BÙI QUỐC THÁI NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT, PHÂN lập và TINH CHẾ MONOTROPEIN từ BA KÍCH làm NGUYÊN LIỆU THIẾT lập CHUẨN LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI QUỐC THÁI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ BA KÍCH LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI QUỐC THÁI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ BA KÍCH LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Việt Hùng HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin cảm ơn PGS.TS Trần Việt Hùng - Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý Đào tạo sau đại học, mơn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trường q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Thu Trang, ThS Dương Minh Tân anh chị em, bạn bè đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu, Khoa Vật lý Đo lường - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp thuận lợi Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ động viên suốt trình học tập vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2016 Học viên Bùi Quốc Thái MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 BA KÍCH 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Mô tả 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến 1.1.4 Công dụng 1.1.5 Thành phần 1.2 NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID 1.3 MONOTROPEIN 1.3.1 Đặc điểm tính chất 1.3.2 Tác dụng dược lý monotropein 10 1.4 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU 11 1.4.1 Vài nét chiết xuất dược liệu 11 1.4.2 Vài nét phân lập tinh chế 12 1.5 CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU 12 1.5.1 Vài nét chất chuẩn 12 1.5.2 Khái quát thiết lập chất chuẩn từ dược liệu 14 1.5.3 Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích 16 1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 17 1.6.1 Sắc ký lớp mỏng 17 1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 20 1.6.3 Phổ khối (MS) 23 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 24 1.6.5 Sắc ký cột 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Chế phẩm 28 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 29 2.2.2 Dung mơi, hố chất 30 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.3.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế monotropein từ Ba kích 31 2.3.2 Định tính, xác định cấu trúc monotropein tinh chế 32 2.3.3 Xác định hàm lượng monotropein tinh chế 32 2.3.4 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein Ba kích 33 2.3.5 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein chế phẩm chứa Ba kích 35 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ BA KÍCH 37 3.1.1 Chiết xuất iridoid glycosid 37 3.1.2 Phân lập tinh chế monotropein từ hỗn hợp iridoid glycosid 39 3.2 ĐỊNH TÍNH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC 42 3.3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC 45 3.3.1 Xác định tinh khiết HPLC 45 3.3.2 Xác định hàm ẩm TGA 47 3.4 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG BA KÍCH 48 3.4.1 Chuẩn bị mẫu 48 3.4.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 48 3.4.3 Xây dựng phương pháp phân tích monotropein Ba kích 51 3.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích monotropein Ba kích 52 3.5 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA BA KÍCH 60 3.5.1 Chuẩn bị mẫu 60 3.5.2 Xây dựng phương pháp phân tích monotropein chế phẩm chứa Ba kích 61 3.5.3 Thẩm định phương pháp phân tích monotropein chế phẩm chứa Ba kích 62 CHƯƠNG BÀN LUẬN 68 4.1 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ, PHƯƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI 68 4.1.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 68 4.1.2 Cấu trúc monotropein tinh chế 68 4.1.3 Định tính, định lượng monotropein Ba kích chế phẩm chứa Ba kích HPLC 68 4.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 KẾT LUẬN 71 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Detector Diod Array - Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang DĐVN Dược điển Việt Nam DMFM Dung môi pha mẫu H3PO4 Acid phosphoric HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao KH2PO4 Kali dihydrophosphat LC-MS Sắc ký lỏng – khối phổ LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Phổ khối NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PA Đạt tinh khiết phân tích RP-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo RSD Độ lệch chuẩn tương đối SĐK Số đăng ký SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TGA Phân tích nhiệt trọng lượng USP Dược điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số chất nhóm anthraquinon Ba kích 1.2 Một số chất nhóm iridoid Ba kích 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 30 2.2 Chương trình gia nhiệt máy TGA 33 3.1 Kết xác định hàm ẩm monotropein TGA 47 3.2 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 55 3.3 Kết khảo sát tính tuyến tính 56 3.4 Kết khảo sát độ lặp lại mẫu Ba kích 57 3.5 Kết khảo sát độ xác trung gian với mẫu thử Ba 58 kích 3.6 Kết đánh giá độ với mẫu thử Ba kích 59 3.7 Kết khảo sát LOD LOQ 60 3.8 Kết khảo sát độ lặp lại với chế phẩm Hatkick 65 3.9 Kết khảo sát độ xác trung gian định lượng 66 monotropein chế phẩm Hatkick 3.10 Kết đánh giá độ với chế phẩm Hatkick 67 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Cây Ba kích (Morinda officinalis How) mẫu trồng Lục Ngạn, Bắc Giang 1.2 Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng Lục Ngạn, Bắc Giang 1.3 Công thức cấu tạo monotropein 1.4 Đường nystose 16 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 20 2.1 Chế phẩm HatKick 28 2.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân 30 dùng nghiên cứu 3.1 SKĐ định tính Ba kích sắc ký lớp mỏng 38 3.2 Phổ MS phân đoạn A2 39 3.3 Phổ MS phân đoạn B2 40 3.4 Sơ đồ chiết xuất monotropein từ Ba kích 41 3.5 Phổ 1H NMR hợp chất monotropein 43 3.6 Phổ 13C NMR hợp chất monotropein 43 3.7 Phổ khối phân giải cao monotropein tinh chế 44 3.8 Giá trị độ tinh khiết píc vị trí xuất píc monotropein 45 3.9 SKĐ monotropein tinh chế so sánh với mẫu trắng 46 3.10 Phổ TGA monotropein 47 Report(Report Editor) ^4 1711012016 09:58:21 ==== Shimadzu LGsolution Analysis Repoft ==== (UV Library Filename) BA KICH.IIb olotrimaol.llb guaifenesin.llb natri benzoat.llb oxomemazin-paracetamol- guaifenesin-natri benzoat.llb oxomemazin.llb paracetamol.llb (Search Parameters) Search WL Range Max # of Hits : 190nm - 800nm :1 (Target Spectrum) Retention Time Serial# Compound Name Spectrum Operation Similarity :1 : CHUAN MONOTROPEIN : None : 0.999790 mAU 25 15 Similaritv 0.99979t Serial{ ComDound Name CHUAN MONOTROPEI\ None Ooeration I LL 2310912016 08:29:09 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== (UV Library Filename) CHUAN MONOTROPEIN.IIb (Search Parameters) Range Hits Search WL Max # of : l90nm : - 800nm (Target Speotrum) Retontion Time :7.179 mAU t5 I0 I nm Serial# : Compound Name : CHUAN MONOTROPEIN Speotrum Operation Similarity :0.997170 : Nono mAU 25 Similaritv 997170 Sedal# Compound Name ODeration CHUAN MONOTROPEII None UV Library Search 11 10912016 e4 DINH LT.|OhIG MONOTROPEIN E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh Acquired by Sample Name Sample lD 17:00:04 I 01 lcd : Bui Quoc Thai fray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed 10 uL Tuyen tinh 01.lcd DL Monotropein DL Monotropein Monotropein 1110912016 2:00:41 AM 1'l10912016 2:30:06 PM EITHAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 01.lcd mAU PeakTable Chl 237nm4nm Name Monotrooein Ret Time 7.Q86 Area 98035 98035 Heisht 6137 6t37 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 01 lcd 5L 1110912016 17:00:28 I ==== DINH LlrChG MONOTROPEIN ==== E:\THAI\Tham dinh Morntropein\Tuyen tinh 02.lcd Acquired by Sample Name Sample lD Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed : Bui Quoc Thai :1 :2 : '10 uL : Tuyen tinh 02.lcd : DL Monotropein : DL Monotropein : Monotropein :1110912016 2:15:08 PM :1110912016 4:30:19 PM E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 02.lcd PeakTable Chl 237nm 4nm Name RT7.089 Ret Time 7.089 Area 313612 3136t2 Heisht 17523 t7523 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 02.lcd .7 27 11 10912016 17 :00:43'l I DINH LI.|OhIG MONOTROPEIN EITHAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 03.lcd Acquired by Sample Name Sample lD : Bui Quoc Thai Tray# Vail # i1 Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed :10 uL :3 Tuyen tinh 03.lcd : DL Monotropein : DL Monotropein : Monotropein : :111O912O16 2:30:35 PM :'11 | 09 I 201 4:30:22 PM EITHAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 03.bd PDAMutti 1l237nm4nm PeakTable Chl 237nm 4nm Name RT7.078 Ret Time 7.078 Area 56301 563015 Heisht 25660 25660 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 03.lcd eq '11 10912016 17 :0O:54'l I ==== DINH LUO[{G MONOTROPEIN ==== E Acquired by Sample Name Sample lD Tray# :\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 04 lcd : Bui QuocThai : i1 Vail # i4 Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed :10uL :Tuyen tinh 04.lcd : DL Monotropein : DL Monotropein :Monotropein : 1'110912A16 2:45:28 PM : 1110912016 4:3'l:24 PM E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 04.bd PeakTable Chl 237nm 4nm Name Monotropein Ret Time 7.082 Area 789321 789321 Heisht 28966 28966 E:\THAI\Tham din h Monotropein\Tuyen tinh 04.lcd 111091201617:01:07 I t< ==== DINH LUONG MONOTROPEIN ==== Acquked by Sample Name Sample lD Trafi E :\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 05 lcd : Bui QuocThai ' Vail # :5 Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed :10uL Tuyen tinh 05.lcd : DL Monotropein : DL Monotropein : Monotropein :1110912016 3:00:55 PM ' 11 10912016 4:31 :40 PM : E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 05.lcd PDAMulti 1l237nm4nm PeakTable Chl 237nm 4nm Name Monotropein Ret Time 7.077 Area 1010526 1010526 Height 29433 29433 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Tuyen tinh 05.lcd t 121091201616:50:59 / DINH Lt ChG MONOTROPEIN ==== E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong_Do dung 80.lcd Bui Quoc Thai Acquired by Sample Name Sample lD Tray# Vail # 1 10 uL Ba kich trong_Do dung 80.lcd DL Monotropein DL Monotropein Monotropein 1210912016 10:00:38 AM 1210912016 3'.27:45PM Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed EiTHAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich hong_Do dung 80.bd @ F q F @ 22 F F F t 20 't7 0.0 2.5 5.0 PDAMulti 1l237nm4nm PeakTable Chl237nm4nm Name RT7.076 Ret Time Area 7.076 5t2456 5t2456 Heisht 20935 20935 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\ea kich trong_Do dung 80.lcd 5)L 121091201616:50:59 / ==== DINH LuCt\G MONOTROPEIN ==== EITHAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong-Do dung 100.lcd Acquired by Sample Name Sample lD fray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed Bui Quoc Thai 1 10 uL Ba kich trong_Do dung 100.lcd DL Monotropein DL Monotropein Monotropein 1210912016 9:00:38 AM 1210912016 3:27'.45 PM E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong_Do dung 100.lcd PDAMulti 1l237nm 4nm PeakTable ch 237 rull +run Name RT7.078 Area Ret Time 7.078 558652 558652 Heifit 260t2 26012 E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong_Do dung 100.lcd s i9 1210912016 16:52:59 | ==== DINH LIJCIG MONOTROPEIN ==== EITHAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong_Do dung 120.lcd Acquired by Sample Name Sample lD Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed : Bui QuocThai 1 10 uL Ba kich trong_Do dung 120.lcd DL Monotrooein DL Monotropein Monotropein 1210912016 10:30:38 AM 12109120'16 3:35:45 PM E:\THAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong-Do dung 'l20.lcd mAU32 30.0 27 25 22 20 17 15 12 10 '17.5 15.O 20.o 22.5 PDA Multi 1l237nm 4nm Chl 237nn4brn Name RT7.08l Ret Time 7.081 Area 6t6575 6t6575 Height 31024 31024 EITHAI\Tham dinh Monotropein\Ba kich trong-Do dung 120.lcd 5L4 121091201617:21:14 | ==== DINH Lt OhG MONOTROPEIN ==== EITHAI\Tham dinh Morrctropein\HaU