Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất kaempferol 3 o d glucopyranoside từ hoa đu đủ đực thu hái tại quảng nam – đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ CHUNG THÚY LY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT KAEMPFEROL-3-O-β-D-GLUCOPYRANOSIDE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC Đà Nẵng - Năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ CHUNG THÚY LY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT KAEMPFEROL-3-O-β-D-GLUCOPYRANOSIDE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC THU HÁI TẠI QUẢNG NAM – ĐÀ NẴNG LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Đà Nẵng - Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Đà Nẵng, ngày tháng năm 2020 Tác giả LÊ CHUNG THÚY LY LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập rèn luyện Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHĐN, biết ơn kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến khoa Ho Học thu c Trƣờng Đại học Sƣ phạm c c Thầy C khoa nhiệt tình hƣớng dẫn, giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt qu trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện đề tài kh a luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới C Đ Thị Thúy Vân, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ em qu trình thực c ng nhƣ hồn thành đề tài kh a luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện đ cho em tìm tịi, nghiên cứu đ hồn thành đề tài Tuy nhiên điều kiện lực thân hạn chế, chuyên đề nghiên cứu khoa học chắn kh ng tr nh khỏi thiếu s t Kính mong nhận đƣợc đ ng g p ý kiến c c thầy c gi o, bạn bè đồng nghiệp đ nghiên cứu em đƣợc hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng ph p nghiên cứu Phƣơng ph p nghiên cứu lý thuyết Phƣơng ph p nghiên cứu thực nghiệm Bố cục luận văn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CUẢ CÂY ĐU ĐỦ TRONG NƢỚC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ NGỒI NƢỚC NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY ĐU ĐỦ T c dụng trị giun s n T c dụng hạ huyết p 10 T c dụng kh ng sinh, kh ng nấm 10 4 T c dụng trị u bƣớu, ung thƣ 11 T c dụng chống oxi h a 12 1.4.6 C c t c dụng dƣợc lý kh c 12 C ng dụng dân gian 12 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO 13 Phƣơng ph p MTT 13 Phƣơng ph p SRB 14 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 15 1 Nguyên liệu 15 2 H a chất thiết bị nghiên cứu 15 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2 Phƣơng ph p chiết mẫu thực vật 16 2 Phƣơng ph p t ch tinh chế chất 16 2 Phƣơng ph p x c định cấu trúc hóa học hợp chất 16 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT 17 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT ETHYL ACETATE 17 CHẠY CỘT SẮC KÍ PHẦN CAO ETHYL ACETATE 18 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CHẤT SẠCH 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT ETHYL ACETATE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 22 PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT ETHYL ACETATE 22 3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT CPE4 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 KẾT LUẬN 27 KIẾN NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT d : Doublet (NMR) J(Hz) : Hằng số tƣơng t c (NMR) Rf : Retention factor s : Singlet (NMR) ppm : Parts per million δ : Đ chuy n dịch h a học (NMR) BuOH : Butanol CD3OD : Methanol- D CHCl3 : Chloroform D : Dichlomethane DMSO : Dimethyl sunfoxide DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer EtOAc : Ethyl acetate EtOH : Ethanol HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum Corelation MeOH : Methanol Me : Methyl MMT : 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide NMR : Nuclear magnetic resonance SRB : Sulforhodamine B UV : Ultraviolet CPE4 : Tên hợp chất phân lập đƣợc DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang 2.1 Hợp chất CPE4: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside 21 3.1 Hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ cao chiết ethyl acetate 22 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất CPE4 hợp chất tham khảo 23 3.3 Hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ hợp chất CPE4 27 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình hình Trang 1.1 Hình ảnh đu đủ 2.1 Hoa đu đủ đực b t hoa đu đủ đực 15 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết 17 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất CPE4 từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetate hoa đu đủ đực 21 3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất CPE4 23 3.2 Phổ MS hợp chất CPE4 24 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất CPE4 25 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất CPE4 25 3.5 Phổ DEPT hợp chất CPE4 26 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây đu đủ (Carica papaya Linn) m t loại ăn c nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ Hiện nay, đu đủ đƣợc trồng c c nƣớc vùng nhiệt đới, nơi c nhiệt đ bình quân năm kh ng thấp 150C Sản lƣợng đu đủ giới khoảng triệu quả/năm Ở Việt Nam, đu đủ đƣợc trồng hầu hết c c tỉnh miền Bắc miền Nam Tuy nhiên, chúng đƣợc trồng nhiều c c tỉnh đồng bằng, dọc theo c c s ng, c c loại đất phù sa C c tỉnh trồng nhiều đu đủ nhƣ: Hà N i, Hƣng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, c c tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng đu đủ nƣớc ƣớc khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lƣợng khoảng 200 – 350 nghìn Cây đu đủ c lợi loại dễ trồng, sớm, suất cao đồng thời toàn b thân, l , đƣợc sử dụng với nhiều mục đích kh c Ngoài việc lấy tƣơi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, đu đủ đƣợc trồng đ lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nu i Trong dân gian đu đủ đƣợc sử dụng đ s t khuẩn, kh ng nấm, kh ng viêm, chữa sốt rét, trừ giun s n… Đã c nhiều c ng trình nghiên cứu hoạt tính sinh học l đu đủ Lá đu đủ đƣợc chứng minh c khả chống oxy h a mạnh Hoạt tính chống oxy h a c c hợp chất phenol gây L đu đủ c hoạt tính kh ng khuẩn tốt, c khả kh ng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dƣơng, c c loại nấm Ngồi ra, l đu đủ cịn c khả kh ng viêm, giảm đau Ở nƣớc ta, cao chiết với cồn từ l đu đủ đƣợc nghiên cứu m t số m hình ung thƣ thực nghiệm đƣợc chứng minh c t c dụng ức chế ph t tri n khối u gây tế bào ung thƣ Sarcoma TG-180 chu t nhắt trắng Ngƣời dân nƣớc Úc dùng l đu đủ chữa trị bệnh ung thƣ Đầu năm 2010, m t nh m nghiên cứu Nhật Bản Mỹ th ng b o dịch chiết nƣớc l đu đủ c t c dụng ức chế m t số dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ ung thƣ dày, ung thƣ phổi, ung thƣ m u,… Ngoài ra, dịch chiết từ l đu đủ c t c dụng h trợ hệ miễn dịch đ c ng vào c c tế bào ung thƣ Bằng c ch thúc đẩy gia tăng c c sản phẩm cytokine dạng Th1 nhƣ phần cần thiết kh c điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; đ ẩm 98%; v trùng tuyệt đối) Tùy thu c đặc tính dòng tế bào kh c nhau, thời gian cấy chuy n c ng kh c Thử độc tế bào: Phƣơng ph p thử SRB - C c dòng tế bào ung thƣ đƣợc nu i cấy m i trƣờng RMPI 1640 DMEM c bổ sung 10% huyết bào thai bò (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin 37 ºC tủ ấm 5% CO2 - C c tế bào đƣợc cấy chuy n vào phiến 96 giếng (mật đ tế bào 1×105 tế bào/giếng) đƣợc xử lý với c c nồng đ kh c mẫu thử - Sau 48h ủ, thêm 50 μL sulforhodamine B 0,4% vào c c giếng ủ tiếp 4h - Sau đ gạn bỏ m i trƣờng gi trị mật đ quang (OD) đƣợc đo m y đọc Elisa (xMark Pro, Biorad, USA) bƣớc s ng 540 nm - Phép thử tiến hành x c định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật đ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc thành phần protein tế bào đƣợc nhu m sulforhodamin B (SRB) Khả ức chế sống s t tế bào đƣợc x c định th ng qua c ng thức: CS % = - Làm tƣơng tự với chất đối chứng camptothecin với c c nồng đ 0,5 μM 10 μM 2.5 CHẠY CỘT SẮC KÍ PHẦN CAO ETHYL ACETATE Cao chiết ethyl acetate (CPET, 20 g) đƣợc hòa tan với m t lƣợng tối thi u ethyl acetate, sau đ tẩm với 70 g silica gel, cất quay b t tơi kh Tiến hành phân t ch h n hợp c t silica gel pha thƣờng, rửa giải gradient hệ dung m i dichloromethane/methanol với đ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol, 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 1/1, v/v) thu đƣợc phân đoạn tƣơng ứng CPET1 (2,0 g); CPET2 (2,4 g); CPET3 (1,6 g); CPET4 (6,2 g) CPET5 (4,4 g) Phân đoạn CPET3 (1,6 g) đƣợc cho lên c t sắc ký silica gel pha đảo, rửa giải với hệ dung m i methanol/nƣớc (1,2/1, v/v) thu đƣợc hai phân đoạn CPET3A (25 mg) CPET3B (37 mg) Hợp chất CPE4 (9,2 mg) đƣợc tinh chế qua c t Sephadex LH-20 với hệ dung m i rửa giải methanol/nƣớc (1/1, v/v) từ phân đoạn CPET3B (37 mg) 18 Sơ đồ phân lập hợp chất CPE4 (Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside) từ cao CPET đƣợc trình bày hình Cao chiết ethyl acetate (CPET, 20 g) Silica gel CC D:Mgradient 50:1→10:1 CPET1 (2,0 g) CPET2 (2,4 g) CPET3 (1,6 g) CPET4 (6,2 g) CPET5 (4,4 g) RP-18 c.c (v/v) M:W 1,2:1 CPET3A (25 mg) CPET3B (37 mg) Sephadex LH-20 M:W 1:1 CPE4 (9,2 mg) Hình 2.3 Sơ đồ phân lập hợp chất CPE4 từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetate hoa đu đủ đ c Hợp chất CPE4: Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside Chất b t, màu vàng sẫm Nhiệt đ n ng chảy: 223-229oC C ng thức phân tử C21H20O11, M = 448 ESIMS: m/z 447,42 [M-H]1 H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Bảng 2.1 19 2.6 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CHẤT SẠCH a Vật liệu - H a chất: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES (4-(2hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine serum, sulforhodamine B, DMSO 10%, trichloroacetic, 5% acetic acid, tris(hydroxymethyl)aminomethane - Mẫu thử: Chất - C c dòng tế bào thử nghiệm: A549 (ung thƣ phổi ngƣời), MCF-7 (ung thƣ vú ngƣời) Hep3B (ung thƣ gan ngƣời) GS J M Pezzuto, Trƣờng Đại học Hawaii, Mỹ GS Jeanette Maier, trƣờng Đại học Milan, Italia cung cấp b Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro C c dòng tế bào ung thƣ ngƣời đƣợc nu i cấy dƣới dạng đơn lớp m i trƣờng nu i cấy DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) với thành phần kèm theo gồm mM L-glutamine; 1,5 g/L sodium bicarbonate; 4,5 g/L glucose; 10 mM HEPES 1,0 mM sodium pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS (Gibco) Tế bào đƣợc cấy chuy n sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) nu i tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 c Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư Phƣơng ph p thử đ đ c tế bào ung thƣ in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) x c nhận phép thử đ đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, ph t c c chất c khả kìm hãm ph t tri n tiêu diệt tế bào ung thƣ điều kiện in vitro Phép thử đƣợc thực theo phƣơng ph p Monks [23] Phép thử tiến hành x c định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật đ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc thành phần protein tế bào đƣợc nhu m Sulforhodamine B (SRB) Gi trị OD m y đo đƣợc tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, đ lƣợng tế bào nhiều (lƣợng protein nhiều) gi trị OD lớn Phép thử đƣợc thực điều kiện cụ th nhƣ sau: - Chất thử (10 L) pha DMSO 10% (trong nƣớc cất v trùng) đƣợc đƣa vào c c giếng khay 96 giếng đ c nồng đ sàng lọc 100 g/mL Chất thử c hoạt 20 tính đƣợc x c định IC50 nhờ dải nồng đ 100; 20; 4; 0,8 g/mL M i nồng đ mẫu thử đƣợc chuẩn bị thành giếng - Trypsin h a tế bào thí nghiệm đ làm rời tế bào đếm buồng đếm đ điều chỉnh mật đ cho phù hợp với thí nghiệm - Thêm vào c c giếng thí nghiệm lƣợng tế bào phù hợp (190 L m i trƣờng) đ chúng ph t tri n vòng 3-5 ngày - M t khay 96 giếng kh c kh ng c chất thử nhƣng c tế bào ung thƣ (190 L) đƣợc chuẩn bị thành c t đ làm đối chứng ngày Sau giờ, đĩa đối chứng ngày đƣợc cố định tế bào trichloroacetic acid –TCA - Sau giai đoạn ph t tri n tủ ấm CO2, tế bào đƣợc cố định vào đ y giếng TCA 30 phút, đƣợc nhu m SRB 37 oC Đổ bỏ SRB c c giếng thí nghiệm đƣợc rửa lần 5% acetic acid đ kh kh ng khí nhiệt đ phòng - Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM đ hòa tan lƣợng SRB b m nhu m c c phân tử protein, đƣa lên m y lắc đĩa, lắc nhẹ 10 phút sử dụng m y ELISA Plate Reader (Bio-Rad) đ đọc kết hàm lƣợng màu chất nhu m SRB th ng qua phổ hấp thụ bƣớc s ng 515-540 nm Phần trăm tế bào bị ức chế c mặt chất thử đƣợc x c định th ng qua c ng thức sau: % Tế bào bị ức chế [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 = 100% - [OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)] - C c phép thử đƣợc lặp lại lần đ đảm bảo tính x c Ellipticine (SigmaAldrich, Mỹ) c c nồng đ 10 g/ml; g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml lu n đƣợc sử dụng làm chất đối chứng dƣơng DMSO 10% lu n đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm Gi trị IC50 (nồng đ ức chế 50% ph t tri n) đƣợc x c định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 (System software Inc , San Jose, California, Mỹ) 21 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT ETHYL ACETATE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC Cao chiết ethyl acetate đem thử hoạt tính gây đ c tế bào dòng tế bào ung thƣ phổi (A549), gan (Hep3B) vú (MCF-7) Kết hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ cao chiết ethyl acetate đƣợc trình bày Bảng Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ cao chiết ethyl acetate TB sống sót (CS %) Mẫu Nồng độ (µg/mL) A549 Hep3B MCF-7 % TB sống Sai số % TB sống Sai số % TB sống Sai số 100.00 2.40 100.00 1.89 100.00 3.76 30 89.57 3.65 90.21 3.91 57.60 1.56 100 69.80 0.59 63.47 2.28 55.88 0.18 0.5 µM 76.00 2.27 48.73 1.35 62.82 2.10 10 µM 41.77 1.25 28.27 2.64 42.66 2.08 Control M/ET Camptothecin Ký hiệu: M/ET phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao methanol Kết luận: Phân đoạn cao chiết ethyl acetate từ cao methanol hoa đu đủ đực c hoạt tính sinh học kìm hãm c c tế bào ung thƣ phổi, gan, vú với c c mức đ kh c c c nồng đ nghiên cứu 3.2 PHÂN LẬP HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT ETHYL ACETATE Hợp chất CPE4 đƣợc phân lập dƣới dạng chất b t màu vàng sẫm, m n ng chảy 223-229oC Trên phổ ESIMS (Hình 3.2) CPE4 cho thấy xuất pic ion giả phân tử m/z 447,42 [M-H]- nên c th đề nghị CTPT hợp chất C21H20O11 22 OH 5' 4' 6' HO 1' O 10 OH 3' 2' HO O 1'' O OH 4'' 2'' O OH 3'' 5'' 6'' OH Hình 3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất CPE4 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất CPE4 hợp chất tham khảo # C δC# Aglycon 158,5 135,5 179,5 163,1 99,9 166,0 94,7 159,1 10 105,7 1′ 122,8 2′ 132,3 3′ 116,1 4′ 161,6 5′ 116,1 6′ 132,3 3-O-β-D-glucopyranoside 1′′ 104,1 2′′ 75,7 3′′ 78,1 4′′ 71,4 5′′ 78,4 Ca, b Ha, c (J, Hz) 158,5 135,5 179,5 163,1 100,0 166,1 94,8 159,1 105,7 122,8 132,3 116,1 161,6 116,1 132,3 6,22 (s) 6,42 (s) 8,07 (d, 8,5) 6,91 (d, 8,5) 6,91 (d, 8,5) 8,07 (d, 8,5) 104,2 75,8 78,1 71,4 78,4 6′′ 62,7 5,26 (d, 7,0) 3,46* 3,44* 3,35* 3,23 (m) 3,71 (br d, 12,0) 3,55 (dd, 5,0; 12,0) 62,6 δC kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside [46], ađo CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập Phổ 1H-NMR (Hình 3.3) CPE4 xuất hai tín hiệu singlet H 6,22 (1H, s, H-6) 6,42 (1H, s, H-8) đặc trƣng cho proton vòng A vị trí C-6 C-8; hai tín hiệu doublet H 8,07 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′) 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′) với số tích phân cho thấy vịng B bị C-4′ Ngồi cịn xuất thêm tín hiệu m t phân tử glucose với proton anomer H 5,26 23 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′′) nh m methylene đặc trƣng glu 6′′-CH2 H 3,55 (1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, H-6a′′); 3,71 (1H, br d, J = 12,0 Hz, H-6b′′) Trên phổ 13 C-NMR (Hình 3.4) DEPT (Hình 3.5) CPE4 xuất tín hiệu 21 carbon, ngồi 15 carbon thu c khung kaempferol cịn lại carbon phân tử đƣờng glucose C 104,2; 75,8; 78,1; 71,4; 78,4 62,7 Dựa vào c c kiện phổ thu đƣợc, kết hợp việc đối chiếu với c c kiện phổ hợp chất tham khảo tài liệu [46], hợp chất CPE4 đƣợc x c định kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (Hình 3.1) +Hình 3.2 Phổ MS hợp chất CPE4 24 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất CPE4 Hình 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất CPE4 25 Hình 3.5 Phổ DEPT hợp chất CPE4 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT CPE4 Kết đ nh gi hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ in vitro hợp chất CPE4 ba dòng tế bào ung thƣ ngƣời A549, MCF-7, Hep3B đƣợc trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hợp chất CPE4 STT IC50 (µg/mL) Hợp chất A549 MCF-7 Hep3B CPE4 71,52±3,27 81,84±4,72 80,13±2,76 Ellipticine 0,43±0,04 0,37±0,03 0,50±0,04 Kết luận: Hợp chất CPE4 c hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ dòng tế bào ung thƣ ngƣời A549, MCF-7, Hep3B 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Đã thử hoạt tính gây đ c tế bào cao chiết ethyl acetate c c dòng tế bào ung thƣ phổi (A549), ung thƣ gan (Hep3B), ung thƣ vú (MCF-7) Kết cho thấy cao chiết ethyl acetate từ cao methanol hoa đu đủ đực c hoạt tính sinh học kìm hãm c c tế bào ung thƣ phổi, gan, vú với c c mức đ kh c c c nồng đ nghiên cứu - Từ cao chiết ethyl acetate, c c phƣơng ph p sắc ký c t kết hợp với sắc ký lớp mỏng c c phƣơng ph p phổ đại nhƣ NMR, MS, phân lập x c định cấu trúc chất CPE4 Kaempferol-3-O--D-Glucopyranoside - Kết đ nh gi hoạt tính gây đ c tế bào ƣng thƣ in vitro hợp chất CPE4 cho thấy hợp chất c hoạt tính gây đ c tế bào ung thƣ dòng tế bào ung thƣ ngƣời A549, MCF-7, Hep3B với c c mức đ kh c Kết sở khoa học cho việc định hƣớng bào chế cao dƣợc liệu thử nghiệm in vitro hƣớng đến ứng dụng thực tế KIẾN NGHỊ - Tiếp tục phâp lập thêm x c định cấu trúc chất phân lập đƣợc từ c c phân đoạn lại dịch chiết ethyl acetate hoa đu đủ đực - Thăm dị c c hoạt tính sinh học kh c chất phân lập đƣợc c ng nhƣ dịch chiết c c hợp chất phân lập đƣợc kh c 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827 [2] Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, Nxb Y học, Hà N i [3] Đ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, Nxb Y học, Hà N i [4] Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012) Hai cycloratane triterpene lần phân lập từ l Đu đủ (carica papaya L ) , Tạp chí hóa họctập 50 (4A), pp 166-169 [5] Hồ Thị Hà (2014), Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ Đu đủ(Carica papaya Linn), Luận n tiến sĩ Đại học B ch khoa Hà n i [6] Giang Thị Kim Liên Đ Thị Lệ Uyên (2015), Khảo s t thành phần ho học m t số dịch chiết từ hoa Đu đủ đực thu h i Đà Nẵng ,Tạp chí Khoa học Cơng nghệ ĐHĐN; Số 03(88) ; Trang 119 [7] Đ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà N i,Trang 360-362 [8] Phạm Kim Mãn c ng (2001), Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế u dùng điều trị ung thƣ , Tạp chí dược liệu, 6(2+3), pp 58-62 [9] Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) ‘‘Điều tra hợp chất carotenoid m t số thực vật Việt Nam , Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên công nghệ, (23), pp 130-134 [10] Nguyễn Văn Rƣ, V Quang Th i, (2013) "T ch chiết chymopapain từ nhựa Đu đủ xanh (Carica papaya) chế thử thành dạng b t đ pha tiêm", Tạp chí Hóa Học 50(6): 767-771 [11] Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lƣ (2004),Cây Đu đủ kỹ thuật trồng, Nxb lao đ ng xã h i 28 [12] Đ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác định khả phịng chống ung thư chất hóa học số thuốc Việt Nam, Luận n tiến sĩ sinh học [13] Nguyễn Tƣờng Vân, Đặng Hồng Vân, Phạm Gia Kh i, Trần Mạnh Bình, Phan Quốc Kinh (1983) Chiết xuất x c định carpaine alkaloid l Đu đủ‘‘,Tạp chí dược học số [14] Viện Dược liệu- Bộ Y tế (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược l củathuốc từ dược thảo, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật- Hà N i [15] Đ Quốc Việt, Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học bầu đất (Gynura sarmentosa DC.), cải đồng (Grangea maderaspatana poir.) chuối hột (Musa balbisiana colla), Luận n tiến sĩ (2006) Tiếng Anh [16] Aravind G., Debjit Bhowmik, Duraivel S., Harish G (2013) ‘’Traditional and medicinal uses of carica papaya , Journal of medicinal plants studies, vol 1, Issue 1,pp 7-15 [17] Asmah Rahmat, Rozita Rosli, Wan Nor I`zzah Wan Mohd Zain, Susi Endrini and Huzaimah Abdullah Sani (2002) Antiproliferative Activity of Pure Lycopene Compared to Both Extracted Lycopene and Juices from Watermelon (Citrullus vulgaris) and Papaya (Caricapapaya) on Human Breast and Liver Cancer Cell Lines ,Journal of Medical Sciences, vol 2.Isuae 2.page 55-58 [18] Abrham W.B., (1978), Techniques of Animal and Clinical toxicology , Med Pub Chicago, p 55 – 68 [19] Antonella Canini, Daniela Alesiani, Giuseppe D’Arcangelo, Pietro Tagliatesta (2007) Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from carica papaya L leaf ,Journal of food composition and analysis, vol 20, pp 584-590 [20] Beverly A Teicher, (1997), Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval, Humana Press, Totowa, New Jersey 29 [21] Bamidele V, Owoyele, Olubori M, Adebukola, Adeoye A, Funmilayo and Ayodele O, Soladoye (2008) Anti - inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leave , Inflammopharmacology, 16 (2008), pp 168 – 173 [22] Chung-Shih Tang (1979) New macrocyclic Δ1–piperideine alkaloids from papaya leaves: dehydrocarpaine I and II ,Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651-652 [23] David S., Seigler, Guido F., Pauli, Adolf Nahrstedt, Rosemary Leen (2002) Cyanogenic allosides and glucosides from passiflora edulis and carica papaya , Phytochemistry, vol 60, pp 873-882 [24] Eno AE, Owo OI, Itam EH, Konya RS, (2000), Blood pressure depression by the fruit juice of Carica papaya (L.) in renal and DOCA-induced hypertension in the rat”, Phytother Res, Jun;14(4):235-9 [25] Gopalakrishnan M, Rajasekharasetty MR., (1978 ), Effect of papaya(Carica papaya Linn) on pregnancy and estrous cycle in albino rats of Wistar strain”, Indian J Physiol Pharmacol, Jan-Mar;22(1):66-70 [26] Giordani R., Cardenas M.L., Moulin-Traffort J., Regli P., (1996), Fungicidal activity of latex sap from Carica papaya and antifungal effect of D(+)glucosamine on Candida albicans growth”, Mycoses, 39, 103-110 [27] Govindachari T.R., Naga rajan K and Viswanathan N (1965) “Carpaine and pseudocarpaine”, Tetrahedron letters No 24, pp 1907-1916 [28] Hewitt H, Whittle S, Lopez S, Bailey E, Weaver S,(2000), Topical use of papaya in chronic skin ulcer therapy in Jamaica”, West Indian Med J Mar; 49(1):32-3 [29] John R., Van (1998), “Mechanism of Action of Non Stervidal Anti inflammatory Drug”, The American Jour of Med March 30, vol 104 (3A) p.2s -3s [30] Krishna K L , Paridhavi M and Jagruti A Patel (2008) Review on nutritional,medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.)’’,Natural product radiance, vol 7(4), pp 364-373 30 [31] Kermanshai R, McCarry BE, Rosenfeld J, Summers PS, Weretilnyk EA, Sorger GJ (2001), Benzyl isothiocyanate is the chief or sole anthelmintic in papaya seed extracts”,Phytochemistry, Jun; 57(3):427-35 [32] Lohiya NK, Kothari LK, Manivannan B, Mishra PK, Pathak N, (2000), Human sperm immobilization effect of Carica papaya seed extracts: an in vitro study”,Asian J Androl Jun;2(2):103-9 [33] Marline Nainggolan and Kasmirul Cytotoxicity activity of male Carica papaya L flowers on MCF-7 breast cancer cells ,Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2015, 7(5):772-775 , ISSN : 0975-7384 [34] Mikhal'chik EV, Ivanova AV, Anurov MV, Titkova SM, Pen'kov LY, Kharaeva ZF, Korkina LG, (2004), Wound-healing effect of papaya-based preparation in experimental thermal trauma”, Bull Exp Biol Med, Jun;137(6):560-2 [35] Maisarah A.M., Nurul Amira B., Asmah R and Fauziah O (2013) Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya , International Food Research Journal,20(3), pp 1043-1048 [36] Pathak N,Mishra PK, Manivannan B, Loyhia NK, (2000), inhibition of sperm motility by oral Stertility due to administration of benzene chromatographic fraction of the chloroform extract of the seeds of Carica papaya in rats”, Phytomedicine, 7, 325-333 [37] Prawez Alam1,2, Mohammed Ali*1, Kamran Javed Naquvi1,3, Shahnaz Sultana, New long chain fatty acids and steroidal glycosides from rhizomes of Smiiax chinaL , Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical ResearchIssue 3(Vol 5), ISSN: 2231-2560 (2015) [38] Rahman S., Imran M., Muhammad N., Hassan N., Chisthi A.K., Khan A.F., Sadozai K.S and Khan S.M (2011) Antibacetial screening of leaves and stem of Carica papaya ,Journal of Medicinal Plants Research, vol 5(20), pp 5167-5171 31 [39] Rumiyati, Sismindari dan Ariyani (2006) Effect of protein fraction of Carica papaya L leaves on the expressions of p53 and Bcl - in breast cancer cells line ,Majalah Farmasi Indonesia, 17(4), pp 170 – 176 [40] Satrija F, Nansen P, Bjorn H, Murtini S, He S., (1994), Effect of papaya latex against Ascaris suum in naturally infected pigs”, J Helminthol Dec;68(4):343-6 [41] Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Kenneth D.P., Monks A., Tierney S., Nofziger T H , Currens M J , Seniff D , Boyd M R (1988), Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines , Cancer Reseach.48: 4827 – 4833 [42] Somsak Nualkaew, Peerawit Padee and Chusri Talubmook, Hypoglycemic activity in diabetic rats of stogmasterol and sitosterol-3-O-b-D- glucopyranoside isolated from Pseuderanthemum palatiferum(Nees), Radlk Leaf extract , Journal of Medicinal Plants Research, Vol 9(20), 629-635 (2015) [43] Sripanidkulchai B, Wongpanich V, Laupattarakasem P, Suwansaksri J, Jirakulsomchok D, (2001), Diuretic effects of selected Thai indigenous medicinal plants in rats , J Ethnopharmacol May;75(2-3):185-90 [44] Stephen Chinwendu Ukpabi Emmanuel O.Chukwu Henry C.Ezikpe Chizaram (2015) Chemical Composition Of Carica Papaya Flower (Paw-Paw)”, International Journal of Scientific Research and Engineering Studies (IJSRES), Volume Issue 3, ISSN: 2349-8862 [45] Tahehiko Fukunaga, Koichi Nishya, Ikuko Kạikawa, Yoshikuni Watanabe, Noubo Suzuki, Koichi Takeya and Hideji Itokawa (1988), Chemical studies on the constituents of Hyphear Tanakae Hosokawa from different host treé , Chem.Pharm.Bull, 36(3) 1180-1184 [46] Kohei Kazuma, Naonobu Noda and Masahiko Suzuki (2003), Malonylated flavonol glycosides from the petals of Clitoria ternatea , Phytochemistry, 62(2), pp 229-237 32 ... HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ CHUNG THÚY LY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ B? ?O UNG THƢ CỦA HỢP CHẤT KAEMPFEROL- 3- O- β -D- GLUCOPYRANOSIDE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC THU HÁI TẠI... b? ?o ung thƣ hợp chất kaempferol- 3- O-  -D- glucopyranoside từ hoa đu đủ đ c thu hái Quảng Nam – Đà Nẵng làm đề tài luận văn Mục tiêu nghiên cứu Phân lập hợp chất ho học từ phân ? ?o? ??n d? ??ch chiết ethyl... HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ B? ?O UNG THƢ CỦA CHẤT SẠCH 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ TH? ?O LUẬN 22 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ B? ?O UNG THƢ CỦA CAO CHIẾT ETHYL ACETATE TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC 22 PHÂN LẬP HỢP