Nguyễn thị thu hằng nghiên cứu phân lập, tinh chế tenuifolin từ viễn chí làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ TENUIFOLIN TỪ VIỄN CHÍ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ TENUIFOLIN TỪ VIỄN CHÍ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Lâm Hồng PGS.TS Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin cảm ơn TS Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội PGS.TS Đoàn Cao Sơn - Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế Thầy cô người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ đồng hành suốt trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm Thuốc trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trường trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, ThS Trần Thị Thu Trang người giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương động viên, giúp đỡ, chia sẻ với tơi tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách thuận lợi Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ động viên tơi suốt trình học tập vừa qua Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2023 Học viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan dược liệu Viễn chí .3 1.1.2 Tổng quan nhóm hoạt chất Saponin triterpenoid nhóm olean .4 1.1.3 Tổng quan tenuifolin 1.1.4 Tổng quan phân tích tenuifolin dược liệu Viễn chí 1.2 Tổng quan chất đối chiếu (chất chuẩn) phân lập từ dược liệu 10 1.2.1 Tổng quan chất đối chiếu (chất chuẩn) .10 1.2.2 Tổng quan phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế chất tinh khiết từ dược liệu 11 1.2.3 Tình hình chiết xuất, phân lập tinh chế tenuifolin 17 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất: 20 2.2 Nội dung nghiên cứu: 21 2.2.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế tenuifolin từ dược liệu Viễn chí 21 2.2.2 Khẳng định cấu trúc đánh giá độ tinh khiết chất chiết 22 2.2.3 Xây dựng số tiêu chất lượng cho tenuifolin làm nguyên liệu thiết lập chuẩn 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 23 2.3.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế tenuifolin từ dược liệu Viễn chí 23 2.3.2 Khẳng định cấu trúc chất tinh chế 24 2.3.3 Xây dựng số tiêu chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chuẩn tenuifolin 24 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế tenuifolin từ dược liệu Viễn chí 32 3.1.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu Viễn chí .32 3.1.2 Chiết xuất tenuifolin từ dược liệu Viễn chí .34 3.1.3 Phân lập tinh chế tenuifolin từ cao Viễn chí .37 3.2 Khẳng định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế 47 3.2.1 Tính chất: .47 3.2.2 Phổ hồng ngoại 47 3.3 Xây dựng số tiêu chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chuẩn tenuifolin 50 3.3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng tenuifolin HPLC/DAD 50 3.3.2 Xây dựng thẩm định phương pháp xác định giới hạn tạp chất liên quan HPLC/DAD 55 CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 60 4.1 Về quy trình chiết xuất, phân lập tenuifolin từ dược liệu Viễn chí 60 4.2 Về xác định cấu trúc nhận dạng chất tinh chế 62 4.3 Về tiêu chuẩn chất lượng tenuifolin làm nguyên liệu thiết lập chuẩn 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BuOH Butanol NaOH Natri hydroxyd HCl Acid hydrocloric CH2Cl2 Dicloromethan CHCl3 Cloroform EtAc Ethyl acetat EtOH Ethanol H2 O Nước DMSO Dimethyl sulfoxid HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao IR Phổ hồng ngoại LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ LOD Giới hạn phát MeOH Methanol NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Sắc ký lớp mỏng USP Dược điển Mỹ ICH Hội nghị quốc tế hài hịa hóa thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người DĐVN Dược điển Việt Nam UV-VIS Tử ngoại – khả kiến VKNTW Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương VKNT TP.HCM Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh WHO Tổ chức y tế giới DAD Đầu dò detector mảng diode array SKĐ Sắc ký đồ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số điều kiện phân tích định tính tenuifolin Bảng 1.2 Một số điều kiện phân tích định lượng tenuifolin HPLC/DAD Bảng 2.1 Các dung mơi hóa chất sử dụng đề tài 21 Bảng 3.1: Kết định lượng tenuifolin dược liệu 33 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi methanol 70 % ethanol 70 % 34 Bảng 3.3: Kết định lượng tenuifolin cao dược liệu 37 Bảng 3.4: Các thông số cột sắc ký phân lập tenuifolin cột RP 44 Bảng 3.5: Độ lặp lại trình tinh chế .46 Bảng 3.6: Tổng hợp kết đo phổ 1H-NMR phổ 13C-NMR 49 Bảng 3.7: Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống .52 Bảng 3.8: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 52 Bảng 3.9: Kết độ 53 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ xác 54 Bảng 3.11: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 57 Bảng 3.12: Kết xác định LOD 57 Bảng 3.13: Kết giá trị đáp ứng mẫu thử nồng độ LOD 58 Bảng 3.14: Kết xác định hàm lượng tạp chất .59 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Dược liệu Viễn chí .3 Hình 1.2 Cấu trúc số saponin Viễn chí .4 Hình 1.3 Cấu trúc Saponin triterpenoid nhóm olean Hình 1.4 Cấu trúc hóa học số hợp chất saponin rễ Viễn chí Hình 1.5 Cấu trúc hóa học số hợp chất saponin rễ Viễn chí Hình 1.6: Cơng thức cấu tạo tenuifolin Hình 2.1 Sơ đồ dự kiến phân lập tinh chế tenuifolin 22 Hình 3.1: Hình ảnh dược liệu Viễn chí (mẫu nghiên cứu) .31 Hình 3.2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng định tính Viễn chí 31 Hình 3.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b), kết chồng phổ DAD (c) 32 Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát ảnh hưởng kỹ thuật chiết .34 Hình 3.5 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng NaOH pH tỷ lệ khác 34 Hình 3.6: Sơ đồ chiết xuất cao Viễn chí từ dược liệu Viễn chí 35 Hình 3.7 Hình ảnh TLC khảo sát dung môi rửa giải qua cột qua thuận (1) 37 Hình 3.8: Hình ảnh TLC khảo sát tỷ lệ dung môi sắc ký cột pha thuận 37 Hình 3.9: Sắc ký đồ TLC phân đoạn cột sắc ký pha thuận (1) 39 Hình 3.10: Sắc ký đồ TLC phân đoạn cột sắc ký pha thuận (2) 39 Hình 3.11 Sắc ký đồ SKLM cắn phân đoạn sử dụng 40 Hình 3.12 Hàm lượng (%) tenuifolin theo nguyên trạng cắn 40 Hình 3.13: Hình ảnh TLC khảo sát hệ dung môi tiến hành sắc ký cột pha đảo 41 Hình 3.14: Hình ảnh TLC khảo sát hệ dung môi sắc ký cột pha đảo .42 Hình 3.15: Hình ảnh TLC phân đoạn cột sắc ký pha đảo 43 Hình 3.16 Sắc ký đồ SKLM cắn phân đoạn sử dụng 44 Hình 3.17 Hàm lượng (%) tenuifolin theo nguyên trạng cắn 44 Hình 3.18: Sơ đồ tóm tắt quy trình tinh chế tenuifolin .46 Hình 3.19: Phổ IR mẫu tinh chế mẫu chuẩn tenuifolin 46 Hình 3.20 So phổ 13C-NMR chuẩn tenuifolin mẫu tinh chế .47 Hình 3.21 So phổ 1H-NMR chuẩn tenuifolin mẫu tinh chế 47 Hình 3.22: Cơng thức cấu tạo chất tinh chế dựa kết phổ NMR .49 Hình 3.23: Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu định lượng tenuifolin 50 Hình 3.24: Kết so phổ UV mẫu tinh chế với chuẩn tenuifolin .50 Hình 3.25: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp 55 ĐẶT VẤN ĐỂ Thuốc có nguồn gốc thảo dược biết đến từ lâu đời Trong năm gần đây, xu hướng quay lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng trị bệnh trở nên phổ biến khơng Việt Nam mà cịn nhiều nước giới Thị trường dược liệu sản phẩm từ dược liệu đa dạng phong phú nguồn gốc chủng loại Ngoài ra, sản phẩm thực phẩm chức có nguồn gốc từ dược liệu quan tâm Nguồn cung cấp dược liệu nước ta chủ yếu thu hái tự nhiên, trồng trọt nhập Tuy nhiên, có lượng đáng kể dược liệu có nguồn gốc khơng rõ ràng khiến cho việc kiểm sốt chất lượng dược liệu cịn khó khăn Có dược liệu giả, dễ gây nhẫm lẫn song song tồn ảnh hưởng đến an toàn chất lượng thuốc đơng dược Trong cơng tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu cần chất chuẩn hoạt chất chất đặc trưng cho dược liệu Chất chuẩn dùng cho dược liệu thường nhập từ nước với giá thành tương đối cao; thời gian nguồn hàng thường không ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu công tác kiểm tra chất lượng thuốc thảo dược, việc tạo lập chất chuẩn cần thiết Viễn chí (Radix polygalae) có tác dụng an thần, ích trí, khu đàm, khái Vì từ xưa vị dược liệu sử dụng để điều trị ho nhiều đờm, viêm phế quản mãn tính, suy nhược thần kinh, ngủ….[1] Dược liệu Viễn chí thị trường thường có giá đắt có phân nhiều mức chất lượng khác nhau: dựa vào kích thước dược liệu, hàm lượng chất đánh dấu Thành phần hóa học Viễn chí saponin triterpenoid thuộc nhóm olean [1], đó, tenuifolin thành phần dùng để kiểm sốt chất lượng Viễn chí theo dược điển Trung Quốc 2020 dược điển Việt Nam V Tuy nhiên, chưa có sẵn chất chuẩn để phục vụ kiểm tra chất lượng dược liệu sử dụng lưu hành thị trường Nguồn cung cấp chất chuẩn chủ yếu từ nước với giá thành cao, lên đến 10 triệu/ lọ 10 mg Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn địi hỏi phải có chất chuẩn tenuifolin nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra quản lý chất lượng dược liệu Viễn chí, luận văn cao học: “Nghiên cứu phân lập tinh chế tenuifolin từ Viễn chí làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn” thực với mục tiêu sau: - Phân lập, tinh chế khẳng định cấu trúc tenuifolin từ dược liệu Viễn chí làm nguyên liệu thiết lập chuẩn - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn tenuifolin để thiết lập chuẩn Dược điển Việt Nam 125.43 102.81 82.96 76.75 76.71 73.63 69.98 68.84 63.72 60.98 51.26 51.21 48.00 46.79 45.40 44.87 43.48 40.73 40.00 39.83 39.66 39.50 39.33 39.16 38.99 36.06 33.42 32.94 32.65 32.25 30.46 23.52 139.42 178.87 TENC-DMSO-C13CPD Current Data Parameters NAME 5HUNG_TENC EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20230203 Time 14.00 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 2048 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 300.4 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7990330 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.2410010 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7852420 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 125.48 102.83 83.02 76.77 76.72 73.66 70.00 68.86 63.74 61.01 51.28 51.24 48.03 46.81 45.43 44.89 43.50 40.76 40.00 39.83 39.67 39.50 39.33 39.16 39.00 36.09 33.45 32.97 32.68 32.28 30.48 23.55 139.44 178.96 178.92 TENT-DMSO-C13CPD Current Data Parameters NAME 5HUNG_TENT EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20230203 Time 14.20 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 512 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 300.4 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7990330 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.2410010 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.35764000 W PLW13 0.17989001 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7852390 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 4.1 Phổ 1H – NMR 5.392 5.387 5.381 4.904 4.888 4.202 4.190 4.125 3.954 3.945 3.935 3.928 3.858 3.854 3.610 3.079 3.069 3.063 3.059 3.055 3.000 2.986 2.973 2.506 2.503 2.500 2.497 2.494 1.904 1.885 1.881 1.825 1.775 1.763 1.606 1.599 1.503 1.488 1.482 1.470 1.458 1.420 1.400 1.377 1.268 1.244 1.230 1.156 1.135 1.126 1.120 1.113 0.997 0.869 0.849 0.638 TEN.C-DMSO-1H Current Data Parameters NAME 5HUNG_TEN.C EXPNO 10 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20230202 Time 15.30 h INSTRUM AvanceNEO_600MHz PROBHD Z114607_0862 ( PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 11904.762 Hz FIDRES 0.363304 Hz AQ 2.7525120 sec RG 32 DW 42.000 usec DE 8.71 usec TE 303.1 K D1 1.00000000 sec TD0 SFO1 600.4037075 MHz NUC1 1H P0 3.50 usec P1 10.50 usec PLW1 27.03700066 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 600.4000046 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 12 11 10 ppm 1.06 2.07 1.32 1.29 2.37 1.51 2.87 3.64 1.28 1.16 1.18 2.68 1.17 1.02 1.03 4.05 2.23 5.22 6.23 1.08 1.13 6.08 3.00 13 5.384 4.200 4.185 4.121 3.932 3.925 3.866 3.626 3.604 3.422 3.401 3.379 3.089 3.078 3.072 3.064 3.051 2.998 2.982 2.966 2.768 2.760 2.740 2.733 2.503 2.500 2.496 1.903 1.878 1.820 1.772 1.757 1.738 1.694 1.621 1.602 1.594 1.575 1.567 1.501 1.482 1.448 1.419 1.398 1.371 1.267 TENT-DMSO-1H Current Data Parameters NAME 5HUNG_TENT EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20230203 Time 14.36 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpr TD 32768 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.305176 Hz AQ 1.6384000 sec RG 27.22 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 300.0 K D1 2.00000000 sec D12 0.00002000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2407508 MHz NUC1 1H P1 10.20 usec PLW1 22.00000000 W PLW9 0.00009155 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.2390052 MHz WDW EM SSB LB Hz GB PC 1.00 11 10 0.72 0.69 0.71 0.69 0.28 0.32 1.92 0.71 0.74 0.90 2.16 1.70 0.93 3.20 1.88 4.56 4.85 1.92 5.30 2.59 12 -1 -2 ppm 4.3 Phổ MS MS1 SCAN-TENUIFOLINSTANDARD-NEGATIVE-2 MS1 SCAN-TENUIFOLINSTANDARD-NEGATIVE-2 (1.342) Scan ES5.52e6 679.4 % 100 680.4 425.3 455.4 701.6 713.6 473.2 513.2 523.3 541.2 400 450 747.5 677.6 500 550 939.7 949.8 769.4 791.6 837.4 838.4 605.5 645.5 600 650 700 750 800 850 905.4 900 950.9 966.9 990.8 950 m/z 1000 MS1 SCAN-TENUIFOLIN SAMPLE-NEGATIVE-1 MS1 SCAN-TENUIFOLIN SAMPLE-NEGATIVE-1 (0.167) Scan ES6.42e6 679.5 % 100 680.4 455.4 701.6 425.3 456.4 747.5 485.3 486.2 537.3 400 450 500 550 585.3 600 713.5 748.5 677.5 799.2 649.4 650 700 750 800 841.5 850 903.7 939.7 900 950 966.7 997.1 m/z 1000 Phụ lục Chuyên luận Viễn chí (DĐVN V) Phụ lục Bản dự thảo tiêu chuẩn cho chất chuẩn Dược Điển Việt Nam tenuifolin DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CỦA TENUIFOLIN Tenuifolin Công thức phân tử: C36H56O12 Khối lượng phân tử: 680,82 g/mol Tên khoa học: (2S, 3R, 4S, 4aR, 6aR, 6bR, 8aS, 12aS, 14aR, 14bR) – – hydroxy - 6b - (hydroxymethyl) - 4, 6a, 11, 11, 14b – pentamethyl – - [(2R, 3R, 4S, 5S, 6R) - 3, 4, – trihydroxy – - (hydroxymethyl) oxan – - yl] oxy - 1, 2, 3, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 12a, 14, 14a – tetradecahydropicene - 4, 8a - dicarboxylic acid Chuẩn làm việc tenuifolin phải chứa khơng 90,0% tính theo ngun trạng Tính chất Bột màu trắng trắng ngà, tan tốt methanol, ethanol Định tính A Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2 - DĐVN V) chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại tenuifolin chuẩn B Trong mục định lượng, sắc ký đồ dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic dung dịch đối chiếu tenuifolin Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (phụ lục 5.3 - DĐVN V)  Điều kiện sắc ký - Cột sắc ký Phenomenex RP18 (250 x 4,6 mm; µm) - Detector DAD:  = 210 nm - Pha động: Methanol – dung dịch acid phosphoric 0,05 % (60:40) - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng thí nghiệm  Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử Dung dịch mẫu trắng: Methanol Dung dịch thử: Hòa tan lượng chế phẩm methanol để dung dịch có nồng độ khoảng mg/ml Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan tenuifolin chuẩn methanol để dung dịch có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml Dung dịch đối chiếu (2): Hút xác 1,0 ml dung dịch thử vào bình định mức 100 ml, pha loãng vừa đủ đến vạch methanol, lắc  Tiến hành kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch mẫu trắng, dung dịch đối chiếu (1), lặp lại lần với dung dịch đối chiếu (2) dung dịch thử, ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu diện tích tất pic ngoại trừ pic dung mơi Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic tenuifolin lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (2) không lớn 3,0 % Hệ số kéo đuôi pic tenuifolin dung dịch đối chiếu (2) từ 0,8 đến 2,0 Độ phân giải pic tenuifolin pic tạp lân cận dung dịch thử không nhỏ 1,25 Số đĩa lý thuyết tính theo pic tenuifolin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) không 3000 Yêu cầu: Trên sắc ký đồ thu từ dung dịch thử, diện tích pic phụ không lớn hai lần diện tích pic tenuifolin sắc ký đồ thu từ dung dịch đối chiếu (2) (2,0 %) Tổng diện tích pic phụ khơng lớn 5,0 lần diện tích pic sắc ký đồ thu từ dung dịch đối chiếu (2) (5,0 %) Bỏ qua pic có diện tích nhỏ 0,05 lần diện tích pic sắc ký đồ thu từ dung dịch đối chiếu (2) (0,05%) Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (phụ lục 5.3 - DĐVN V)  Điều kiện sắc ký - Cột sắc ký Phenomenex RP18 (250 x 4,6 mm; µm) - Detector DAD:  = 210 nm - Pha động: Methanol – dung dịch acid phosphoric 0,05 % (70:30) - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng thí nghiệm  Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử Mẫu trắng: Methanol Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 10 mg tenuifolin chuẩn vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội thêm vừa đủ đến vạch methanol, lắc Dung dịch thử: Cân xác khoảng 10 mg mẫu thử vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 20 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút, để nguội thêm vừa đủ đến vạch methanol, lắc Cách tiến hành: Tiêm dung dịch mẫu trắng, lặp lại lần dung dịch chuẩn dung dịch thử Ghi sắc ký đồ, thời gian lưu diện tích pic tenuifolin sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử Kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký: Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích pic tenuifolin lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không lớn 2,0 % Số đĩa lý thuyết tính theo pic tenuifolin sắc ký đồ dung dịch chuẩn không 3000 Dựa vào diện tích pic tenuifolin sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch chuẩn, hàm lượng (%) tenuifolin (C36H56O12) tính theo cơng thức: X (%) = ST mC   P  100 S C mT Trong đó: - ST, SC: Diện tích pic tenuifolin sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch chuẩn tương ứng - mT, mC: Khối lượng cân mẫu thử mẫu chuẩn tương ứng (mg) - P: Hàm lượng (%) chuẩn tenuifolin