Nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn nystose từ dược liệu rễ ba kích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỨA THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE TỪ DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỨA THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE TỪ DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn ThS NCS Phạm Văn Kiền HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: - PGS TS Đoàn Cao Sơn, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế - ThS NCS Phạm Văn Kiền, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế Những người thầy tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp suốt q trình thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo sau đại học, mơn Hóa phân tích thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ trình học tập trường, trình hồn thiện luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS Trần Thị Thu Trang, DS Bạch Thị Thắm anh chị em, bạn bè đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn - Chất chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi tiến hành thực nghiệm q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, chia sẻ khích lệ tơi suốt q trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Học viên Hứa Thị Thu Huyền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu Ba kích (Morinda officinalis How., Rubiaceae) 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Mô tả 1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.4 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan nystose 1.2.1 Đặc điểm tính chất 1.2.2 Tác dụng dược lý 1.3 Phương pháp tinh chế chất từ dược liệu nhận dạng hợp chất sau tinh chế 1.3.1 Phương pháp tinh chế chất từ dược liệu 1.3.2 Nhận dạng hợp chất sau tinh chế 1.4 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.4.1 Nguyên tắc 1.4.2 Một số đại lượng đặc trưng trình sắc ký 1.4.3 Detector tán xạ bay (ELSD) 1.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 10 1.5.1 Nguyên tắc 10 1.5.2 Ứng dụng 11 1.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12 1.6.1 Nguyên tắc 12 1.6.2 Các đại lượng đặc trưng 12 1.6.3 Ứng dụng 13 1.7 Phương pháp sắc ký cột 13 1.7.1 Cột 13 1.7.2 Hóa chất dùng làm cột 13 1.7.3 Dung môi 13 1.7.4 Ứng dụng: 14 1.8 Tổng quan chất chuẩn 14 1.9 Tình hình thiết lập chất chuẩn giới Việt Nam 16 1.9.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn giới 16 1.9.2 Tình hình thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích 16 1.10 Phương pháp thiết lập chất chuẩn 17 1.10.1 Thiết lập, bảo quản chất chuẩn theo hướng dẫn WHO ASEAN 17 1.10.2 Yêu cầu nội dung quy trình phân tích theo quy định Asean 18 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương tiện nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 20 2.2.2 Trang thiết bị 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Lựa chọn phương pháp: 22 2.3.2 Kiểm tra phương pháp 24 2.3.3 Kiểm tra nguyên liệu nystose trước tinh chế 25 2.3.4 Quy trình tinh chế nystose 25 2.3.5 Xác định cấu trúc, nhận dạng nguyên liệu nystose sau tinh chế 27 2.3.6 Thiết lập chất chuẩn nystose 27 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Tinh chế nguyên liệu nystose 33 3.1.1 Kiểm tra sơ nguyên liệu nystose trước tinh chế 33 3.1.2 Quy trình tinh chế nystose 33 3.1.4 Xác định cấu trúc, nhận dạng hợp chất sau tinh chế 38 3.1.4.1 Phổ NMR 38 3.1.4.2 Phổ MS 40 3.1.4.3 Đo phổ IR 41 3.1.4.4 Đo điểm chảy 42 3.2 Thẩm định lại phương pháp HPLC định tính, định lượng 42 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống sắc ký 42 3.1.2 Tính đặc hiệu 43 3.1.3 Độ tuyến tính 44 3.1.4 Độ 45 3.1.5 Độ lặp lại 46 3.1.6 Độ xác 47 3.1.7 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 48 3.6 Thiết lập chất chuẩn nystose 48 3.6.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo quy trình thiết lập chất chuẩn nystose 49 3.6.2 Đóng lọ chất chuẩn nystose 51 3.6.3 Đánh giá đồng q trình đóng gói 52 3.6.4 Đánh giá liên phòng 53 3.6.5 Xử lý kết phân tích theo phương pháp thống kê 55 3.7 Xác định hàm lượng nystose số dược liệu Ba kích Việt Nam 56 3.7.1 Điều kiện sắc ký 56 3.7.2 Chuẩn bị dung dịch thử dung dịch chuẩn 57 3.7.3 Tiến hành 57 3.7.4 Kết đạt 58 Chương BÀN LUẬN 61 4.1 Về kết quả, phương pháp đề tài 61 4.1.1 Về tinh chế nystose 61 4.1.2 Về xác minh cấu trúc nystose tinh chế 61 4.1.3 Về thiết lập chất chuẩn, xây dựng TCCL 61 4.1.4 Về định tính, định lượng nystose dược liệu Ba kích phương pháp HPLC với detector ELSD 62 4.2 Về ý nghĩa thực tiễn đề tài 62 4.2.1 Về tính 62 4.2.2 Về hiệu kinh tế, xã hội 62 4.2.3 Về ý nghĩa thực tiễn 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 Kết luận 64 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT C-NMR : Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng carbon H-NMR : Hydrogen - Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng proton 13 ARS DĐVN : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN : Dược điển Việt Nam ELSD EPRS : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay : EP Reference Standards - Chất chuẩn dược điển Châu Âu FHH : Diễn đàn hòa hợp thuốc thảo dược nước Tây Thái Bình Dương GC GC-MS : Gas Chromatoghraphy - Sắc ký khí : Gas Chromatoghraphy - Mass spectrometry - Sắc ký khí khối phổ HPLC : High Performance Liquid Chromatoghraphy-Sắc ký lỏng hiệu cao HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatograhpy - Sắc ký lớp mỏng ICRS KNV LC-MS hiệu cao : Chất chuẩn dược điển Quốc tế : Kiểm nghiệm viên : Liquid Chromatography - Mass spectrometry - Sắc ký lỏng khối phổ MS MP NMR TCCL TGA : Mass spectrometry - Phổ khối : Mobiphase – Pha động : Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân : Tiêu chuẩn chất lượng : Thermal Gravimetric Analysis - Phân tích nhiệt trọng lượng USPRS UV-VIS VKNTTW VKNT TP.HCM WHO : USP Reference Standards - Chất chuẩn dược điển Mỹ : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến : Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương : Viên kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh : World health organization - Tổ chức Y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Phân loại Ba kích Việt Nam .Error! Bookmark not defined Bảng Một số chất dược liệu Ba kích Bảng Một số chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích 16 Bảng Một số dược liệu Ba kích thu hái Việt Nam 20 Bảng 2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 Bảng Danh mục thiết bị thực đề tài 21 Bảng Các tiêu kiểm tra phương pháp 24 Bảng Hướng dẫn loại bỏ giá trị thô 29 Bảng Độ thích hợp hệ thống sắc ký 42 Bảng Kết khảo sát độ tuyến tính 44 Bảng 3 Kết khảo sát độ 46 Bảng Kết đánh giá độ lặp lại 46 Bảng Kết xác định độ xác 47 Bảng Kết xác định giới hạn phát 48 Bảng Kết định lượng nystose nguyên liệu trước tinh chế 33 Bảng Kết khối lượng làm khô 33 Bảng Kết định lượng nystose sau tinh chế 38 Bảng 10 Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) 38 Bảng 11 Phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) 39 Bảng 12 Kết đo điểm chảy nguyên liệu nystose sau tinh chế 42 Bảng 13 Kết đo điểm chảy nguyên liệu nystose 49 Bảng 14 Kết khối lượng làm khô 49 Bảng 15 Kết định lượng nguyên liệu nystose 50 Bảng 16 Kết tạp chất liên quan 50 Bảng 17 Kết thích hợp hệ thống sắc ký 52 Bảng 18 Đường hồi quy tuyến tính đánh giá độ đồng 52 Bảng 19 Kết đánh giá độ đồng lọ 53 Bảng 20 Kết đánh giá liên phòng 54 Bảng 21 Kết đánh giá thành phẩm 54 Bảng 22 Bảng kết F-test 55 Bảng 23 Bảng kết T-test 55 Bảng 24.Tập hợp kết KNV 56 Bảng 25 Kiểm tra độ thích hợp hệ thống 58 Bảng 26 Khoảng tuyến tính định lượng nystose dược liệu 58 Bảng 27 Hàm lượng nystose dược liệu Ba kích 59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Rễ Ba kích Hình Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Hình Sơ đồ giai đoạn thiết lập chất chuẩn 19 Hình Sơ đồ chiết xuất nystose từ Ba kích 26 Hình 3.1 Sắc kí đồ HPLC chất nystose sau tinh chế 34 Hình 3.2 Phổ [M-H]- nystose 35 Hình 3.3 Phổ ESI-MS hợp chất nystose 36 Hình 3.4 Sơ đồ tinh chế nystose sắc ký cột 37 Hình 3.5 Phổ 1H NMR hợp chất sau tinh chế 39 Hình 3.6 Phổ 13C NM , R hợp chất sau tinh chế 40 Hình 3.7 Phổ ESI-MS hợp chất sau tinh chế 40 Hình 3.8 Phổ IR hợp chất sau tinh chế 41 Hình 3.9 Cấu trúc phân tử hợp chất sau tinh chế - nystose 41 Hình 10 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu phương pháp 43 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc ln(cont) ln(dientich) 45 Hình 12 Sắc ký đồ tạp chất liên quan 50 Hình 14 Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính 59 ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích dược liệu quý, có giá trị sử dụng cao làm tăng cường sinh lực, tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm, tăng cường khả sinh dục… từ lâu sử dụng rộng rãi dân gian theo phương thức truyền thống Theo danh mục số đăng ký thuốc nước cấp SĐK từ năm 2010 đến hết tháng 4/2016, có 36 chế phẩm có thành phần từ dược liệu Ba kích gồm: dạng viên hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hồn mềm dược liệu Ngồi ra, có nhiều thực phẩm chức chứa Ba kích cấp phép lưu hành thị trường [3] Trên giới có nhiều nghiên cứu số hợp chất hữu rễ Ba kích như: monotropein có tác dụng chống viêm [24], oligosaccharid có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh corticosteron [31], hay nhóm anthraquinon polysaccharid có tác dụng ngăn ngừa điều trị bệnh liên quan đến tiêu xương [39] Ở Việt Nam, có nhiều đề tài nghiên cứu Ba kích như: Ứng dụng phương pháp HPTLC để định lượng nystose rễ Ba kích [32]… Hiện nay, có hai dược điển có chuyên luận Ba kích dược điển Trung Quốc dược điển Việt Nam Dược điển Trung Quốc có tiêu định lượng nystose phương pháp HPLC sử dụng detector ELSD [30], dược điển Việt Nam V chưa có tiêu định lượng thành phần hóa học có Ba kích Để đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm có chứa dược liệu rễ Ba kích, cần phải có số chất chiết xuất từ dược liệu với độ tinh khiết phù hợp làm chất chuẩn để phân tích Hơn nữa, Việt Nam chưa có đơn vị cung cấp chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu Do đó, để chủ động nguồn chất chuẩn để kiểm tra chất lượng chuẩn hóa dược liệu Ba kích, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn nystose từ dược liệu rễ Ba kích” với mục tiêu: Tinh chế nguyên liệu nystose đạt độ tinh khiết 95% Thiết lập 50 lọ (20mg/lọ) chất chuẩn nystose Xác định hàm lượng nystose số dược liệu Ba kích Việt Nam ... hình thi t lập chất chuẩn giới Việt Nam 16 1.9.1 Tình hình thi t lập chất chuẩn giới 16 1.9.2 Tình hình thi t lập chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích 16 1.10 Phương pháp thi t... giúp đỡ tơi q trình học tập trường, q trình hồn thi n luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thu c Trung ương tạo điều kiện thu n lợi để tơi thực hồn thành luận văn tốt... đến ThS Trần Thị Thu Trang, DS Bạch Thị Thắm anh chị em, bạn bè đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Khoa Thi t lập chất chuẩn - Chất chiếu, Viện Kiểm nghiệm thu c Trung ương giúp