Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm t

MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 BA KÍCH 3

1.1.1 Tên khoa học 3

1.1.2 Mô tả cây 3

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến 4

1.1.4 Công dụng 5

1.1.5 Thành phần 6

1.2 NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID 8

1.3 MONOTROPEIN 9

1.3.1 Đặc điểm và tính chất 9

1.3.2 Tác dụng dược lý của monotropein 10

1.4 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU 11

1.4.1 Vài nét về chiết xuất dược liệu 11

1.4.2 Vài nét về phân lập và tinh chế 12

1.5 CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU 12

1.5.1 Vài nét về chất chuẩn 12

1.5.2 Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu 14

1.5.3 Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích 16

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 17

1.6.1 Sắc ký lớp mỏng 17

1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 20

1.6.3 Phổ khối (MS) 23

1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 24

1.6.5 Sắc ký cột 25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Nguyên liệu 28

2.1.2 Chế phẩm 28

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 29

2.2.2 Dung môi, hoá chất 30

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.3.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích 31

2.3.2 Định tính, xác định cấu trúc monotropein tinh chế được 32

2.3.3 Xác định hàm lượng monotropein tinh chế được 32

2.3.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong Ba kích 33

2.3.5 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích 35

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ

BA KÍCH 37 3.1.1 Chiết xuất iridoid glycosid 37 3.1.2 Phân lập và tinh chế monotropein từ hỗn hợp các iridoid glycosid 39 3.2 ĐỊNH TÍNH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC 42 3.3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC 45 3.3.1 Xác định tinh khiết bằng HPLC 45 3.3.2 Xác định hàm ẩm bằng TGA 47 3.4 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG BA KÍCH 48 3.4.1 Chuẩn bị mẫu 48 3.4.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 48 3.4.3 Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích 51 3.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích 52 3.5 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA BA KÍCH 60 3.5.1 Chuẩn bị mẫu 60 3.5.2 Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích 61 3.5.3 Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích 62 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 68

4.1 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ, PHƯƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI 68

4.1.1 Về chiết xuất, phân lập và tinh chế 68

4.1.2 Cấu trúc monotropein tinh chế được 68

4.1.3 Định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế phẩm chứa Ba kích bằng HPLC 68

4.2 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 69

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

1 KẾT LUẬN 71

2 KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lượng

TGA Phân tích nhiệt trọng lượng

USP Dược điển Mỹ

UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến

VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1.1 Một số chất nhóm anthraquinon trong Ba kích 6

3.1 Kết quả xác định hàm ẩm monotropein bằng TGA 47

3.2 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 55

3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với mẫu Ba kích 57

3.5 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian với mẫu thử Ba

kích

58

3.6 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử Ba kích 59

3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại với chế phẩm Hatkick 65

3.9 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian định lượng

monotropein trong chế phẩm Hatkick

66

3.10 Kết quả đánh giá độ đúng với chế phẩm Hatkick 67

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Cây Ba kích (Morinda officinalis How) mẫu trồng tại Lục

2.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân

dùng trong nghiên cứu

30

3.1 SKĐ định tính Ba kích bằng sắc ký lớp mỏng 38

3.7 Phổ khối phân giải cao của monotropein tinh chế được 44

3.8 Giá trị độ tinh khiết píc tại vị trí xuất hiện píc monotropein 45

3.9 SKĐ monotropein tinh chế so sánh với mẫu trắng 46

3.11 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động 49

3.13 SKĐ của mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích và mẫu trắng 52

3.14 Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích 53

3.15 Chồng phổ UV-Vis pic monotropein của chuẩn và pic

monotropein trong mẫu thử Ba kích

3.20 Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Hatkick 63

3.21 Chồng phổ UV-Vis monotropein chuẩn và mẫu thử Hatkick 64

3.22 Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ chế

phẩm chứa Ba kích

64

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Ngay tại Việt Nam, trong mấy năm gần đây việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng Thị trường dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng loại Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ

Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ nguồn thu hái tự nhiên, trồng trọt và nhập khẩu Nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số lượng lại lớn khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn, kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng không tốt đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược liệu Trong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều khó khăn do thiếu chất chuẩn với vai trò là hoạt chất hoặc chất đặc trưng cho dược liệu Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không ổn

định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng

thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết

Dược liệu Ba kích (sau đây gọi chung là Ba kích) với những tác dụng sinh học quý giá như làm tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm, tăng cường khả năng sinh dục… từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian theo phương thức truyền thống là ngâm rượu hoặc trong các bài thuốc

đông y Theo danh mục số đăng ký thuốc trong nước cấp SĐK từ 2010 đến

hết tháng 4/2016 hiện có 36 chế phẩm có thành phần Ba kích gồm: dạng viên hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hoàn mềm và dược liệu, ngoài ra còn rất nhiều thực phẩm chức năng chứa Ba kích cũng đang được cấp phép lưu hành trên thị trường [4]

2

Thành phần hóa học chính của Ba kích là anthranoid và irridoids, trong

đó có một lượng đáng kể là monotropein (một chất thuộc nhóm iridoids) Tuy

nhiên, hiện nay chúng ta chưa thiết lập được các chất chuẩn là hoạt chất đặc trưng cho Ba kích trong đó có monotropein để kiểm tra dược liệu này

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng dược liệu nói chung và chế phẩm có chứa Ba kích nói riêng, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ

Ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn” với các mục tiêu:

- Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích có độ tinh khiết đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

- Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế phẩm chứa Ba kích

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 BA KÍCH

1.1.2 Mô tả cây

Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn Cành non có cạnh Lá mọc

đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6

cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,8-1,5cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành

ống ngắn, nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi

chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh Mùa hoa: tháng 5-6 Mùa quả: tháng

7-10 [5],[6],[8],[15]

Hiện nay Ba kích vẫn bị nhầm lẫn: do hình dáng giống với Ba kích lông

(Morinda cochinchinensis Lour), cây mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost) hoặc đôi khi do tên gọi Dây ruột gà còn dùng chỉ Sam trắng - Bacopa monnieri (L.) Pennell (Herpestis monnieri (L.) Rothm.) Rau đắng biển, thyme - leaved gratiola (Anh), họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis chinensis Osbeck (C.minor L.) Họ Mao lương Ranunculaceae [16],[17]

4

Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How)

mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi

núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phú, Hà Tây, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang Ba kích cũng mọc nhiều ở phía nam Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây… Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay

Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae)

Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi

không dính tay, đập nhẹ cho bẹt, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [3],[5],

[16]

- Đối với bệnh nhân nam giới có hoạt động sinh dục không bình thường,

Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp, đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu và thưa Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi tình dục, không thấy có tác dụng kiểu androgen Có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái vô sinh tương đối và suy nhược

thể lực

- Đối với người tuổi già, bệnh nhân có biểu hiện mệt mỏi, kém ăn ít ngủ, người gầy yếu, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm giác chủ quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon miệng và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi dùng Ba kích dài ngày các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt

Một số nghiên cứu cho th

vitamin B1 có kết qu

- Trong nhân dân, Ba kích là m

chữa các bệnh liệt dươ

không đều phong thấ

u cho thấy nhóm bệnh nhân dùng phố

t quả tốt hơn nhóm dùng Ba kích đơn thuầTrong nhân dân, Ba kích là một vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng

t dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, ph

ấp cước khí, gân cốt yếu mềm, lưng gối đ

Theo các nghiên cứu đã được công bố, thành phần hóa h

nthranoid (anthraquinon) và iridoid [17],[23],[27],[28],[31],[32]

Ngoài ra trong Ba kích còn có một số hợp chất đường, h

t saponintriterpen kiểu ursan, 1 vài acid amin…

ng 1.1: Một số chất nhóm anthraquinon trong Ba kích

Tên khoa học Công thức phân tử Công th

dimethoxyanthraquinone

-2,4-C16H12O6

methoxyanthraquinone

ng, hợp chất sterol,

t nhóm anthraquinon trong Ba kích

Công thức cấu tạo

8

1.2 NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID

Iridoid là một nhóm các monoterpenoid glycosid thường được gặp nhiều nhất trong thực vật, cho đến nay người ta đã biết đến trên 600 chất thuộc nhóm này [3]

Về cấu tạo Iridoid là những glycosid có bộ khung của phần aglycon gồm

2 đơn vị isopren Chúng gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran Khi tạo thành glucosid, phần đường thường gặp là glucose nối vào vị trí số 1 trên vòng hydropyran theo dây nối acetal [3],[7]

Iridoid gồm các nhóm:

- Iridoid có aglycon gồm đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid,

gardosid trong quả Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), monotropein trong rễ Ba kích (Morinda officinalis How)

- Iridoid có phần aglycon không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol

trong Sinh địa (Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch

- Iridoid có phần aglycon trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại

(Plumeria rubra L var acutifolia (Poir) Bailay)

Iridoid glycosid có tính chất dễ tan trong nước, cồn loãng, methanol Thường dùng cồn 50% hoặc methanol để chiết xuất Dưới tác dụng của enzyme có sẵn trong cây, iridoid glycosid bị biến đổi thành các sản phẩm màu

đen Ngoài enzyme, iridoid glycosid cũng dễ bị thủy phân bằng acid Dưới tác

dụng của kiềm NaOH, Ba(OH)2 thì các nhóm ester bị cắt

Để định tính nhóm hoạt chất này, người ta thường dùng phương pháp

sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng (SKLM), ngoài ra có thể đo quang phổ hồng ngoại Phần lớn các hợp chất iridoid có nhóm mang màu –O-C=C-CO-O- nên thể hiện băng hấp thu trong vùng tử ngoại ở 233-238 Trên phổ IR các hợp

thù du), Valerinaceae, Gentianaceae

Oleaceae, Ericaceae, Loganiaceae (mã ti

nhiên các hợp chất iridoid hay gặp trong các h

ơ lông, Ba kích), Euphorbiaceae, Apocynaceae (thông thiên,

), Plantaginaceae (mã đề), Verbenaceae (cỏ roi ngự

thù du), Valerinaceae, Gentianaceae (long đởm), Caprifoliaceae (kim ngân), Oleaceae, Ericaceae, Loganiaceae (mã tiền), Scrophulariaceae (sinh

Monotropein có công thức hóa học như sau [3]:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của monotropein

) và 1660 cm-1 (-C=C-O)

p trong các họ thực vật: lông, Ba kích), Euphorbiaceae, Apocynaceae (thông thiên,

ựa), Cornaceae (sơn

m), Caprifoliaceae (kim ngân), n), Scrophulariaceae (sinh địa,

(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-

Glucopyranosyloxy)-a monotropein

+ Tan tốt trong nước, ethanol và methanol

+ Cực đại hấp thụ (trong ethanol): 235nm

1.3.2 Tác dụng dược lý của monotropein

Các nghiên cứu gần đây cho thấy monotropein có tác dụng chống viêm Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), yếu tố hoại tử u α (TNF-α) và interleukin-1β (IL-1β) mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 gây bởi lipopolysaccharide (LPS) [25] Việc xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác dụng kết dính ADN của nhân κB (NF-κB) Monotropein cũng ngăn chặn sự phosphoryl hóa và suy giảm ức chế κB-α (IκB-α) và do đó hoán vị NF-κB Trong mô hình viêm ruột kết gây bởi dextran sulfate sodium (DSS), monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh (DAI), hoạt động myeloperoxidase (MPO) và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông qua ngăn chặn sự hoạt hóa NF-κB ở niêm mạc ruột [24]

Tóm lại, những phát hiện này gợi ý tác dụng chống viêm của monotropein chủ yếu liên quan đến sự ức chế các biểu hiện của chất trung gian gây viêm, thông qua khử hoạt tính NF-κB và hỗ trợ vai trò chữa bệnh của nó trong viêm ruột kết [24]

11

1.4 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU

1.4.1 Vài nét về chiết xuất dược liệu

Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị

Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng

cụ chiết và phương pháp chiết

Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau [9],[11]:

- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội

- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục

- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng

- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)

- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp ngấm kiệt

- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm; Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy

Các iridoid glycosid nói chung và monotropein nói riêng thường dễ tan trong nước, cồn loãng hoặc methanol Thường dùng nước hoặc cồn 50% làm dung môi chiết xuất, sử dụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký, chiết dung môi Ngoài ra, methanol cũng được dùng để hạn chế tạp

12

Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh chế khác nhau phù hợp Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp

1.4.2 Vài nét về phân lập và tinh chế

Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau [1],[9],[11]:

- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau

Các chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã được xác định là

đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh

học Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [2]:

- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định tính, định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến, quang phổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc

ký

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng

13

- Các phép thử sinh học

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng

Ngoài ra, các chất đối chiếu còn được dùng để [14]:

- Thẩm định một phương pháp mới

- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác

- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa

Trong các phép thử định tính, định lượng, xác định tạp sử dụng các kỹ thuật: sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao, quang phổ hồng ngoại, quang phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang… được sử dụng phổ biến trong công tác kiểm nghiệm và giám sát chất lượng thuốc hiện này đều dựa nhiều vào chất chuẩn

Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu (EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS)

được thiết lập với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới

và được sản xuất tại các trung tâm như:

- Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard Committee);

- Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);

- Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances)

- Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp tác của các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa các nước ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn

1.5.2 Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu

Bất cứ quốc gia nào cũng đều cần phải thiết lập và sản xuất các chất chuẩn đối chiếu hóa học ở mức quốc gia giúp cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc Khi sử dụng một chất nào đó từ dược liệu để làm thuốc thì cần phải thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học (gọi tắt là chất chuẩn) để kiểm nghiệm chất đó

Trong những năm gần đây, có một số chất chuẩn là những dược chất đặc trưng của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định Trong số

đó, chỉ có một số ít chất chuẩn có thể tiếp cận mua được, nhưng thường có giá

rất đắt (thường là đắt hơn khoảng 10 lần so với dược chất tương ứng) Chất chuẩn có độ tinh khiết càng cao thì giá càng đắt

Dược điển Mỹ hiện đang duy trì một số chất chuẩn đối chiếu hóa học của các hợp chất chiết xuất từ thực vật như quercetin USP CRS, rutin USP CRS, silybin USP CRS… Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm Trung Quốc (NICBPB), Viện Kiểm nghiệm thuốc Hàn Quốc và Viện kiểm nghiệm thuốc Nhật Bản cũng đã thiết lập được nhiều chất chuẩn đối chiếu hóa học chiết ra từ dược liệu dùng cho kiểm nghiệm dược liệu, thuốc có nguồn gốc dược liệu và thuốc đông dược Chất chuẩn quốc gia chiết ra từ dược liệu

được coi là tài sản quốc gia, qui trình thiết lập chất chuẩn quốc gia thường được bảo hộ và giữ bí mật Chính vì vậy, những chất chuẩn này ở các nước

15

rất ít khi bán ra ngoài, nếu có bán thì phải xin ý kiến nhà chức trách Hiện nay, Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và sinh phẩm Trung Quốc chủ trương không bán chất chuẩn chiết từ dược liệu mà chỉ trao đổi chuẩn với các đối tác như Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Việt Nam

Tại Việt nam, cung cấp chất chuẩn chính thức gồm:

- Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương (VKNTTW) đã cung cấp hơn

300 chất chuẩn tân dược và 10 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid chlorogenic, conessin, holothurin B, kaemferol, malloapeita, myricetin, nuciferin, phyllanthin và sylibin [20]

- Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP HCM (VKNT TP.HCM) cung cấp 213

chất chuẩn tân dược và 18 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid aristolochic, acid gallic, acid oleanolic, asiaticosid, berberin HCl, colchicin, curcumin, damnacanthal, diacerein, diosgenin, epigallocatechin (ECGC), ginsenosid- Rb1, ginsenosid-Rg1, hesperidin, majonosid-R2, quercetin, rutin, syllibin

[19]

Hiện nay, nếu VKNTTW và VKNT TP.HCM không chủ động được nguồn chất chuẩn, đặt biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược nói chung và công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nói riêng sẽ gặp nhiều khó khăn, có thể kể đến như:

- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và toàn diện

- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ

- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó không giúp được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng và chữa bệnh

Theo Dược điển Vi

giản và chưa được ti

đại diện [1]

Qua tham khảo các t

trình nào nghiên cứu

1.5.3.2 Tình hình nghiên c

Dược điển Trung Qu

đường nystose Trong chuyên lu

hàm lượng đường nystose s

dùng detector tán xạ

việc sử dụng detector tán x

(β-D-Fruf-(2->1)

16

ng lý do trên cho thấy ngành Dược đứng trước nhi

n chất chuẩn và xây dựng được Quỹ ch

t chuẩn chiết ra từ dược liệu nhằm đáp

t lượng thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao s

1.5.3 Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích

1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

ợ điển Việt Nam (DĐVN), chuyên luận Ba kích c

êu chuẩn về mặt hóa học, chỉ đưa vào v

ảo các tài liệu cho thấy đến nay, trong nư

u về chiết xuất và tinh chế monotropein

.2 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước

n Trung Quốc tiêu chuẩn hóa Ba kích dự

ng nystose Trong chuyên luận liên quan, chỉ tiêu định l

ng nystose sử dụng phương pháp sắc ký l

ạ bay hơi [22], trong khi DĐVN chưa có ch

ng detector tán xạ bay hơi cũng chưa phổ biến

Hình 1.4: Đường nystose

>1)-β-D-Fruf-(2->1)-β-D-Fruf-(2< >1)

c nhiệm vụ cấp bách chất chuẩn quốc gia

đáp ứng kịp thời công

ăm sóc và nâng cao sức

a kích

ận Ba kích còn khá đơn

ưa vào với một số chỉ tiêu

trong nước chưa có công onotropein làm chất chuẩn

ựa vào hàm lượng

nh lượng kiểm soát

c ký lỏng hiệu năng cao

ưa có chỉ tiêu này và

>1)-α-D-Glup)

17

Nhìn chung, việc kiểm nghiệm Ba kích và các chế phẩm đông dược chứa

Ba kích gặp nhiều khó khăn về mặt phương tiện kỹ thuật cũng như đòi hỏi kinh phí cao, nên ở thời điểm hiện tại không phù hợp với mặt bằng chung của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam Bên cạnh đó nhu cầu thực tế cần có chất chuẩn để kiểm nghiệm Ba kích ngày càng tăng đòi hỏi công tác nghiên cứu, thiết lập chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm Ba kích dần trở lên cấp thiết

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 1.6.1 Sắc ký lớp mỏng

1.6.1.1 Nguyên tắc

SKLM là một kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa; pha động là một hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất cần tách Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần trong hỗn hợp mẫu thử) di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách và phân bố khác nhau trên lớp mỏng Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng, ở đó, các thành phần của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi của dung môi động Cơ chế của sự tách có thể là hấp phụ phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp nhiều cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lên ít hoặc nhiều, tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [2],[18]

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi tử ngoại ở các bước sóng 254nm, 366nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng (thiết bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả

18

kiến của chất cần phân tích) Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [10],[13]

1.6.1.2 Các đại lượng đặc trưng

* Hệ số lưu giữ R f

Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động

d

dRM

1.6.1.3 Ứng dụng

* Định tính

Dựa vào giá trị Rf: mỗi có một giá trị Rf đặc trưng trong một hệ dung môi pha động Khi định tính thường so sánh với chất chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện

19

* Thử tinh khiết

Dùng SKLM để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện các vết

lạ ngoài vết chính của hợp chất khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau Đây là một ứng dụng rất phổ biến của SKLM

* Định lượng

Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể

áp dụng SKLM để định lượng

Một số phương pháp dùng để định lượng bằng SKLM [10]:

- Phương pháp định lượng sau khi tách các chất ra khỏi bản mỏng:

Chuyển tất cả vết cần phân tích trên bản mỏng vào một dung môi thích hợp Sau khi tinh khiết hoá mẫu đo bằng các cách khác nhau, tiến hành thực hiện các phép đo thích hợp như đo quang, đo huỳnh quang, cực phổ… Tuy nhiên phương pháp hiện nay ít dùng vì có nhiều trở ngại, sai số lớn, lại mất nhiều thời gian

- Phương pháp định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Dựa trên nguyên tắc đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng hai kỹ thuật:

+ Đo mật độ vết bằng densitometer: nguyên tắc của phương pháp này là chiếu chùm tia sáng vào vết sắc ký trên bản mỏng và đo cường độ ánh sáng truyền qua; cường độ ánh sáng phản xạ; cường độ huỳnh quang + Xử lý hình ảnh với camera kĩ thuật số: Quét bản mỏng với các hệ thống phân tích hình ảnh, đặc biệt camera kĩ thuật số có độ phân giải cao

để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Sau đó các dữ liệu ảnh được xử lý

bằng máy tính

20

1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.6.2.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động

là một chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất mang dạng rắn hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ [2],[12]

Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.6.2.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

* Thời gian lưu

- Thời gian lưu (tR): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào

hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định

21

* Độ phân giải R

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên

một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

−

= +

−

=

1

1 4

) (

18 , 1 ) (

2

'

'

2 / 1 2

/ 1

, , ,

,

k

k W

W

t t W

W

t t R

B B

A B

A R B R

A B

A R B R s

N

α α

với: W là độ rộng đáy pic

Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu

=

trong đó:

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a: khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong phép định lượng thì yêu cầu AF nằm trong khoảng 0,8-2

N

2 / 1

54 , 5 16

2 2

h

N

2 2

28 , 6

2 π

trong đó: h: chiều cao pic A: diện tích của pic

22

1.6.2.3 Ứng dụng

* Định tính

Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở

của phép thử định tính Trên các máy HPLC hiện đại với detector diod array

(DAD) ta có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ với

nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match:

- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn

toàn

- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

- Hệ số Match > 0,900 thì chỉ ra 2 phổ tương tự

- Hệ số Match < 0,900 thì chỉ ra 2 phổ khác nhau

Hơn thế nữa, với detector khối phổ (MS) nhờ thư viện phổ mà không cần

chất chuẩn ta cũng có thể định tính được nếu như chất thử có mặt trong thư

viện phổ này

* Định lượng

Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và pic thử (diện tích

hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của

phép định lượng

- Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là:

+ Phương pháp dùng chuẩn ngoại

+ Phương pháp dùng chuẩn nội

+ Phương pháp thêm chất chuẩn

+ Phương pháp chuẩn hoá diện tích

* Thử tạp chất

Về cơ sở của cách thử tạp chất cũng giống như định lượng Ngoài ra, đối

với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp

Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg) Trong quá trình đó, chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối

1.6.3.2 Ứng dụng

* Xác định đồng vị

Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong mẫu

* Định tính

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử

M+, (M+1)+, (M+2)+ Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường

độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được

công thức nguyên của chất phân tích

- Trong phân tích dược thường sử dụng kết nối GC/MS hoặc LC/MS Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

24

* Xác định công thức cấu tạo

Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion

hóa thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR, phổ

IR

* Định lượng

Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng phương pháp thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ

Trong phân tích thường dùng kết nối LC/MS, GC/MS hoặc CE/MS để

có thể tăng cường tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích Nét nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy Giới hạn phát hiện có thể lên tới 10-14 gam Nên thường dùng kỹ thuật này để phân tích hàm lượng vết trong mẫu thành phần phức tạp

1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1.6.4.1 Nguyên tắc

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay

đổi từ trường sẽ dẫn tới hấp thu năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện

phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng nguyên tử là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR Các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ

điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó

25

1.6.4.2 Các đại lượng đặc trưng

* Độ dịch chuyển hóa học δ:

Độ dịch chuyển hóa học δ là sự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt

nhân hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn

)

=

với: νmau: tần số cộng hưởng của proton của mẫu

νTMS: tần số cộng hưởng của proton của chất chuẩn nội tetramethylsilan

νmay: tần số của phổ kế

* Hằng số tương tác spin-spin (J):

Hằng số tương tác spin-spin (J) là khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin Trị số J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ e ở vùng lân cận của 2 proton tương tác

* Diện tích dưới tín hiệu

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu

1.6.4.3 Ứng dụng

Phổ NMR thường được ứng dụng trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ kết hợp với các thông tin của các loại phổ khác như phổ khối, phổ IR, phổ UV

1.6.5 Sắc ký cột

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong các ống hình trụ gọi là "cột" Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi

1.6.5.1 Cột

Cột là những ống thủy tinh hình trụ dài 30 - 70 cm, đường kính 1 - 5 cm,

đầu dưới có 1 vòi thủy tinh có khóa để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi

Các hóa chất dùng cho sắc ký cột đều phải được tiêu chuẩn hóa để việc

sử dụng dễ dàng, thuận lợi (Ví dụ: Silica gel 60 Merck: quy định cỡ hạt 0,063

- 0,200 mm)

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều

ở mọi điểm trong cột thành một khối đồng nhất

1.6.5.3 Dung môi

Nói chung các hệ dung môi dùng cho SKLM và sắc ký giấy đều có thể

ứng dụng vào sắc ký cột Tuy vậy đối với các dung môi có độ sôi quá thấp

(ether), hoặc có mùi khó chịu, hoặc độc thì không dùng làm dung môi rửa trong sắc ký cột

Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột là: n-hexan, cloroform, aceton, ethanol, methanol, butanol, nước

27

Sau khi rửa giải, dụng cụ dùng để hứng là ống nghiệm (thường là 20ml) Các ống nghiệm đều được đánh số từ 1 trở đi, và sắp xếp sẵn trong các giá theo thứ tự để khỏi nhầm lẫn trong quá trình tập hợp Các phân đoạn sau khi phân tích và tập hợp chung, tùy theo thể tích mỗi phân đoạn mà xử lý bằng cách cất thu hồi trong bình cầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiên trên nồi cách thủy

1.6.5.4 Ứng dụng:

Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột là tách các chất ra khỏi

hỗn hợp Tùy thuộc bản chất của chất phân tích để lựa chọn cột tách và pha

động rửa giải thích hợp với mục đích thu được chất phân tích có độ tinh khiết

cao

thể tiết hóc môn sinh d

Giúp tăng cường sinh l

căng thẳng thần kinh, phòng ng

28

NG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C

NG NGHIÊN CỨU

do Công ty Cổ phần Lâm Y Dược Bắc Sơn tr

c Giang được dùng để chiết xuất, phân l

n Ba kích do Viện Kiểm nghiệm thuốc TW thi

ức năng Hatkich – do Công ty Cổ phần

ất (số lô: 282913) Thành phần:

(Radix Morindae officinalis) 400 mg

nh (Eurycoma longifolia) 200 mg (Radix Panax ginseng) 50 mg

vđ 1 viên nangng: Giúp bồi bổ nguyên khí, bổ thận tráng dươ

t hóc môn sinh dục nam, giúp tăng cường khả năng sinh lý

ng sinh lực cho hoạt động thể lực và trí óc, gi

n kinh, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị chứng mãn d

29

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng

cụ được quản lý theo hệ thống quản lý chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, phòng nghiên cứu trọng điểm Hóa học - Đại học Quốc gia Hà Nội và phòng nghiên cứu Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam gồm:

- Máy HPLC SHIMADZU UFLC

- Máy sắc ký lỏng khối phổ LC ESI orbitrap (Thermo LTQ Orbitrap XL)

- Máy TGA-DSC 1, Mettler Toledo

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR-BRUKER-500MHz

- Cân kỹ thuật SARTORIUS BP 310S

- Cân phân tích SARTORIUS ED224-S

- Tủ sấy MEMMERT UL 40

- Tủ bảo quản lạnh WESTPOINT

- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100

- Nồi cách thủy, bộ cất quay chân không BÜCHI V-850

- Tủ hốt

- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45µm

- Pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác

- Bộ dụng cụ sinh hàn

ối phổ LC ESI Orbitrap

Thermo LTQ Orbitrap XL), Phòng nghiên cứu

c, Đại học Quốc gia Hà Nội

Thiết bị cộng hư Bruker Avance AM500FT BioSpin NMR

biển - Viện KH&CN V

ị sắc ký lỏng khối phổ và cộng hưởng t

trong nghiên cứu

Dung môi, hoá chất

t, thuốc thử dùng trong nghiên cứu đề tài đ

t phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC, đáp

ng trong phòng thí nghiệm đạt chứng nhận về hệ thống qu

và GLP

ảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong nghiên c

Tên dung môi, hóa chất Nguồn gốc

ng hưởng từ hạt nhân Avance AM500FT- NMR BioSpin NMR, Viện Hóa sinh

KH&CN Việt Nam

ng từ hạt nhân dùng

tài đạt tiêu chuẩn tinh

t dùng cho HPLC, đáp ứng yêu cầu sử

Tinh khiết phân tích

Tinh khiết phân tích

Tinh khiết phân tích

Tinh khiết phân tích

Dùng cho HPLC

31

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích

Ba kích đem sấy ở nhiệt độ 60oC trong 24h được kiểm tra chất lượng theo chuyên luận Ba kích - DĐVN IV Sau đó sử dụng phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế như sau:

2.3.1.1 Chiết xuất

- Chiết xuất: dùng methanol (MeOH) kết hợp với lắc siêu âm

- Xác định lượng chất chiết được trong methanol từ dược liệu bằng phương pháp cân, kết quả tính theo công thức sau:

trong đó:

X : hàm lượng chất chiết được

n: khối lượng cắn thu được (g)

m: khối lượng dược liệu đem chiết (g)

- Tiếp tục cho phân đoạn thu được chạy qua cột silica gel (Merck) và kiểm tra phân đoạn chứa monotropein bằng MS

- Tinh chế bằng cách sử dụng cột pha đảo YMC-C18 với hệ dung môi rửa giải 100% nước

- Tinh chế lại sử dụng cột sephadex LH20 với dung môi rửa giải 100% nước

32

- Lọc rửa kết tinh

2.3.2 Định tính, xác định cấu trúc monotropein tinh chế được

Kết hợp các phương pháp phân tích hiện đại như khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân, phân tích các dữ liệu thu được từ các loại phổ này để khẳng định cấu trúc chất tinh chế được phù hợp với cấu trúc của monotropein

* Định tính trên thiết bị phổ khối hiện đại: thiết bị phổ khối và thiết bị phổ khối phân giải cao ESI MS Orbitrap

Tiến hành tiêm trực tiếp dịch thu được từ chiết pha rắn vào detector khối phổ, chế độ ion hóa –ESI, lựa chọn chế độ quét toàn thang để xác định mảnh

Khảo sát sự xuất hiện của các píc tạp trên sắc ký đồ tại các bước sóng cơ bản: 210nm, 254nm, 350nm So sánh với mẫu trắng để đánh giá sự có mặt hay không của píc tạp