịu mặn Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, thời gian, nồng độ muối với thành phần môi trường khác nguồn carbon nitơ đến khả sinh trưởng phân giải phosphate chủng D3 2.3 Kết cho thấy, nồng độ muối thích hợp cho sinh trưởng 0-5%, nhiệt độ thích hợp 340C, pH thích hợp 6.5-7 Nguồn cacbon thích hợp phân giải phosphate sucrose glucose, nguồn nitơ thích hợp phân giải phosphate cao nấm men NH4NO3 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự 16S rRNA cho thấy, chủng D3 2.3 có tỷ lệ tương đồng 100% với lồi Bacillus endophyticus Từ khóa: Vi sinh vật; Phân giải phosphate; Chịu mặn; Nguồn carbon; Nguồn nitơ; Đất Trường Sa MỞ ĐẦU Phốt (P) nguyên tố thiết yếu cho phát triển tăng trưởng trồng Trong tự nhiên, dạng phosphate hòa tan cho trồng hấp thu đất bị hạn chế tồn chủ yếu muối phosphate khơng hịa tan sắt, nhơm canxi đất Trong q trình canh tác bón phân lân cho trồng, lượng lớn phosphate (70 đến 90%) giữu lại cố định cation Ca2+ đất đá vôi đất bình thường để tạo thành canxi phosphate hay với Al3+ Fe3+ đất chua để tạo thành nhôm phosphate (AlPO) phosphate sắt (FePO) không tan [1] Trong đất vùng rễ cây, nhiều vi sinh vật có khả hịa tan phosphate khó tan đất thơng qua q trình hịa tan khống hóa Nhóm vi sinh vật làm tăng tính khả dụng sinh học phosphate không tan để thực vật sử dụng Các vi sinh vật đất chịu mặn thể khả hịa tan phosphate khơng hịa tan tạo điều kiện cho phát triển nông nghiệp khu vực đất nhiễm mặn kiềm [2] Các vi sinh vật hòa tan phosphate nhóm vi sinh vật có lợi có khả thủy phân hợp chất phospho hữu vơ khó tan Cơ chế q trình hịa tan phosphate đất làm giảm độ pH đất nhờ sản xuất axit hữu giải phóng proton Các axit hữu vô sản xuất vi sinh vật hịa tan phosphate khó tan cách chelat hố với cation cạnh tranh vị trí hấp phụ đất với phosphate [3] Mục tiêu nghiên cứu phân lập, đánh giá khả phân giải phosphate khó tan chủng vi sinh vật chịu mặn phân lập từ đất quần đảo Trường Sa từ lựa chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cao để sản xuất phân hữu vi sinh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu - 46 mẫu đất quần đảo Trường Sa - Môi trường NBRIP 2.2 Phương pháp phân lập vi si sinh vật phân giải phosphate khó tan Theo mơ tả Teng cộng (2019) [4] lấy 10 g đất pha với 90ml nước muối sinh Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 389 Hóa học – Sinh học – Mơi trường lý đến nồng độ pha lỗng đến 10-5 Hút 0.1ml dịch pha loãng nồng độ cấy trải môi trường đĩa petri NBRIP agar Đem mẫu nuôi cấy tủ ấm 300C Sau 2-5 ngày, lựa chọn khuẩn lạc xung quanh có vịng phân giải lân Tiến hành làm chủng vi khuẩn thu bảo quản lạnh sâu -800C 0C để sử dụng làm nghiệm 2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hòa tan phosphate Chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi lỏng lắc mơi trường NBRIP lỏng, tốc độ 200 vịng/phút Sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả sinh trưởng, dịch ni vi khuẩn ly tâm 10.000 vịng/phút, 10 phút, 4ºC Hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường xác định theo phương pháp Xanh molybdate [5] 2.4 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh trưởng hòa tan phosphate Các chủng vi khuẩn đánh giá khả sinh trưởng mơi trường lỏng NBRIP lỏng có bổ sung nồng độ muối NaCl (w/v): 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 9%, 10%, 12% 15% Nuôi cấy dịch vi khuẩn máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút 30°C, sau ngày tiến hành đếm khuẩn lạc môi trường NBRIP agar để xác định khả sinh trưởng ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút, 4ºC, thu dịch để kiểm tra hàm lượng PO43- giải phóng vào mơi trường phương pháp Xanh molipdate 2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng pH nhiệt độ môi trường muối lên khả sinh trưởng hòa tan phosphate Các chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi lỏng lắc môi trường NBRIP lỏng, tốc độ 200 vòng/phút, giá trị pH (5, 6, 7, 8, 9) nhiệt độ 25, 27, 30, 34, 37 40ºC Sau ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả sinh trưởng, dịch ni vi khuẩn ly tâm 10.000 vịng/phút, 10 phút, 4ºC Hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường xác định theo phương pháp Xanh molybdate 2.6 Ảnh hưởng nguồn carbon Nguồn carbon glucose, fructose, maltose, lactose, saccarose, dextrin bổ sung vào môi trường NBRIP lỏng Sau ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả sinh trưởng, dịch ni vi khuẩn ly tâm 10.000 vịng/phút, 10 phút, 4ºC Hàm lượng PO43- giải phóng vào mơi trường xác định theo phương pháp Xanh molybdate 2.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ Nguồn nitơ (NH4)2SO4, NaNO3, NH4NO3, pepton, yeast extract, meat extract Sau ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả sinh trưởng, dịch ni vi khuẩn ly tâm 10.000 vịng/phút, 10 phút, 4ºC Hàm lượng PO43-giải phóng vào môi trường xác định theo phương pháp Xanh molybdate 2.8 Định danh chủng vi sinh vật DNA tổng số vi khuẩn tách chiết kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Gen 16S rRNA khuếch đại giải trình tự cặp mồi phổ thơng 27F 1492R Những trình tự 16S rRNA hồn chỉnh so sánh với trình tự 16S rRNA công bố ngân hàng liệu GeneBank để xác định tỷ lệ tương đồng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn phân giải phosphate Sau ngày nuôi cấy môi trường NBRIP dịch pha loãng, mẫu đất quần đảo Trường Sa lựa chọn 55 khuẩn lạc có vịng phân giải phosphate với bán kính vịng 390 V D Nhàn, …, N T Lý, “Phân lập đánh giá khả … quần đảo Trường Sa.” Nghiên cứu khoa học công nghệ phân giải lớn 13,2mm Chúng tơi lựa chọn 26 chủng có vòng phân giải lớn 5mm để tiến hành xác định hàm lượng PO43- giải phóng vào mơi trường xác định theo phương pháp Xanh molybdate Kết thể hình Trong 26 chủng vi khuẩn phân giải phosphate, hai chủng STT3 5.2 D3 2.3 có hoạt tính đạt hiệu cao 309.37 ± 5.58 mg/l 342.06 ± 6.92 mg/l sau ngày nuôi cấy, cao so với chủng lại Vi sinh vật vùng rễ báo cáo có khả phân giải phosphate Baliah cs., (2016) [6] tuyển chọn Bacillus megaterium, P putida có khả phân giải phosphate cao Nguyễn Thị Thanh Mai cộng (2017) [7] phân lập chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả chịu mặn đến nồng độ muối 10%, hoạt tính phân giải phosphate cao nồng độ muối 1% 145,965mg/l Do chủng D3 2.3 có hoạt tính phân giải phosphate cao nên chúng tơi chọn để ứng dụng sản xuất phân hữu vi sinh tiến hành thí nghiệm Hình Hình ảnh sàng lọc chủng vi sinh vật có khả phân giải phosphate khó tan, hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng D2.3.2 Hình Khả phân giải phosphate chủng vi sinh vật phân lập 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hòa tan phosphate cuả chủng D3 2.3 Vi sinh vật sinh trưởng đến giai đoạn định bị suy vong, vậy, việc tìm thời điểm mật độ vi sinh vật đạt cực đại có ý nghĩa quan trọng để xác định thời điểm thu sinh khối tế bào Kết hình cho thấy, chủng D3 2.3 sinh trưởng cực đại thời điểm ngày nuôi cấy lượng PO43- giải phóng mơi trương đạt ngày thứ đạt cực đại sau ngày nuôi cấy 3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh trưởng hòa tan phosphate chủng D3 2.3 Nồng độ NaCl tác động đến áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật, nên ảnh hưởng trực tiếp đến khả sinh trưởng Kết cho thấy, mật độ tế bào nồng độ PO3- giải phóng giảm nồng độ NaCl tăng (hình 4) Chủng D3 2.3 có khả sinh trưởng hòa tan phosphate nồng độ muối từ 0-5% nồng độ 5-10% chủng sinh trưởng chậm, lớn 10% gần khơng phát triển Srinivasan cộng (2012) [8] phân lập 23 chủng vi khuẩn 35 chủng nấm có khả phân giải phosphate đó, Aerococcus sp.PSBCRG1-1, Pseudomonas aeruginosa PSBI3-1, Aspergillus terreus PSFCRG2-1 có khả sinh trưởng phân giải phosphate nồng độ NaCl đến 2M Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 391 Hóa học – Sinh học – Mơi trường Hình Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hòa tan phosphate chủng D3 2.3 Hình Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh trưởng hòa tan phosphate chủng D3 2.3 Hình Ảnh hưởng pH nhiệt độ môi trường muối lên khả sinh trưởng hòa tan phosphate 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật, nhiệt độ nóng q lạnh làm dừng q trình trao đổi chất nên vi sinh vật ngừng phát triển bị chết Chủng D3 2.3 có khả sinh trưởng dải nhiệt độ nghiên cứu từ 25-450C, nhiệt độ thích hợp 340C, nhiệt độ khả sinh trưởng phân hủy phosphate mạnh Khi tăng nhiệt độ cao 34ºC, khả sinh trưởng giảm, khả sinh tổng hợp axit hữu giảm nên giảm khả phân giải phosphate giảm 3.5 Ảnh hưởng pH Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng phát triển chủng D3 2.3 cho thấy, chủng có khả sinh trưởng phân giải phosphate dải pH 5-8 Tại giá trị pH 6,5 khả sinh trưởng phân giải phosphate cao (hình 5) Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên khả phân giải phosphate tác giả Mujahid cs (2015) rằng, pH 5-7 thích hợp với chủng vi khuẩn có khả hòa tan phosphate, khả giảm pH thấp cao [9] 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon Chủng D3 2.3 đánh giá khả sinh trưởng hòa tan phosphate sau ngày nuôi môi trường NBRIP lỏng với nguồn carbon khác Kết4 (hình 7) cho thấy, chúng sử dụng nguồn carbon nitơ nghiên cứu có khả phân giải phosphate Hàm lượng PO43- (mg/l) giải phóng chủng D3 2.3 dao động khoảng 150 đến 350 mg/l, mật độ tế bào từ (1.5-4.8)*108cfu/ml Nguồn carbon thích hợp với chủng D3 2.3 glucose sucrose Nguồn cacbon lactose maltose khả phân giải phosphate Khi đánh giá ảnh hưởng nguồn carbon tới khả phân giải phosphate chủng vi khuẩn phân lập từ đất, Mujahid cs., (2015) [9] nhận thấy, glucose fructose nguồn carbon thích hợp với chủng Baliah cs., (2016) lại kết luận rằng, chủng vi khuẩn phân giải phosphate phân lập từ đất có khả sử dụng maltose lactose, surose nguồn carbon khơng thích hợp [6] Nguyễn Thu Hương cs., (2018) báo cáo rằng, chủng vi khuẩn hịa tan phosphate P aeruginosa thích hợp với nguồn cacbon glucose fructose [10] 392 V D Nhàn, …, N T Lý, “Phân lập đánh giá khả … quần đảo Trường Sa.” Nghiên cứu khoa học công nghệ 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ Sau ngày mơi trường NBRIP có bổ sung nguồn nitơ khác kết cho thấy, chủng D3 2.3 khả sinh trưởng phân giải phosphate tất nguồn nitơ khảo sát Hàm lượng phosphate giải phóng chủng D3 2.3 dao động khoảng 150 đến 350 mg/l, mật độ tế bào từ (0.9-3.6)*108cfu/ml Nguồn nitơ vô cho mật độ tế bào lượng phosphate giải phóng thấp nguồn nitơ hữu Nguồn nitơ hữu thích hợp với cao nấm men, nguồn nitơ vô NH4NO3 Mujahid cs., (2015) [6] cho rằng, (NH4)2SO4, NH4NO3 nguồn nitơ thích hợp với chủng vi sinh vật phân giải phosphate Baliah cs., (2016) [6] kết luận nguồn nitơ vô thích hợp gồm NH4Cl, NH4NO3, KNO3 Nguyễn Thu Hương cs (2018) nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả phân giải phosphat chủng P aeruginosa HD3 kết nguồn nitơ thích hợp cao nấm men (NH4)2SO4, NH4NO3 [10] Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ khả sinh trưởng hòa tan phosphate 3.8 Định danh chủng vi khuẩn D3 2.3 Kết trình tự 16S rRNA hồn chỉnh chủng D3 2.3 so sánh với trình tự 16S rRNA công bố ngân hàng liệu GenBank để xác định tỷ lệ tương đồng Kết cho thấy, chủng D3 2.3 có tỉ lệ tương đồng 100% với loài Bacillus endophyticus KẾT LUẬN Từ mẫu đất vùng rễ thu thập quần đảo Trường Sa lựa chọn 26 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả phân giải phosphate khó tan tuyển chọn D3 2.3 có khả phân giải phosphate mạnh Kết phân tích đặc điểm hình thái trình tự gen 16S rRNA xác định hai chủng thuộc loài Bacillus endophyticus D3 2.3 Chúng nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, thời gian nuôi, nồng độ muối với thành phần môi trường khác nguồn carbon nitơ đến khả sinh phân giải phosphate chủng B.endophyticus D3 2.3 Kết nồng độ muối thích hợp cho sinh trưởng 0-3% Nhiệt độ thích hợp 340C, pH thích hợp 6.5-7 Nguồn cacbon thích hợp phân giải phosphate sucrose glucose nguồn nitơ thích hợp phân giải phosphate cao nấm men NH4NO3 Lời cảm ơn: Nghiên cứu thực tài trợ kinh phí từ đề tài cấp Quốc gia Bộ Khoa học Công nghệ quản lý, mã số 11/19-C-ĐTĐL.CN.CNN TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Satyaprakash M., Nikitha T., Reddi E U B., Sadhana B., and Vani S S., “A review on phosphorous and phosphate solubilising bacteria and their role in plant nutrition,” International Journal of Current Microbiology and Applied Scences, vol 6, 2017, pp 2133–2144 Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 393 Hóa học – Sinh học – Môi trường [2] Sharma S B., Sayyed R Z., Trivedi M H., and Gobi T A.,“Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils,” SpringerPlus, vol 2, 2013, pp 587 [3] David P., Raj R S., Linda R., Rhema S B., “Molecular characterization of phosphate solubilizing bacteria (PSB) and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from pristine soils” Int J Innov Sci Eng Technol., 2014, pp 317–324 [4] Teng, Z., Chen, Z., Zhang, Q et al., “Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soils of the Yeyahu Wetland in Beijing, China”, Environ Sci Pollut Res 26, 2019, pp.33976–33987 [5] Murphy J., and Riley J.P., “A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters”, Department of Oceanography, The University Liverpool, 1996, pp.31-36 [6] BaliahT., et al., “Isolation, identification and characterization of phosphate solubilizing bacteria from different crop soils of Srivilliputtur Taluk, Virudhunagar District, Tamil Nadu” Tropical Ecology, 57(3), 2016, pp.465- 474 [7] Nguyễn Thị Thanh Mai cs., “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên”, Tạp chí khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 60(5), 2018, Tr 34-38 [8] Srinivasan R, Yandigeri MS, Kashyap S, Alagawadi AR., “Effect of salt on survival and P-solubilization potential of phosphate solubilizing microorganisms from salt affected soils”, Saudi J Biol Sci 19(4), 2012, pp.427-434 [9] Mujahid T.Y et al., “Effects of different physical and chemical parameters on phosphate solubilization activity of plant growth promoting bacteria isolated from indigenous soil”, Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences, Vol.5, 2015, pp.64-70 [10] Nguyễn Thu Hương, Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Văn Giang, “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả phân giải phosphate khó tan từ đất vùng rễ lúa tỉnh Hải Dương” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 60(8), 2018, Tr 8-15 ABSTRACT ISOLATION AND EVALUATION OF PHOSPHATE SOLUBILISING HALOPHILIC BACTERIA FROM SPRATLY ISLANDS SOILS 26 bacterial strains with phosphate solubilising activity were isolated from soil samples from the Spratly Islands soil The salt tolerance D3 2.3 strain exhibited the highest phosphate solubilising activity was selected to use for organic fertilizer production We investigated the effect of salt concentrations, pH, time of culture, carbon and nitrogen sources on the growth and solubilization of phosphate The result showed that the strain exhibited highest phosphate solubilising activity when it was cultured in a NBRIP medium with glucose and sucrose as carbon sources and yeast extract or NH4NO3 as nitrogen sources at 34ºC, pH 6.5-7 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences showed that strain D3 2.3 belong to the genus Bacillus, of which it shared 100% identity with Bacillus endophyticus Keywords: Bacteria; Phosphate solubilising; Halophilic; Carbon source; Nitrogen source; Spratly islands soils Nhận ngày 01 tháng năm 2020 Hoàn thiện ngày 05 tháng 10 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 10 năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Hóa học- Vật liệu, Viện KH-CN quân sự; Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ VN; Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ VN; Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội; Học viện Nông nghiệp Việt Nam *Email: vandungbio46@yahoo.com 394 V D Nhàn, …, N T Lý, “Phân lập đánh giá khả … quần đảo Trường Sa.” ... KẾT LUẬN Từ mẫu đất vùng rễ thu thập quần đảo Trường Sa lựa chọn 26 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả phân giải phosphate khó tan tuyển chọn D3 2.3 có khả phân giải phosphate mạnh Kết phân tích... bào chủng D2.3.2 Hình Khả phân giải phosphate chủng vi sinh vật phân lập 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hòa tan phosphate cuả chủng D3 2.3 Vi sinh vật sinh trưởng đến giai... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn phân giải phosphate Sau ngày ni cấy mơi trường NBRIP dịch pha lỗng, mẫu đất quần đảo Trường Sa lựa chọn 55 khuẩn lạc có vịng phân giải phosphate