Nghiên cứu chiết xuất chọn lọc và tinh chế asiaticosid từ cây rau má (centella asiatica (l ) urb)

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH PHƢƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101396 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH PHƢƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101396 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHỌN LỌC VÀ TINH CHẾ ASIATICOSID TỪ CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urb.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Tuấn Anh PGS TS Đỗ Quyên Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc Liệu HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài, nhận quan tâm, giúp đỡ tận tình nhiều thầy cô, gia đình, bạn bè Với lòng cảm ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ths Phạm Tuấn Anh Ts Đỗ Quyên tận tình hướng dẫn lý thuyết thực hành, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ths Nghiêm Đức Trọng – Giảng viên Bộ môn Thực Vật, trường Đại Học Dược Hà Nội giúp đỡ việc giám định tên khoa học dược liệu - Ds Lê Xuân Kỳ - Giảng viên Bộ môn Vật lý – Hóa lý, trường Đại Học Dược Hà Nội giúp đỡ việc định lượng HPLC - Các thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược Liệu tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành khóa luận Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến tập thể thầy cô trường Đại Học Dược Hà Nội, người dìu dắt dạy bảo suốt thời gian học đại học Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên Lê Đình Phương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rau má 1.1.1 Vị trí phân loại chi Centella (L.) hệ thống phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm hình thái rau má 1.1.3 Phân bố sinh thái 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái chế biến 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng dược lý 1.1.7 Công dụng 1.2 Tổng quan asiaticosid 10 1.2.1 Công thức hóa học, tính chất hóa lý 10 1.2.2 Định tính 11 1.2.3 Định lượng 11 1.2.4 Tác dụng dược lý công dụng 12 1.2.5 Một số nghiên cứu chiết xuất tinh chế asiaticosid từ rau má 13 1.3 Tổng quan tối ƣu hóa áp dụng chiết xuất tối ƣu 15 1.3.1 Tối ưu hóa 15 1.3.2 Áp dụng nghiên cứu chiết xuất tối ưu 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18 2.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất 18 2.1.2 Máy móc, thiết bị 19 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Khảo sát số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má 19 2.3.2 Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid 21 2.3.3 Phương pháp đánh giá 23 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Khảo sát số điều kiện chiết xuất tối ƣu asiaticosid từ rau má 26 3.1.1 Thiết kế mô hình chiết xuất 26 3.1.2 Áp dụng phần mềm INForm tối ưu hóa 27 3.1.3 Thực nghiệm kiểm chứng 27 3.2 Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid cao rau má 28 3.2.1 Phương pháp chiết phân đoạn 28 3.2.2 Phương pháp tinh chế dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn 29 3.2.3 Định tính mẫu cao thu được…………………………………… 32 3.2.4 Định lượng mẫu cao thu được………………………………….…33 3.3 Bàn luận 35 3.3.1 Về khảo sát số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má 35 3.3.2 Về nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 Kết luận 38 Đề xuất 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT - BV: Bed volume - HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) - NXB: Nhà xuất - TT: Thuốc thử - SKLM: Sắc ký lớp mỏng - STT: Số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các nhóm chất khác rau má 3.1 Mô hình thí nghiệm kết thực nghiệm chiết xuất 26 dược liệu 3.2 Kết thực nghiệm chiết xuất rau má điều kiện tối 28 ưu 3.3 Kết khảo sát dung môi rửa giải nhựa hấp phụ resin 30 D101 3.4 Hàm lượng cắn theo phương pháp chiết phân đoạn 34 3.5 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao theo phương 34 pháp chiết phân đoạn 3.6 Hàm lượng cắn theo phương pháp dùng nhựa hấp phụ 35 lỗ xốp lớn 3.7 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao khô theo phương pháp dùng nhựa lỗ xốp lớn 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình Tên hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo asiaticosid 10 1.2 Lý thuyết hệ thống hộp đen 16 2.1 Dược liệu rau má 18 2.2 Sơ đồ chiết xuất dược liệu rau má 20 2.3 Sơ đồ làm giàu saponin cao rau má 22 phương pháp chiết phân đoạn 3.1 Sơ đồ tinh chế saponin cao rau má dùng 31 nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn 3.2 Sắc ký đồ mẫu cao thu 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta có nguồn dược liệu phong phú y học cổ truyền lâu đời Cùng với phát triển ngành dược Việt Nam, nghiên cứu sử dụng dược liệu sẵn có dựa kết hợp y học cổ truyền với y học đại đóng vai trò quan trọng Cây rau má (Centella asiatica (L.) Urb.) thuốc mọc hoang trồng khắp nước ta, sử dụng với nhiều tác dụng quý giải nhiệt, giải độc, thông tiểu, dùng để chữa sốt, rôm sảy, mẩn ngứa, bệnh gan,…Trong y học đại, cao rau má với hoạt chất asiaticosid ứng dụng nhiều điều trị bỏng, làm lành vết thương, điều trị lao, phong,…[10] Với phát triển công nghệ bào chế, rau má sử dụng làm thuốc nhiều dạng bào chế khác nhau, dạng cao khô sử dụng phổ biến Tuy nhiên, việc chiết xuất hoạt chất rau má, đặc biệt asiaticosid chưa đạt hiệu suất cao Với hàm lượng thấp dược liệu, với công nghệ chiết xuất truyền thống, sản phẩm cao khô thị trường có hàm lượng asiaticosid thấp Vì vậy, thực đề tài “Nghiên cứu chiết xuất chọn lọc tinh chế asiaticosid từ rau má (Centella asiatica (L.) Urb.)” với mục tiêu: - Khảo sát số điều kiện chiết xuất tối ưu asiaticosid từ rau má - Nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rau má Cây rau má (còn gọi tích tuyết thảo, liên tiền thảo) thuộc chi Centella (L.) họ Hoa tán (Apiaceae) 1.1.1 Vị trí phân loại chi Centella (L.) hệ thống phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại Takhtajan, chi Centella (L.) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae) Vị trí phân loại loài Centella asiatica (L.) Urb hệ thống phân loại thực vật tóm tắt sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Thù du (Cornidae) Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales) Họ Hoa tán (Apiaceae) Chi Centella (L.) - Tên khoa học rau má: Centella asiatica (L.) Urb., có tên khoa học khác Hydrocotyle asiatica L., Trisanthus cochinchinesis Lour - Tên gọi khác: Tích tuyết thảo, liên tiền thảo - Tên nước ngoài: Phanok (Lào), Rachiek kranh (Campuchia)[1], [16] 1.1.2 Đặc điểm hình thái rau má Rau má loài cỏ mọc bò mặt đất, cho thân đứng ngắn, phân nhánh nhiều, có rễ mấu, thân gầy, nhẵn, chia thành đốt dài, thân non phủ lông mềm Lá mọc thành chụm, phiến đơn, hình tròn, gần tròn hình thận, rộng 1-7 cm, mép khía tai bèo, gân chân vịt, góc rộng, chóp tròn, gân từ đáy 5, gân phụ 1-2 cặp, mặt có lông gân Cuống dài 10-12 cm cuống dài phiến Cụm hoa hình tán đơn mọc kẽ lá, gồm 2-3 hoa nhỏ không cuống, hoa gần không cuống, hoa bên 34 Bảng 3.4 Hàm lượng cắn theo phương pháp chiết phân đoạn Mẫu cao Khối lượng Độ ẩm dược Khối lượng Độ ẩm Hiệu suất dược liệu (g) liệu (%) cao (g) cao (%) tạo cao (%) T1 20,05 10,53 0,3105 2,44 1,69 T2 20,03 10,53 0,3133 2,64 1,70 T3 20,10 10,53 0,3264 3,12 1,76 Hiệu suất tạo cao: 1,72 ± 0,04% Thực định lượng mẫu cao khô rau má thu phương pháp HPLC, áp dụng công thức (2) công thức (3) để xác định hàm lượng asiaticosid mẫu cao thu Kết trình bày theo bảng: Bảng 3.5 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao theo phương pháp chiết phân đoạn Mẫu Khối lượng cao Độ ẩm cao Diện tích pic Hàm lượng khô (g) (%) (mAU.s) asiaticosid (%) T1 0,1503 2,44 4327,00 10,46 T2 0,1511 2,64 3743,65 9,03 T3 0,1510 3,12 4178,57 10,13 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao T1, T2, T3: 9,86 ± 0,75% - Phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn: Áp dụng công thức (1) tính hiệu suất tạo cao khô mẫu C1, C2, C3 Bảng kết thu được: 35 Bảng 3.6 Hàm lượng cắn theo phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn Mẫu cao Khối lượng Độ ẩm dược Khối lượng Độ ẩm Hiệu suất dược liệu (g) liệu (%) cao (g) cao (%) tạo cao (%) C1 100,11 10,53 1,7322 2,54 1,88 C2 100,07 10,53 1,7269 1,63 1,90 C3 100,00 10,53 1,8778 3,64 2,02 Hiệu suất tạo cao: 1,93 ± 0,08% Tiến hành định lượng asiaticosid mẫu cao C1, C2, C3 theo phương pháp HPLC Áp dụng công thức (2) (3) để tính kết Kết trình bày theo bảng: Bảng 3.7 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao khô theo phương pháp dùng nhựa lỗ xốp lớn Mẫu Khối lượng cao Độ ẩm cao Diện tích pic Hàm lượng khô (g) (%) (mAU.s) asiaticosid (%) C1 0,1512 2,54 6680,39 16,07 C2 0,1500 1,63 6427,57 15,45 C3 0,1499 3,64 6554,33 16,09 Hàm lượng asiaticosid mẫu cao thu được: 15,87 ± 0,36% 3.3 Bàn luận Từ kết thu trình nghiên cứu, đưa số bàn luận sau: 3.3.1 Về khảo sát số điều kiện chiết xuất tối ƣu asiaticosid từ rau má Quy trình chiết xuất hoạt chất từ dược liệu chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: Nguyên liệu sử dụng, dung môi chiết xuất, kỹ thuật, phương tiện thực trình chiết xuất Ở nghiên cứu này, khảo sát yếu tố 36 kỹ thuật dung môi chiết xuất nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/dược liệu số lần chiết xuất Việc sử dụng phần mềm thông minh tối ưu hóa giúp giảm thời gian, chi phí số lần thực thí nghiệm Kết thực nghiệm kiểm chứng cho thấy phù hợp giá trị dự đoán phần mềm INForm giá trị thực tế thu Phương pháp chiết xuất sử dụng chiết hồi lưu, cách tiến hành đơn giản với dung môi ethanol nước cất, dung môi thân thiện với môi trường chiết xuất chọn lọc với hoạt chất asiaticosid dược liệu rau má, ứng dụng sản xuất công nghiệp để đạt hiệu chiết xuất tối đa với dược liệu rau má 3.3.2 Về nghiên cứu tinh chế phân đoạn giàu asiaticosid Nghiên cứu tiến hành thực tinh chế asiaticosid cao khô rau má hai phương pháp: Phương pháp chiết phân đoạn phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn Phương pháp chiết phân đoạn phương pháp sử dụng dung môi khác để loại tạp khỏi dịch chiết nhằm tinh chế hoạt chất thu dựa độ tan khác hoạt chất dung môi Với thí nghiệm thiết kế, để tinh chế asiaticosid từ dịch chiết rau má thu được, tiến hành loại tạp với dung môi n – hexan, dichloromethan n – buthanol bão hòa nước Phương pháp thực phức tạp, dung môi sử dụng dung môi độc hại, hiệu suất thu hồi dung môi thấp, có hiệu kinh tế không cao Phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn phương pháp sử dụng loại nhựa hấp phụ (resin D101, HPD100, HPD300,…) để tách hoạt chất khỏi dịch chiết nhờ khả hấp phụ chọn lọc với hoạt chất Với thí nghiệm tiến hành, sử dụng nhựa hấp phụ resin D101 để tinh chế 37 asiaticosid từ cao khô rau má, với dung môi sử dụng ethanol nước cất Phương pháp thực đơn giản, dung môi sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, nhựa hấp phụ tái chế sau sử dụng, có hiệu kinh tế cao Theo phương pháp chiết phân đoạn, hàm lượng cắn 1,72 ± 0,04%, hàm lượng asiaticosid cao thu 9,86 ± 0,75% Theo phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn, hiệu suất tạo cao thu 1,93 ± 0,08%, hàm lượng asiaticosid cao 15,87 ± 0,36% Như vậy, kết thu cho thấy phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn có hiệu suất tạo cao hàm lượng asiaticosid cao khô thu lớn so với phương pháp chiết phân đoạn Điều giải thích nhựa hấp phụ resin D101 có cấu trúc lỗ xốp, diện tích bề mặt lớn, dung lượng hấp phụ lớn hấp phụ chọn lọc, hao hụt saponin, có asiaticosid so với loại tạp chất thay đổi dung môi Với ưu điểm phương pháp thực đơn giản, sử dụng dung môi thân thiện với môi trường, tái sử dụng nhựa hấp phụ, hiệu suất tạo cao hàm lượng asiaticosid cao lớn, phương pháp tinh chế asiaticosid nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn từ cao khô rau má có triển vọng lớn việc áp dụng quy mô công nghiệp 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ kết thu trình nghiên cứu, đưa số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện chiết xuất tối ưu cho dược liệu rau má theo phương pháp chiết hồi lưu, dung môi ethanol nước cất Sử dụng phương pháp D – optimal phần mềm Design Expert để thiết kế thí nghiệm sử dụng phần mềm thông minh INForm để tối ưu hóa phương pháp chiết xuất rau má với hai thông số đầu hàm lượng asiaticosid cắn hàm lượng cắn Điều kiện tối ưu xác định phần mềm INForm là: + Nồng độ ethanol: 69% + Tỷ lệ dung môi/dược liệu: + Số lần chiết: - Đã xây dựng quy trình tinh chế asiaticosid từ cao khô rau má theo phương pháp chiết phân đoạn dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn: + Phương pháp chiết phân đoạn: Dịch chiết nước thu loại tạp cách lắc với n – hexan (3 lần), thu phân đoạn nước, sau lắc với dichloromethan (3 lần), thu phân đoạn nước, lắc tiếp với n-buthanol bão hòa nước (5 lần) thu phân đoạn n – buthanol, cô dịch n – buthanol đến cắn 60°C thu cao khô rau má tinh chế + Phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn: Tinh chế phương pháp chiết lỏng – rắn, nhựa hấp phụ resin D101, dùng nước cất ethanol 30% để loại tạp, rửa giải ethanol 70%, cô dịch rửa giải đến cắn 60°C để thu cao khô rau má tinh chế 39 Đề xuất Với kết thu trình nghiên cứu, đề xuất sản xuất thử nghiệm cao tinh chế asiaticosid phương pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn quy mô pilot, từ xây dựng sở để áp dụng quy mô công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Vân Anh (2010), Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticosid từ rau má (Centella asiatica) ứng dụng sản xuất trà chức từ rau má, Luận văn thạc sĩ kỹ thuật công nghệ thực phẩm đồ uống, Đại Học Đà Nẵng, Đà Nẵng Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Y Học, tr 867-868 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 629 Võ Văn Chi - Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích Việt Nam, tập 1, NXB Giáo Dục, tr 339 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, II, NXB Trẻ, tr 477 Nguyễn Thị Hoài (2003), Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa hóa học rau má (Centella asiatica (L.) Urban), họ Hoa tán (Apiaceae), Luận văn thạc sĩ dược học, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Từ Minh Koóng (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập 1, NXB Y Học, tr 145 - 197 Nguyễn Thị Lập, Bùi Bá Minh (2014), "Tối ưu hóa qui trình chiết xuất phospholipid từ đậu nành phương pháp sử dụng carbon dioxid trạng thái siêu tới hạn", Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2, tr 4548 Nguyễn Trần Linh (2012), Một số phương pháp thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa ứng dụng bào chế, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tr 1-7, 29-40 10 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr 631-632 11 Võ Xuân Minh, Phạm Ngọc Bùng (2006), Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc tập 1, NXB Y Học, tr 204 - 206 12 Đỗ Quyên, Nguyễn Tiến Tiệp (2015), "Xây dựng phương pháp định lượng asiaticosid rau má sắc ký lỏng hiệu cao", Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học công nghệ, Đại Học Dược Hà Nội 13 Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng Dược liệu tập 1, Trung tâm thông tin Thư Viện Đại Học Dược Hà Nội, tr 126 - 162 14 Ngô Văn Thu (1990), Hóa Học saponin, Khoa Dược - Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, tr 109-110 15 Nguyễn Lê Tuấn, Huỳnh Minh Hùng (2000), Giáo trình Hóa học hợp chất thiên nhiên, Trường Đại Học Quy Nhơn - Khoa Hóa Học, tr 146-149 16 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 582-586 17 Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn (2015), "Tối ưu hóa chiết polyphenol từ ổi phương pháp bề mặt đáp ứng", Tạp chí khoa học phát triển, 13(7), tr 1144-1152 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18 Cesarone M., et al (2001), "Effects of the total triterpenic fraction of Centella asiatica in venous hypertensive microangiopathy: A prospective, placebo-controlled, randomized trial", Angiology, 52, pp S15-18 19 Cesarone M., et al (2001), "Microcirculatory effects of total triterpenic fraction of Centella asiatica inchronic venous hypertension: Measurement by laser Doppler, TcPO2-CO2, and leg volumetry", Angiology, 52, pp S45-8 20 Cheng C., M Koo (2000), "Effects off Centella asiatica on ethanol induced gastric mucosal lesions in rats", Life sciences, 67(21), pp 2647-2653 21 Cheng C L., et al (2004), "The healing effects Centella extract and asiaticosid on acetic acid induced gastric ulcers in rats", Life sciences, 74(18), pp 2237-2249 22 Chong N J., A.Z (2011), "A system review on the chemical constituents of Centella asiatica", Reseach Journal of Pharmaceutical, Biologycal and Chemical Sciences, 2(3), pp 445-459 23 Gnanapragasam A., et al (2004), "Protective effect of Centella asiatica on antioxidant tissue defense system against adriamycin induced cardiomyopathy in rats", Life sciences, 76(5), pp 585-597 24 Inhee M J., Shin J., Sung H Y., Kyoon H., Jae Y K., Hyung K P Sang S J., Min W J (1999), "Protective Effects of Asiaticoside Derivatives Against Beta-Amyloid Neuroscience Research 58, pp 417–425 Neurotoxicity", Journal of 25 Jayashree G., et al (2003), "Anti-oxidant activity of Centella asiatica on lymphoma-bearing mice ", Fitoterapia, 74(5), pp 431-434 26 Jie G., Lu X (2008), "Enrichment and purification of madecassoside and asiaticoside from Centella asiatica extracts with macroporous resins", Journal of Chromatography A, 1193(1-2), pp 136-141 27 Kim W J., Jaehoon K., Veriahsyah B., Jae D K., Youn W L., Seong G O., Tjandrawinata R R (2009), "Extraction of bioactive components from Centella asiatica using subcritical water", The Journal of Supercritical Fluids, 48(3), pp 211-216 28 Lee M K., et al (1999), "Asiatic acid derivatives protect cultured cortical neurons from glutamate-induced excitotoxicity ", Research communications in molecular pathology and pharmacology 108(1-2), pp 75-86 29 Lin Y C., et al (1999), "The effect of Tetrandrine and Extracts of Centella asiatica on Acute radiation Dermatitis in rats", Biol Pharm Bull, 22(7), pp 703-706 30 Matsuda H., et al (2001), "Inhibitors of aldose reductase and new triterpen and its oligoglycosid, centellasapogenol A and centellasaponin A, from Centella asiatica (Goku Kola)", J Heterocycles, 55(8), pp 1499-1504 31 Meulenbeld J G., Wujastuk D (2001), Studies on Indian Medical history, Motilal Banarsidass Publ., pp 201 32 Nakili K., et al (1992), "Effects of Centella asiatica fresh leaf aqueous extract on learning and memory and biogenic amine turnover in albino rats ", Fitoterapia, 63(3), pp 231-238 33 Nor Azah Mohd Ali, et al (2002), "Proceedings of Seminar on Medical Plants", FRIM, pp 34 O'Neil J M (2006), The Merck Index 14th edition, pp 137 35 Oyedeji O A., A A (2005), "Chemical composition and antibacterial activity of the essential oil of Centella asiatica growing in South Africa ", Pharm Biol, 43(3), pp 249-252 36 Pragada R., et al (2005), "Cardioprotective activity of Hydrocotyle asiatica L in ischemia-referfusion induced myocardial infarction in rats", Journal of ethnopharmacology, 93(1), pp 105-108 37 Quin L P., D R., Zhang W D., et al (1998), "Essential oil from Centella asiatica and its antipressant activity ", Di Er Jun Yi Da Xue Xue Bao, 19(2), pp 186-187 38 Rostagno A M., Prado J M (2013), Natural Product Extraction: Principles and Applications, Royal Society of Chemistry, pp 318-320 39 Si W C., Wen J W., Wei J L., Rui W., Yu L L., Yan N H., Xin L (2006), "Anxiolytic-like effect of asiaticoside in mice", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 85(2), pp 339–344 40 Suguna L., Sivakumar P., Chandrakasan G (1996), "Effects of Centella asiatica extract on dernal wound healing in rats", Indian Journal of Experimental Biology, 34(12), pp 1208-1211 41 Takayama K., Morva A., Fujikawa M., Hattori Y., Obata Y., Nagai T (2000), "Formula optimization of theophylline controlled-release tablet based on artificial neural networks", Journal of Controlled Release, 68(2), pp 175–186 42 Wang X S., et al (2003), "Structure and potential immunological activity of a pectin from Centella asiatica (L.) Urban ", Carbohydrate research, 338(22), pp 2393-2402 43 Wijeweeraa P., Arnasona J T., Koszyckib D., Meralib Z (2006), "Evaluation of anxiolytic properties of Gotukola – (Centella asiatica) extracts and asiaticoside in rat behavioral models", Phytomedicine, 13(9-10), pp 668-676 44 Wynn G S., Fougère B (2007), Veterinary Herbal Medicine, Elservier Health Science Publ., pp 568 45 Xin L., Yan N H., Si W C., , Wen J W., Na X., Shan C., Xing H L., Hua Z., Yue N L., Shuang L., Ming Y., Yan D (2008), "Antidepressant-like effect of asiaticoside in mice", Pharmacology Biochemistry and Behavior, 89(3), pp 444-449 46 Y Huang (2004), "Asiaticosid inducing apoptosis of tumor cells and enhancing anti-tumor activity of vincristine", Chinese Journal of cancer, 23(12), pp 1599-1604 47 Zainol M K., Yusof S., et al (2003), "Antioxidant activity and total phenolic compounds of leaf, root and petiole of four acessions of Centella asiatica (L.) Urb", Food Chem, 81(4), pp 575-581 TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP 48 Darnis F et al (1978), "Use of a titrated exract of Centella asiatica in chronic hepatic disorders(author's transl)", La semaine des hopitaux: organe fonde par l'Asaciation d'enseignement medical des hopitaux de Paris, 6, pp 232-247 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học dƣợc liệu: Phụ lục 2: Giấy chứng nhận mã số tiêu bản: Phụ lục 3: Hình ảnh sắc ký đồ mẫu cao tinh chế theo phƣơng pháp - Phƣơng pháp chiết phân đoạn - Phƣơng pháp dùng nhựa hấp phụ lỗ xốp lớn [...]... 1.2.5 Một số nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid từ rau má Những nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và tinh chế asiaticosid đã được nghiên cứu và công bố rộng rãi bởi các nhà khoa học nước ngoài Tuy nhiên, việc nghiên cứu chiết xuất asiaticosid từ rau má tại Việt Nam vẫn chưa được quan tâm và chú trọng 14 Những nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế asiaticosid còn chưa thống nhất về nhiều... xuất hoạt chất từ dược liệu rau má Các yếu tố mô hình chiết xuất gồm: Ba thông số đầu vào là nồng độ ethanol (X 1), tỷ lệ dung môi/dược liệu (X 2) và số lần chiết (X 3); hai thông số đầu ra là hàm lượng asiaticosid (Y 1) và hàm lượng cắn chiết được (Y 2) Cân chính xác khoảng 150 (g) dược liệu rau má cho vào bình cầu dung tích 2 lít và tiến hành thí nghiệm theo mô hình thu được Mô hình thí nghiệm và kết quả... lượng asiaticosid bằng phương pháp HPLC với pha động là methanol : nước (1% triflouroacetic acid) = 60 : 40, bước sóng phát hiện 220 nm, tốc độ 15 dòng 1,5 ml/phút Hàm lượng asiaticosid thu được theo nghiên cứu là 9,803 mg/g [1] Những nghiên cứu về chiết xuất rau má tại Việt Nam vẫn đang còn hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về tác dụng dược lý, thành phần hóa học của rau má và asiaticosid, mặc dù rau má. .. dụng trong sản xuất công nghiệp Phương pháp chiết xuất: Chiết hồi lưu vì dung môi ethanol dễ bay hơi, sử dụng phương pháp chiết hồi lưu sẽ làm giảm hao hụt dung môi khi chiết 20 Sơ đồ phương pháp: Dược liệu rau má Sấy, nghiền, rây Bột thô rau má Ethanol, đun hồi lưu Dịch chiết rau má Thu hồi dung môi Dịch chiết đậm đặc Sấy đến cắn Cao rau má Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất dược liệu rau má Bước 2: Xác định... pháp GC-MS, đã xác định được 45 thành phần từ tinh dầu rau má, trong đó caryophyllen, farnesol và emelen là các thành phần chính [37] Nghiên cứu của Nor Azah Mohd Ali và cộng sự tại Malaysia (200 2) và nghiên cứu của Oyedeji và cộng sự tại Nam Phi (200 5) cho thấy βcaryophyllen là thành phần chính trong tinh dầu của rau má [33], [35] Như vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu được thực hiện bởi nhiều tác giả... nghiên cứu chiết xuất tối ƣu Việc chiết xuất và phân lập các hoạt chất từ dược liệu thường bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: Dung môi, thiết bị, điều kiện chiết xuất (tỷ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ, áp suất, thời gian, pH, ) [7], [11] Vì vậy, cần thực hiện tối ưu hóa để hiệu suất của quá trình chiết xuất lớn nhất Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lập và cộng sự (201 4), đã tối ưu hóa quy trình chiết xuất. .. giải khát Ở Việt Nam, cây rau má chủ yếu mới được khai thác sử dụng tại chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [16] 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến Bộ phận dùng của rau má là toàn cây Rau má có thể thu hái quanh năm Để làm thuốc, rau má thường dùng tươi hoặc sao vàng [10] Ngoài ra, rau má cũng được sử dụng như loại rau thường ngày Rau má được dùng xay nhỏ hay giã nát, lọc lấy nước, thêm đường... dẫn xuất của asiaticosid Asiaticosid kích thích hệ reticuloendothelial nên sức đề kháng của cơ thể mạnh hơn [24] Trong nghiên cứu của Wijeweera P và cộng sự (200 6) đã chứng minh tác dụng giải lo âu của dịch chiết rau má và asiaticosid trên mô hình thí nghiệm trên chuột [43] Nghiên cứu của Si W C và cộng sự (200 6) cũng đã chứng minh được tác dụng tương tự của asiaticosid [39] Công trình nghiên cứu của... hồi 70,4%; hàm lượng asiaticosid tăng 2,0 – 21,5%, hiệu suất thu hồi 72,0% [26] Trong nghiên cứu của Kim J W và cộng sự (200 9) đã thực hiện chiết xuất asiaticosid và acid asiatic từ dược liệu rau má bằng nước dưới tới hạn Với điều kiện tối ưu là 40 MPa và 250°C, hiệu suất của acid asiatic là 7,8 mg/g dược liệu và của asiaticosid là 10 mg/g dược liệu Hiệu suất thu được khi chiết xuất với nước dưới tới... sau đó sấy ở 40°C và tán nhỏ thành bột thô + Mẫu rau má được làm tiêu bản, giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại Học Dược Hà Nội (phụ lục 1, phụ lục 2) Hình 2.1 Dược liệu rau má - Hóa chất: + Asiaticosid chuẩn được chiết xuất từ Centella asiatica (L. ) Urb do công ty Shanghai Tauto Biotech cung cấp, độ tinh khiết đạt 98% + Dung môi dùng cho quá trình chiết xuất: Ethanol, methanol,