Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như đạm trúc diệp, tầm gửi, rau cần. Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho các dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin. Tuy nhiên, chuẩn afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu.
Trang 1PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN AFZELIN
TỪ DƢỢC LIỆU
Võ Thanh Hóa * , Nguyễn Minh Đức **
TÓM TẮT
Mở đầu – mục tiêu: Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như Đạm trúc diệp, Tầm gửi,
Rau cần< Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho c{c dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin Tuy nhiên, chuẩn afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo dài Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu
Phương ph{p nghiên cứu: Sàng lọc dược liệu có chứa afzelin bằng HPLC-MS Lựa chọn dược liệu Chiết
cao chiết toàn phần và tách c{c ph}n đoạn đơn giản bằng chiết phân bố giữ nước v| c{c dung môi có độ phân cực khác nhau Phân lập afzelin bằng sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột pha đảo Cấu trúc afzelin phân lập được x{c định bằng phổ UV, IR, MS và NMR Thẩm định và thiết lập chất chuẩn afzelin
Kết quả: Nghiên cứu đã s|ng lọc được c{c dược liệu có chứa afzelin: Cần nước, Tầm gửi, Đạm túc diệp, lá
Bơ v| Sầu đ}u Lựa chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin Từ 15 kg l{ Bơ khô ph}n lập được 1,2 g afzelin
từ l{ Bơ Folia Perseae v| đã tiến h|nh đóng 100 lọ (10 mg/ lọ) với số lô AFZ-001-0914 với độ tinh khiết 94,31% tính theo nguyên trạng Thết lập afzelin đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc theo ISO Guide 35
Kết luận: Quy trình khảo sát sàng lọc dược liệu và phân lập afzelin đơn giản, hiệu quả Afzelin phân lập
được thiết lập thành chất chuẩn theo tiêu chí chuẩn gốc Có thể sẵn s|ng để ứng dụng vào công tác nghiệm dược liệu
Từ khóa: Folia Perseae, afzelin, thiết lập chất chuẩn
ABSTRACT
ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD AFZELIN
FROM HERBAL MEDICINES
Vo Thanh Hoa, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 307 - 314
Introduction - objectives: Afzelin is used as a marker for the quality control of some herbal medicine
However, afzelin standard has not been available in Vietnam and it took a high cost and long time for ordering from foreign countries So the aim of this study was to develop a protocol to isolate and establish afzelin as reference standard
Methods: Herbal medicines containing afzelin were selected by sreening on HPLC-MS method Ethanolic
extract of herbal medicine was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds Isolations were carried out by common and popular phytochemical methods Structures of isolated compounds were deduced by means of UV, IR, MS and NMR spectroscopy Quantitative analysis was validated and isolated afzelin was established as reference standard
Results: Five herbal medicines containing afzelin were invesgated such as Mistletoe (Loranthus chinensis),
Avocado (Persea americana) leaves, Water dropwort (Oenanthe stolinefera), China tree (Azadirachta indica) and
Tác giả liên lạc: ThS Võ Thanh Hóa ĐT: 0986414064 Email: hoavo0808@ump.edu.vn
Trang 2Cow grass (Lophatherum gracile) Avocado leaves were selected to isolate afzelin 1,2 g of afzelin was isolated from avocado leaves and packed into 100 vials (10 mg/ vial) with batch number: AFZ-001-0914 and a content of 94,31% Isolated afzelin was established as reference standard based on ISO Guide 35
Conclusions: The methods of invesgation and isolation were simple, effective Isolated afzelin was established
as primary standard It could be used for controlling the quality of some herbal medicines
Keywords: Folia Perseae, afzelin, establishment of reference standard
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, Việt Nam đang sử dụng rất nhiều
dược liệu để bảo vệ, chăm sóc sức khỏe người
dân Tuy nhiên, nhiều trong số c{c dược liệu này
như Tang ký sinh, Đạm trúc diệp chưa có hoặc
có tiêu chuẩn nhưng chưa có tiêu chuẩn về hàm
lượng Điều n|y g}y khó khăn cho công t{c đảm
bào chất lượng dược liệu Vì vậy, điều cần thiết
là phải xây dựng tiêu chuẩn đầy đủ cho c{c dược
liệu này Tuy nhiên, các chất điểm chỉ chính có
trong c{c dược liệu n|y như afzelin lại không có
trên thị trường Việt Nam, nếu mua từ nước
ngoài lại mất thời gian và giá thành cao, đôi khi
không có Do đó, đề t|i được thực hiện nhằm
phân lập và thiết lập chất chuẩn gốc afzelin theo
hướng dẫn của ISO Guide 35 để phục vụ cho
công tác kiểm nghiệm dược liệu
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PH[P NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Dược liệu Đạm trúc diệp được cung cấp bởi
nhà thuốc T}n Nam Xương, Quận 8, TP HCM; lá
Bơ v| Tầm gửi thu hái tại Buôn Hồ, Đắk Lắk;
Cần nước thu hái tại Hoóc Môn, TP HCM; lá Sầu
đ}u thu h{i tại Rạch giá, Kiên Giang
Phương ph{p nghiên cứu
Khảo s{t dược liệu chứa afzelin
Xử lý mẫu bằng SPE
Bột dược liệu (1 g) được chiết siêu âm trong
30 phút với 30 ml MeOH (2 lần) Lọc dịch chiết,
cô đến cắn Hòa cắn với 3 ml nước cất x 2 lần
Tiến hành nạp mẫu và khai triển cột SPE (C18E
500 mg, 6 ml, 55 µm (Phenomenex) với vệ dung
môi methanol – nước, tỷ lệ methanol tăng dần
Kiểm tra ph}n đoạn bằng HPLC-MS để phát
hiện sự có mặt của afzelin
Điều kiện khai triển: Cột: Agilent C18, 250 x 4,6 mm, 5 µm; Nhiệt độ cột: 30 oC; Đầu dò: UV 265
nm; MS 6120, kỹ thuật ESI, bắn phá ion âm, dạng
ion phân tử thu được [M-H]-; Thể tích tiêm mẫu:
20 µl; Pha động:Acetonitril (A) – Nước (B), rửa
giải gradient; Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút; Thời gian phân tích: 20 phút; Ghi nhận các ion phân
tử của các chất trong khoảng: 300 – 500 m/ z So sánh phổ MS của các chất ghi nhận được với phổ
MS chuẩn của afzelin trong thư viện phổ Xác định mẫu dược liệu có chứa afzelin
Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin
Tiêu chí chọn dược liệu: Dược liệu có chứa afzelin; nguồn cung cấp dược liệu dồi dào; dễ thu hái và xử lý mẫu; ngoài afzelin, ít chứa các polyphenol khác
Phân lập afzelin
Chiết xuất
Dược liệu được chọn được chiết bằng phương ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 70%, dịch chiết được cô thu hồi dung môi thu được cao cồn 70%
Cao cồn được ph}n t{n v|o nước, tiến hành lắc phân bố lần lượt với ether dầu hỏa (60-90 oC) v| ethyl acetat Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô
thu hồi dung môi được cao EA
Phân lập bằng sắc ký cột
C{c cao ph}n đoạn được phân lập các chất bằng phương ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck);
hệ dung môi đã khảo sát bằng phương ph{p sắc
ký lớp mỏng (SKLM) Tiến hành khai triển sắc
ký cột v| theo dõi c{c ph}n đoạn bằng SKLM Dựa vào kết quả SKLM để gom ph}n đoạn
Sắc ký HPLC điều chế
Trang 3Hệ thống sắc ký
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật) Cột:
Discovery HS C18 (250 × 21,2 mm, 10 µm) Nhiệt
độ: Nhiệt độ phòng Tốc độ dòng: 10 ml/phút Thể
tích bơm: 10 ml Phát hiện: UV 265 nm Pha động:
methanol – nước (45 : 55) Dung môi pha mẫu: Pha
động Nồng độ mẫu: 60 mg/ml
Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập bằng HPLC
Điều kiện phân tích: Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5
µm Pha động: acetonitril (A) – nước (B), rửa giải
gradient: 0 phút 25% A, 30 phút 30% A, 31 – 35
phút: 25% A Tốc độ dòng: 0,75 ml/ phút Đầu
dò: PDA Bước sóng phát hiện: 265 nm Thời
gian phân tích: 25 phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
X{c định cấu trúc của hợp chất phân lập được
Tiến h|nh x{c định cấu trúc của hợp chất
phân lập được bằng c{c phương ph{p phổ
nghiệm UV, MS, IR và NMR
Thiết lập chất chuẩn afzelin theo ISO
Guide(2-4)
Độ ẩm
Đo bằng phương ph{p TGA
(Thermogravimetric Analysis)
Định tính v| x{c định cấu trúc
X{c định cấu trúc bằng c{c phương ph{p
phổ UV - Vis, IR, NMR và MS
Tạp chất liên quan
Tiến hành kiểm tra bằng HPLC với quy trình
đã thẩm định
Điều kiện sắc ký: Cột: Phenomenex C18
(250x4,6 mm,5 µm); Pha động: acetonitril – nước
(30:70); Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; Detector: UV 265
nm; Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; Thể tích bơm: 10 µl;
Dung môi pha mẫu: Pha động; Nồng độ mẫu: 300
ppm/ ml
Tiến hành phân tích với thời gian sắc ký gấp
đôi thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ
thu được từ dung dịch thử X{c định tạp chất
liên quan dựa trên tổng tạp, loại những pic có
chiều cao nhỏ hơn ba lần độ nhiễu đường nền và các pic có trong mẫu trắng
Yêu cầu
Tổng h|m lượng tạp chất có trong mẫu tính theo phần trăm diện tích pic nhỏ hơn 2%
Định lượng chất chuẩn afzelin
Định lượng afzelin theo phương ph{p quy về 100% diện tích pic
Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn của ICH (The International Conference on Harmonisation of Technical Requirement for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), bao gồm các chỉ tiêu: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại.
Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng nhất lô trong quá trình đóng gói
Afzelin được đóng th|nh 100 lọ nhỏ (10 mg/lọ), sử dụng lọ thủy tinh nâu và hàn kín có lớp đệm Đóng lọ trong Glove-Box, nạp khí nitơ 99,99%, độ ẩm trong buồng xấp xỉ 10%
Lấy ngẫu nhiên 11 lọ (g = +1) để đ{nh gi{ đồng nhất lô trong qu{ trình đóng gói, mỗi
lọ kiểm tra 2 lần Đ{nh gi{ kết quả theo ISO Guide 35
Đ{nh gi{ chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm
Afzelin sau khi được đóng gói v| đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu được lấy ngẫu nhiên và tiến h|nh định lượng tại hai phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP, trong đó có ít nhất một phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền v| có ý nghĩa ph{p
lý đối với Việt Nam Mỗi phòng thí nghiệm định lượng 6 lọ Tính thống kê kết quả từ 2 phòng thí nghiệm theo Anova (n = 12) Nếu Ftn ≤ Ftc, kết quả trung bình của 2 phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa, phương ph{p ph}n tích có độ lặp cao, h|m lượng chất chuẩn không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đ{nh giá
Hai phòng thí nghiệm đạt GLP tham gia thẩm định chất chuẩn afzelin:
Trang 4Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu,
Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM(PTN1)
Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Viện Kiểm
nghiệm thuốc TP HCM (PTN2)
X{c định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo v| gi{
trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm
Tiến h|nh x{c định giá trị công bố trên phiếu
kiểm nghiệm khi kết quả đ{nh gi{ liên phòng thí
nghiệm đạt yêu cầu (Ftn≤ Ftc) Gía trị ấn định x*(n)
để đ{nh gi{ từng kết quả phân tích theo test-z,
loại bỏ các kết quả tính có ; chọn các giá
trị , tính giá trị trung bình
KẾT QUẢ
Phân lập afzelin
Xử lý mẫu bằng SPE
Mẫu: 200 mg bột dược liệu Xử lý mẫu và
khai triển cột SPE theo quy trình Thu phân
đoạn methanol 50% Kiểm tra sự có mặt
afzelin trong c{c ph}n đoạn n|y được phân
tích bằng HPLC-MS Kết quả: X{c định mẫu
dược liệu l{ Bơ, Tầm gửi, Đạm trúc diệp, Cần
nước, Sầu đ}u có chứa afzelin
Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin
Từ tiêu chí chọn dược liệu, chọn l{ Bơ l|m
nguyên liệu phân lập afzelin
Chiết xuất
Từ 15 kg l{ Bơ khô, chiết ngấm kiệt được 1,2
kg cao cồn 70% Từ 1,2 kg cao cồn 70% phân tán
v|o nước, tiến hành lắc phân bố lần lượt với
ether dầu hỏa (60-90 oC) và ethyl acetat Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi được 200 g cao EA
Phân lập bằng sắc ký cột
Sắc ký cột silica gel: Từ 80 g cao EA, tiến hành
sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat, tăng dần tỷ lệ ethyl acetat với c{c ph}n đoạn Thu được 4 ph}n đoạn, trong đó
có ph}n đoạn 2 tương ứng với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat (25 : 75) có 3 vết chính trên SKLM Cô thu hồi dung môi phân đoạn 2 được 5,3 g cao PĐ 2
Phân lập bằng PLC điều chế
Tiến hành phân lập các chất trong PĐ 2 bằng HPLC điều chế Thu lấy chất tương ứng với đỉnh
ở thời gian lưu l| 32 phút Cô thu hồi dung môi được hợp chất tương ứng là PA
Tiến h|nh điều chế với 5 g PĐ 2 Thu được 1,2 g hợp chất PA
Hợp chất PA cho một pic tại thời gian lưu tR
= 18,5 phút trên sắc ký đồ ở bước sóng 265 nm
Và trên sắc ký đồ 3D, hợp chất PA gần như không xuất hiện các pic khác ở c{c bước sóng khác
X{c định cấu trúc của PA
Tiến h|nh đo phổ UV, MS, IR và NMR, dựa v|o c{c phương ph{p phổ nghiệm x{c định được
PA là afzelin
Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất PA bằng HPLC phân tích
Trang 5
Phổ IR
Hình 2: Phổ IR của hợp chất PA
Hình 3: Phổ UV của hợp chất PA
Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở Hình 2
Phổ UV – Vis của hợp chất PA có đỉnh hấp thu đặc trƣng ở 265 nm và 345 nm (Hình 3) Phổ IR (KBr) của hợp chất PA có νmax: 1656; 1608; 1500; 1452; 1364; 1296; 1176; 1061; 833 cm-1 Phù hợp với phổ của afzelin
Phổ MS
Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở Hình 4
Phổ ESI/MS của hợp chất PA cho pic ion m/ z
= 455 [M + Na]+ Phù hợp với công thức phân tử
C21H20O10, Δ = 12
Phổ NMR
Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của PA điều chế hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ 13 C-NMR và 1H-NMR của afzelin theo tài liệu tham khảo (TLTK)số 1 (Bảng 1)
Trang 6Hình 4: Phổ HR-MS của hợp chất PA
Bảng 1: So sánh phổ NMR của PA với phổ NMR của afzelin theo TLTK (1)
Trang 7Hình 5: Công thức cấu tạo của afzelin
Sự trùng khớp phổ NMR và các dữ liệu phổ
UV, IR, MS xác nhận hợp chất PA phân lập được
là afzelin (Hình 5)
Tạp chất liên quan
H|m lượng tạp có trong afzelin điều
chế tính theo phần trăm diện tích pic là
0,9% < 2%
Định lượng afzelin điều chế bằng phương
pháp HPLC
Tiến h|nh định lượng theo quy trình đã
xây dựng và thẩm định như trên mục
Phương ph{p nghiên cứu Kết quả thẩm
định phương ph{p v| kết quả định lượng
được tóm tắt trong Bảng 2
Bảng 2: Bảng kết quả thẩm định quy trình
định lượng
Tính tương thích hệ thống RSD(tR ) = 0,468% < 2%
RSD(S) = 1,85% < 2%
Tính tuyến tính ŷ = 136941x – 581330
Kết quả: H|m lượng trung bình của afzelin
là 94,31 % (n = 6) tính trên khan
Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng nhất lô trong quá
trình đóng gói
Theo hướng dẫn ISO Guide 35, tiến hành
ph}n tích phương sai một yếu tố theo ANOVA,
ta có:
n
S r
= 0,018 < µbb = 0,056
Kết luận: Các lọ afzelin đồng nhất trong quá
trình đóng gói
Bảng 3: Kết quả định lượng afzelin đ{nh gi{ đồng
nhất lô
Đ{nh gi{ chất chuẩn afzelin điều chế thông qua liên phòng thí nghiệm
Bảng 4: Kết quả định lượng (%) afzelin tại hai phòng
thí nghiệm
PTN1 99,02 99,00 98,93 98,94 99,11 99,13 99,02 PTN2 99,17 99,09 99,14 99,22 99,02 99,08 99,12 Tiến h|nh ph}n tích phương sai một yếu tố theo ANOVA ta có F = 4,7961 < F0,05 = 4,9646
Kết luận: Kết quả trung bình của hai phòng
thí nghiệm kh{c nhau không có ý nghĩa, phương ph{p ph}n tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết afzelin phân lập không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đ{nh gi{
Xác định giá trị ấn định
Sau 2 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,101) khi đó gi{ trị x* mới được chọn là 99,072%
Loại các kết quả có z – score > 2, tính trung bình các kết quả còn lại, thu được kết quả như sau: Độ tinh khiết trung bình: 99,072% (n = 12),
độ lệch s: 0,089, độ không đảm bảo đo µ: 0,036
Kết luận: Hợp chất afzelin phân lập đạt đầy
đủ yêu cầu của chuẩn gốc với h|m lượng được x{c định là 99,07% (n = 12, s = 0,089, µ = 0,036) Tương ứng với 94,31% tính theo nguyên trạng
Trang 8Bảng 5: Kết quả tính giá trị ấn định h|m lượng (%)
afzelin
BÀN LUẬN
Do không có chuẩn afzelin để đối chiếu
nên các hợp chất điều chế được tiến hành kiểm
tra độ tinh khiết và sử dụng các phương pháp
phổ nghiệm để biện giải cấu trúc Từ đó, xác
định trong các hợp chất điều chế được, hợp
chất nào là afzelin
Mặc khác, các dự liệu phổ của các hợp chất
điều chế được sẽ được sử dụng làm phổ dữ liệu
chuẩn sau này
Việc đánh giá đồng nhất lọ bao gồm đánh
giá đồng nhất trong cùng 1 lọ và đánh giá
đồng nhất giữa các lọ trong cùng 1 lô Tuy
nhiên, các chất điều chế được đóng thành các
lọ với khối lượng nhỏ 10 mg để dùng một lần
nên không cần đánh giá đồng nhất trong cùng
1 lọ
Có hai phương pháp đánh giá đồng nhất
giữa các lọ trong cùng 1 lô là ANOVA và ISO
Guide 35 Tuy nhiên, phương pháp sử dụng
trong ISO Guide 35 đã bao gồm phép đánh giá
ANOVA một yếu tố nên quy trình đánh giá sẽ chặt chẽ hơn Do đó, nghiên cứu này chọn cách đánh giá đồng nhất giữa các lọ trong cùng 1 lô theo ISO Guide 35
KẾT LUẬN
Bằng phương ph{p HPLC-MS, nghiên cứu
đã khảo s{t được một số dược liệu có chứa afzelin như l{ Bơ, Cần nước, Sầu đ}u, Tầm gửi, Đạm trúc diệp Những dược liệu này có thể được dùng làm nguyên liệu phân lập afzelin Lá
Bơ được chọn làm nguyên liệu phân lập afzelin trong nghiên cứu n|y 1,2 g afzelin đã được phân lập từ 15 kg l{ Bơ khô Quy trình phân lập hiệu quả Tiến hành thiết lập chất chuẩn afzelin theo hướng dẫn của ISO Guide 35 Kết quả cho thấy: Chất chuẩn afzelin điều chế đạt yêu cầu chất chuẩn gốc với h|m lượng được x{c định là 94,31% tính trên nguyên trạng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
manshuriensis”, Natural Product Sciences, 15(4), 234-240
2 ISO 13528:2005, Statistical methods for use in proficiency testing byinterlaboratory comparisons, 2005
referencematerial producers, 2009
4 ISO Guide 35:2006, Reference materials - General and statistical principlesfor certification, 2006
Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018