Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như đạm trúc diệp, tầm gửi, rau cần. Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho các dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin. Tuy nhiên, chuẩn afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN AFZELIN TỪ DƢỢC LIỆU Võ Thanh Hóa*, Nguyễn Minh Đức** TĨM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Afzelin flavonoid có nhiều dược liệu Đạm trúc diệp, Tầm gửi, Rau cần< Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho c{c dược liệu cần phải có chuẩn afzelin Tuy nhiên, chuẩn afzelin chưa có sẵn Việt Nam mà phải nhập từ nước với giá cao thời gian đặt hàng kéo dài Vì vậy, mục đích nghiên cứu chiết xuất, phân lập thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu Phương ph{p nghiên cứu: Sàng lọc dược liệu có chứa afzelin HPLC-MS Lựa chọn dược liệu Chiết cao chiết toàn phần tách c{c ph}n đoạn đơn giản chiết phân bố giữ nước v| c{c dung mơi có độ phân cực khác Phân lập afzelin sắc ký cột cổ điển sắc ký cột pha đảo Cấu trúc afzelin phân lập x{c định phổ UV, IR, MS NMR Thẩm định thiết lập chất chuẩn afzelin Kết quả: Nghiên cứu s|ng lọc c{c dược liệu có chứa afzelin: Cần nước, Tầm gửi, Đạm túc diệp, Bơ v| Sầu đ}u Lựa chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin Từ 15 kg l{ Bơ khô ph}n lập 1,2 g afzelin từ l{ Bơ Folia Perseae v| tiến h|nh đóng 100 lọ (10 mg/ lọ) với số lơ AFZ-001-0914 với độ tinh khiết 94,31% tính theo nguyên trạng Thết lập afzelin đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc theo ISO Guide 35 Kết luận: Quy trình khảo sát sàng lọc dược liệu phân lập afzelin đơn giản, hiệu Afzelin phân lập thiết lập thành chất chuẩn theo tiêu chí chuẩn gốc Có thể sẵn s|ng để ứng dụng vào cơng tác nghiệm dược liệu Từ khóa: Folia Perseae, afzelin, thiết lập chất chuẩn ABSTRACT ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD AFZELIN FROM HERBAL MEDICINES Vo Thanh Hoa, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 307 - 314 Introduction - objectives: Afzelin is used as a marker for the quality control of some herbal medicine However, afzelin standard has not been available in Vietnam and it took a high cost and long time for ordering from foreign countries So the aim of this study was to develop a protocol to isolate and establish afzelin as reference standard Methods: Herbal medicines containing afzelin were selected by sreening on HPLC-MS method Ethanolic extract of herbal medicine was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds Isolations were carried out by common and popular phytochemical methods Structures of isolated compounds were deduced by means of UV, IR, MS and NMR spectroscopy Quantitative analysis was validated and isolated afzelin was established as reference standard Results: Five herbal medicines containing afzelin were invesgated such as Mistletoe (Loranthus chinensis), Avocado (Persea americana) leaves, Water dropwort (Oenanthe stolinefera), China tree (Azadirachta indica) and * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y DƣợcThành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Võ Thanh Hóa ĐT: 0986414064 Chuyên Đề Dƣợc ** Khoa Dƣợc, Đại học Tôn Đức Thắng Email: hoavo0808@ump.edu.vn 307 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Cow grass (Lophatherum gracile) Avocado leaves were selected to isolate afzelin 1,2 g of afzelin was isolated from avocado leaves and packed into 100 vials (10 mg/ vial) with batch number: AFZ-001-0914 and a content of 94,31% Isolated afzelin was established as reference standard based on ISO Guide 35 Conclusions: The methods of invesgation and isolation were simple, effective Isolated afzelin was established as primary standard It could be used for controlling the quality of some herbal medicines Keywords: Folia Perseae, afzelin, establishment of reference standard ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, Việt Nam sử dụng nhiều dƣợc liệu để bảo vệ, chăm sóc sức khỏe ngƣời dân Tuy nhiên, nhiều số c{c dƣợc liệu nhƣ Tang ký sinh, Đạm trúc diệp chƣa có có tiêu chuẩn nhƣng chƣa có tiêu chuẩn hàm lƣợng Điều n|y g}y khó khăn cho cơng t{c đảm bào chất lƣợng dƣợc liệu Vì vậy, điều cần thiết phải xây dựng tiêu chuẩn đầy đủ cho c{c dƣợc liệu Tuy nhiên, chất điểm có c{c dƣợc liệu n|y nhƣ afzelin lại khơng có thị trƣờng Việt Nam, mua từ nƣớc lại thời gian giá thành cao, Do đó, đề t|i đƣợc thực nhằm phân lập thiết lập chất chuẩn gốc afzelin theo hƣớng dẫn ISO Guide 35 để phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu Điều kiện khai triển: Cột: Agilent C18, 250 x 4,6 mm, µm; Nhiệt độ cột: 30 oC; Đầu dò: UV 265 nm; MS 6120, kỹ thuật ESI, bắn phá ion âm, dạng ion phân tử thu đƣợc [M-H]-; Thể tích tiêm mẫu: 20 µl; Pha động:Acetonitril (A) – Nƣớc (B), rửa giải gradient; Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút; Thời gian phân tích: 20 phút; Ghi nhận ion phân tử chất khoảng: 300 – 500 m/ z So sánh phổ MS chất ghi nhận đƣợc với phổ MS chuẩn afzelin thƣ viện phổ Xác định mẫu dƣợc liệu có chứa afzelin Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Tiêu chí chọn dƣợc liệu: Dƣợc liệu có chứa afzelin; nguồn cung cấp dƣợc liệu dồi dào; dễ thu hái xử lý mẫu; ngồi afzelin, chứa polyphenol khác Phân lập afzelin ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU Chiết xuất Đối tƣợng nghiên cứu Dƣợc liệu đƣợc chọn đƣợc chiết phƣơng ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 70%, dịch chiết đƣợc cô thu hồi dung môi thu đƣợc cao cồn 70% Dƣợc liệu Đạm trúc diệp đƣợc cung cấp nhà thuốc T}n Nam Xƣơng, Quận 8, TP HCM; Bơ v| Tầm gửi thu hái Bn Hồ, Đắk Lắk; Cần nƣớc thu hái Hc Môn, TP HCM; Sầu đ}u thu h{i Rạch giá, Kiên Giang Phƣơng ph{p nghiên cứu Khảo s{t dược liệu chứa afzelin Cao cồn đƣợc ph}n t{n v|o nƣớc, tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (60-90 oC) v| ethyl acetat Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi đƣợc cao EA Xử lý mẫu SPE Phân lập sắc ký cột Bột dƣợc liệu (1 g) đƣợc chiết siêu âm 30 phút với 30 ml MeOH (2 lần) Lọc dịch chiết, đến cắn Hòa cắn với ml nƣớc cất x lần Tiến hành nạp mẫu khai triển cột SPE (C18E 500 mg, ml, 55 µm (Phenomenex) với vệ dung môi methanol – nƣớc, tỷ lệ methanol tăng dần Kiểm tra ph}n đoạn HPLC-MS để phát có mặt afzelin C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập chất phƣơng ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung mơi khảo sát phƣơng ph{p sắc ký lớp mỏng (SKLM) Tiến hành khai triển sắc ký cột v| theo dõi c{c ph}n đoạn SKLM Dựa vào kết SKLM để gom ph}n đoạn 308 Sắc ký HPLC điều chế Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Hệ thống sắc ký Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật) Ct: Discovery HS C18 (250 ì 21,2 mm, 10 àm) Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng Tốc độ dòng: 10 ml/phút Thể tích bơm: 10 ml Phát hiện: UV 265 nm Pha động: methanol – nƣớc (45 : 55) Dung môi pha mẫu: Pha động Nồng độ mẫu: 60 mg/ml Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập HPLC Điều kiện phân tích: Cột: C18, 250 x 4,6 mm, µm Pha động: acetonitril (A) – nƣớc (B), rửa giải gradient: phút 25% A, 30 phút 30% A, 31 – 35 phút: 25% A Tốc độ dòng: 0,75 ml/ phút Đầu dò: PDA Bƣớc sóng phát hiện: 265 nm Thời gian phân tích: 25 phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µl X{c định cấu trúc hợp chất phân lập Tiến h|nh x{c định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm UV, MS, IR NMR Thiết lập chất chuẩn afzelin theo ISO Guide(2-4) Độ ẩm Đo phƣơng (Thermogravimetric Analysis) ph{p TGA Định tính v| x{c định cấu trúc X{c định cấu trúc c{c phƣơng ph{p phổ UV - Vis, IR, NMR MS Tạp chất liên quan Tiến hành kiểm tra HPLC với quy trình thẩm định Điều kiện sắc ký: Cột: Phenomenex C18 (250x4,6 mm,5 µm); Pha động: acetonitril – nƣớc (30:70); Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; Detector: UV 265 nm; Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; Thể tích bơm: 10 µl; Dung mơi pha mẫu: Pha động; Nồng độ mẫu: 300 ppm/ ml Tiến hành phân tích với thời gian sắc ký gấp đơi thời gian lƣu pic sắc ký đồ thu đƣợc từ dung dịch thử X{c định tạp chất liên quan dựa tổng tạp, loại pic có Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học chiều cao nhỏ ba lần độ nhiễu đƣờng pic có mẫu trắng Yêu cầu Tổng h|m lƣợng tạp chất có mẫu tính theo phần trăm diện tích pic nhỏ 2% Định lượng chất chuẩn afzelin Định lƣợng afzelin theo phƣơng ph{p quy 100% diện tích pic Thẩm định quy trình định lƣợng theo hƣớng dẫn ICH (The International Conference on Harmonisation of Technical Requirement for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), bao gồm tiêu: Tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng lơ q trình đóng gói Afzelin đƣợc đóng th|nh 100 lọ nhỏ (10 mg/lọ), sử dụng lọ thủy tinh nâu hàn kín có lớp đệm Đóng lọ Glove-Box, nạp khí nitơ 99,99%, độ ẩm buồng xấp xỉ 10% Lấy ngẫu nhiên 11 lọ (g = +1) để đ{nh gi{ đồng lô qu{ trình đóng gói, lọ kiểm tra lần Đ{nh gi{ kết theo ISO Guide 35 Đ{nh gi{ chất chuẩn thơng qua liên phòng thí nghiệm Afzelin sau đƣợc đóng gói v| đánh giá đồng lơ đạt yêu cầu đƣợc lấy ngẫu nhiên tiến h|nh định lƣợng hai phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP, có phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền v| có ý nghĩa ph{p lý Việt Nam Mỗi phòng thí nghiệm định lƣợng lọ Tính thống kê kết từ phòng thí nghiệm theo Anova (n = 12) Nếu Ftn ≤ Ftc, kết trung bình phòng thí nghiệm khác khơng có ý nghĩa, phƣơng ph{p ph}n tích có độ lặp cao, h|m lƣợng chất chuẩn khơng phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đ{nh giá Hai phòng thí nghiệm đạt GLP tham gia thẩm định chất chuẩn afzelin: 309 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu, Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM(PTN1) Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM (PTN2) X{c định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo v| gi{ trị công bố phiếu kiểm nghiệm Tiến h|nh x{c định giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm kết đ{nh gi{ liên phòng thí nghiệm đạt yêu cầu (Ftn≤ Ftc) Gía trị ấn định x*(n) để đ{nh gi{ kết phân tích theo test-z, loại bỏ kết tính có ; chọn giá trị , tính giá trị trung bình KẾT QUẢ Phân lập afzelin Xử lý mẫu SPE Mẫu: 200 mg bột dƣợc liệu Xử lý mẫu khai triển cột SPE theo quy trình Thu phân đoạn methanol 50% Kiểm tra có mặt afzelin c{c ph}n đoạn n|y đƣợc phân tích HPLC-MS Kết quả: X{c định mẫu dƣợc liệu l{ Bơ, Tầm gửi, Đạm trúc diệp, Cần nƣớc, Sầu đ}u có chứa afzelin Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Từ tiêu chí chọn dƣợc liệu, chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin Chiết xuất Từ 15 kg l{ Bơ khô, chiết ngấm kiệt đƣợc 1,2 kg cao cồn 70% Từ 1,2 kg cao cồn 70% phân tán v|o nƣớc, tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (60-90 oC) ethyl acetat Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi đƣợc 200 g cao EA Phân lập sắc ký cột Sắc ký cột silica gel: Từ 80 g cao EA, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat, tăng dần tỷ lệ ethyl acetat với c{c ph}n đoạn Thu đƣợc ph}n đoạn, có ph}n đoạn tƣơng ứng với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat (25 : 75) có vết SKLM Cơ thu hồi dung mơi phân đoạn đƣợc 5,3 g cao PĐ Phân lập PLC điều chế Tiến hành phân lập chất PĐ HPLC điều chế Thu lấy chất tƣơng ứng với đỉnh thời gian lƣu l| 32 phút Cô thu hồi dung môi đƣợc hợp chất tƣơng ứng PA Tiến h|nh điều chế với g PĐ Thu đƣợc 1,2 g hợp chất PA Hợp chất PA cho pic thời gian lƣu tR = 18,5 phút sắc ký đồ bƣớc sóng 265 nm Và sắc ký đồ 3D, hợp chất PA gần nhƣ không xuất pic khác c{c bƣớc sóng khác X{c định cấu trúc PA Tiến h|nh đo phổ UV, MS, IR NMR, dựa v|o c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm x{c định đƣợc PA afzelin Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất PA HPLC phân tích Hình 1: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết hợp chất PA 310 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Phổ IR Hình 2: Phổ IR hợp chất PA Phổ IR hợp chất PA đƣợc trình bày Hình Phổ UV – Vis hợp chất PA có đỉnh hấp thu đặc trƣng 265 nm 345 nm (Hình 3) Phổ IR (KBr) hợp chất PA có νmax: 1656; 1608; 1500; 1452; 1364; 1296; 1176; 1061; 833 cm-1 Phù hợp với phổ afzelin Phổ MS Phổ IR hợp chất PA đƣợc trình bày Hình Phổ ESI/MS hợp chất PA cho pic ion m/ z = 455 [M + Na]+ Phù hợp với công thức phân tử C21H20O10, Δ = 12 Phổ NMR Hình 3: Phổ UV hợp chất PA Chuyên Đề Dƣợc Dữ liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR PA điều chế hoàn toàn phù hợp với liệu phổ 13CNMR 1H-NMR afzelin theo tài liệu tham khảo (TLTK) số (Bảng 1) 311 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Hình 4: Phổ HR-MS hợp chất PA Bảng 1: So sánh phổ NMR PA với phổ NMR afzelin theo TLTK(1) Hợp chất PA (500 MHz, δ = ppm CD3OD) 10 1ʹ 2ʹ 3ʹ 4ʹ 5ʹ 6ʹ 1ʹʹ 2ʹʹ 3ʹʹ 4ʹʹ 5ʹʹ 6ʹʹ 312 C, ppm 158,5 136,2 179,6 163,2 99,8 165,9 94,8 158,5 105,9 122,6 131,9 116,5 161,6 116,5 131,9 103,5 71,9 72,0 73,2 72,1 17,7 H, ppm 6,20 (1H,d, J = 1,5 Hz) 6,37 (1H, d, J= 1,5 Hz) 7,76 (1H, d, J = 9,0 Hz) 6,93 (1H, d, J = 9,0 Hz) 6,93 (1H, d, J = 9,0 Hz) 7,76 (1H, d, J = 9,0 Hz) 5,37 (1H, d, J = 1,5 Hz) 0,92 (3H, d, J = 6,0 Hz) Afzelin (500 MHz, δ = ppm, DMSO) C, ppm 158,0 134,9 178,4 161,9 99,4 164,1 94,3 157,2 104,7 121,7 131,3 116,3 160,6 116,3 131,3 102,5 70,8 71,0 71,8 71,3 18,2 H, ppm 6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz) 6,50 (1H, d, J = 2,0 Hz) 7,76 (1H, d, J = 7,3 Hz) 6,92 (1H, d, J = 7,3 Hz) 6,92 (1H, d, J = 7,3 Hz) 7,76 (1H, d, J = 7,3 Hz) 5,29 (1H, brs) 0,80 (3H, d, J = 6,0 Hz) Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Sr n Nghiên cứu Y học = 0,018 < µbb = 0,056 Kết luận: Các lọ afzelin đồng q trình đóng gói Bảng 3: Kết định lượng afzelin đ{nh gi{ đồng lơ Hình 5: Cơng thức cấu tạo afzelin Sự trùng khớp phổ NMR liệu phổ UV, IR, MS xác nhận hợp chất PA phân lập đƣợc afzelin (Hình 5) STT 10 Lần (%) 99,09 99,11 98,93 99,13 99,00 99,12 98,94 98,92 99,11 99,08 Lần (%) 99,13 99,09 99,01 98,99 99,10 98,99 99,02 98,90 99,09 99,11 Tạp chất liên quan Đ{nh gi{ chất chuẩn afzelin điều chế thơng qua liên phòng thí nghiệm H|m lƣợng tạp có afzelin điều chế tính theo phần trăm diện tích pic 0,9% < 2% Bảng 4: Kết định lượng (%) afzelin hai phòng thí nghiệm Định lƣợng afzelin điều chế phƣơng pháp HPLC Tiến h|nh định lƣợng theo quy trình xây dựng thẩm định nhƣ mục Phƣơng ph{p nghiên cứu Kết thẩm định phƣơng ph{p v| kết định lƣợng đƣợc tóm tắt Bảng Bảng 2: Bảng kết thẩm định quy trình định lượng Chỉ tiêu Thơng số - Giá trị Tính tương thích hệ thống RSD(tR) = 0,468% < 2% RSD(S) = 1,85% < 2% Tính đặc hiệu Đạt Tính tuyến tính ŷ = 136941x – 581330 Độ lặp lại RSD = 0,071% 2, tính trung bình kết lại, thu đƣợc kết nhƣ sau: Độ tinh khiết trung bình: 99,072% (n = 12), độ lệch s: 0,089, độ khơng đảm bảo đo µ: 0,036 Kết luận: Hợp chất afzelin phân lập đạt đầy đủ yêu cầu chuẩn gốc với h|m lƣợng đƣợc x{c định 99,07% (n = 12, s = 0,089, µ = 0,036) Tƣơng ứng với 94,31% tính theo nguyên trạng 313 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Bảng 5: Kết tính giá trị ấn định h|m lượng (%) afzelin δ = 1,5 x s* x* - δ x* + δ Trung bình Độ lệch s x* s* x*(0) 99,071 0,090 99,085 0,096 x*(1) 0,145 98,94 99,23 99,072 0,089 99,072 0,101 x*(2) 0,151 98,921 99,223 99,072 0,089 99,072 0,101 BÀN LUẬN Do khơng có chuẩn afzelin để đối chiếu nên hợp chất điều chế tiến hành kiểm tra độ tinh khiết sử dụng phương pháp phổ nghiệm để biện giải cấu trúc Từ đó, xác định hợp chất điều chế được, hợp chất afzelin Mặc khác, dự liệu phổ hợp chất điều chế sử dụng làm phổ liệu chuẩn sau Việc đánh giá đồng lọ bao gồm đánh giá đồng lọ đánh giá đồng lọ lô Tuy nhiên, chất điều chế đóng thành lọ với khối lượng nhỏ 10 mg để dùng lần nên không cần đánh giá đồng lọ Có hai phương pháp đánh giá đồng lọ lô ANOVA ISO Guide 35 Tuy nhiên, phương pháp sử dụng ISO Guide 35 bao gồm phép đánh giá 314 ANOVA yếu tố nên quy trình đánh giá chặt chẽ Do đó, nghiên cứu chọn cách đánh giá đồng lọ lô theo ISO Guide 35 KẾT LUẬN Bằng phƣơng ph{p HPLC-MS, nghiên cứu khảo s{t đƣợc số dƣợc liệu có chứa afzelin nhƣ l{ Bơ, Cần nƣớc, Sầu đ}u, Tầm gửi, Đạm trúc diệp Những dƣợc liệu đƣợc dùng làm nguyên liệu phân lập afzelin Lá Bơ đƣợc chọn làm nguyên liệu phân lập afzelin nghiên cứu n|y 1,2 g afzelin đƣợc phân lập từ 15 kg l{ Bơ khơ Quy trình phân lập hiệu Tiến hành thiết lập chất chuẩn afzelin theo hƣớng dẫn ISO Guide 35 Kết cho thấy: Chất chuẩn afzelin điều chế đạt yêu cầu chất chuẩn gốc với h|m lƣợng đƣợc x{c định 94,31% tính nguyên trạng TÀI LIỆU THAM KHẢO Chang SW et al (2009), “Phytochemical constituents of Bistorta manshuriensis”, Natural Product Sciences, 15(4), 234-240 ISO 13528:2005, Statistical methods for use in proficiency testing byinterlaboratory comparisons, 2005 ISO Guide 34:2009, General requirements for the competence of referencematerial producers, 2009 ISO Guide 35:2006, Reference materials - General and statistical principlesfor certification, 2006 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... g afzelin đƣợc phân lập từ 15 kg l{ Bơ khơ Quy trình phân lập hiệu Tiến hành thiết lập chất chuẩn afzelin theo hƣớng dẫn ISO Guide 35 Kết cho thấy: Chất chuẩn afzelin điều chế đạt yêu cầu chất. .. afzelin Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Từ tiêu chí chọn dƣợc liệu, chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin Chiết xuất Từ 15 kg l{ Bơ khô, chiết ngấm kiệt đƣợc 1,2 kg cao cồn 70% Từ 1,2 kg cao... sánh phổ MS chất ghi nhận đƣợc với phổ MS chuẩn afzelin thƣ viện phổ Xác định mẫu dƣợc liệu có chứa afzelin Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Tiêu chí chọn dƣợc liệu: Dƣợc liệu có chứa afzelin;