Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất 6 hydroxy 2,6 dimethyl 2,7 octadienoic acid từ phân đoạn dichloromethane của hoa đu đủ đực

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA NGUYỄN ĐỖ NHẬT ANH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA HỢP CHẤT 6-HYDROXY-2,6-DIMETHYL-2,7-OCTADIENOIC ACID TỪ PHÂN ĐOẠN DICHLOROMETHANE CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Đà Nẵng - Năm 2020 Nghiên cứu chiết tách, phân lập hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất 6hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid từ phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đực (Carica L.) Study on extraction, isolation and cancer cell toxicity activity of compound 6-hydroxy2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid from the dichloromethane extract of male Carica papaya flowers (Carica L.) SVTH: Nguyễn Đỗ Nhật Anh Lớp 16CHDE, Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Khoa Hóa Học, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng Summary From the original raw papaya flower material, by various methods, the extracts were extracted with the corresponding organic solvents: n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate By column chromatography, thin chromatography has isolated a pure compound, symbolized as CP9 The result of determining the pure substance structure by modern spectroscopic method: 1H-NMR, 13C-NMR and HSQC, HMBC spectroscopy spectroscopy, concluded that this pure compound is 6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9) After testing the cytotoxic activity of compound CP9 on cell lines of lung cancer (A549), liver cancer (Hep 3B), breast cancer (MCF-7), concluded that the compound CP9 exhibited cancer cell toxic activity on all cell lines Keywords Male carica papaya L.; 6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9) Đặt vấn đề Trong năm gần đây, theo đà phát triển phần trở khám phá tài nguyên thiên kinh tế, đời sống vật chất tinh nhiên thực vật phong phú, nguồn thần người dân cải thiện đáng kể nguyên liệu quý thiên nhiên ban tặng Để đáp ứng đủ tốt nhu cầu Để trì khai thác tối ưu hóa nguồn người dân khơng thể thiếu dược nguyên liệu quý đó, người vận dụng phẩm, thực phẩm chức bổ sung Hiện kỹ thuật, thiết bị đại vào việc tách nay, xu hướng nghiên cứu khoa học hợp chất có phân cách hiệu góp phần mang lại Nguyên Diện tích trồng đu đủ nước ứng dụng thiết thực đời sống ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản người Ở loại thực vật khác có lượng khoảng 200 – 350 nghìn Cây cơng dụng, hoạt tính khác đu đủ có lợi loại dễ trồng, hợp chất vậy, có sớm, suất cao đồng thời tồn thân, hợp chất có hoạt tính cao mang lại hiệu lá, sử dụng với nhiều mục đích nâng cao giá trị sử dụng có khác Ngoài việc lấy tươi, dùng hợp chất khơng có đặc tính làm ngun liệu cho chế biến, đu đủ ứng dụng Do đó, việc sâu vào trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn nghiên cứu loại tìm chất tạo chăn ni lợi ích việc làm nhà khoa học Đu đủ ông cha ta sử dụng với Đu đủ (Carica papaya L.) loại nhiều mục đích khác khác, trái giàu dinh dưỡng có giá trị cơng dụng tốt phận đu đủ kinh tế lá, thân có tác dụng điều trị bệnh sốt rét, Đu đủ chín có hàm lượng dinh dưỡng kháng nấm, kháng viêm dùng để sát cao, theo phân tích thành phần hóa học, khuẩn Đã có nhiều cơng trình nghiên 100g thịt trái chín có chứa 86,6% cứu hoạt tính sinh học đu đủ nước; 12,1% tinh bột; 0,6% protein; 0,3% chứng minh đu đủ có khả lipid; lượng 50 calo; 0,7% xơ; 0,5% chống oxy hóa mạnh Hoạt tính chống tro; có nhiều khống như: Kali oxy hóa hợp chất phenol (204mg); Ca (34mg); P (11mg) Đặt biệt đu gây Lá đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn đủ cung cấp lượng vitamin phong phú: tốt, có khả kháng nhiều loại vi khuẩn vitamin A (450mg); vitamin C (74mg); gram âm, gram dương, loại nấm vitamin B1 (0,03mg); vitamin B2 (0,04mg); P (0,5mg) [1] Ở nước ta, cao chiết với cồn từ đu đủ nghiên cứu số mơ hình Ở Việt Nam, dù chưa xác định ung thư thực nghiệm chứng minh có nguồn gốc, xuất sứ đến đu đủ tác dụng ức chế phát triển khối u gây trồng hầu hết tình miền Bắc, tế bào ung thư Sarcoma TG-180 chuột Trung Nam Chúng trồng chủ yếu nhắt trắng Người dân dùng đu đủ chữa tỉnh đồng Hà Tây, Hà Nam, trị bệnh ung thư Đầu năm 2010, nhóm Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bình nghiên cứu Nhật Bản Mỹ thông báo Dương, Tiền Giang, Sông bé tỉnh Tây dịch chiết nước đu đủ có tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư người xác định thành phần hóa học hoạt tính ung thư dày, ung thư phổi, ung thư sinh học đu đủ Tuy nhiên, máu,… Ngồi ra, dịch chiết từ đu đủ cịn nghiên cứu đu đủ chủ yếu, có có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để cơng nghiên cứu phận hoa chúng vào tế bào ung thư Bằng cách thúc đẩy Việc sử dụng hoa đủ đực gia tăng sản phẩm cytokine dạng Th1 theo phương thức dân gian, truyền miệng IL-12p40, IL-12p70, INF-γ TNF- Chính vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa α, cytokine có khả chống lại học cao chứng minh khối u thành phần hoạt chất cụ thể hoa đu đủ Năm 1965, Govindachari Go, đực việc vô quan trọng thiết Nagarajan Viswanathan xác định thực nhằm tạo sở khoa học cho việc ứng cấu trúc carpaine Pseudocarpaine dụng nguồn nguyên liệu dồi sẵn có alkaloid chiết xuất từ đu đủ [2] Năm Việt Nam làm thuốc điều trị bệnh 1979, Chung – Shih Tang phân lập hiểm nghèo này, đặc biệt ung thư alkaloid piperideine dehydrocarpaine I dehydrocarpaine II từ đu đủ [3] Ở Việt Nam, năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích chất carotenoid đu đủ Kết cho thấy β – carotene, luteine chiếm tỉ lệ tương ứng 57,05% 11,864% so với tổng chất carotenoid không xác định lycopene [4] Năm 2012, Trần Thanh Hà phân lập chất từ phân đoạn chiết nhexan đu đủ bao gồm β – sitosterol, daucosterol, cycloart-23-ene3β,25-diol (sterculin A) cycloart-25-ene-3β,24 (R/S) diol Trong sterculin A cycloart-25ene-3β,24 (R/S) diol triecpen lần phân lập từ đu đủ [5] Công dụng đu đủ đa dạng có nhiều đề tài nghiên cứu tập trung Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu hoa đu đủ đực thu hái Quảng Nam-Đà Nẵng vào tháng 01 năm 2017 Hoa đu đủ đực định danh, sau thu hái rửa sạch, phơi, sấy khô xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu Sắc ký lớp mỏng sử dụng mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày 0,2mm Phân lập chất phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck silicagel pha đảo RP-18 Thuốc thử phun lên mỏng chủ yếu sử dụng dung dịch H2SO4 10%, sau sấy nhiệt độ khoảng 110℃ Dung môi dùng để chạy cột triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, dichloromethane ethyl acetate phễu MeOH BuOH loại tinh khiết cất chiết Với loại dung môi thực chiết lại qua cột trước sử dụng để loại tạp lần Các dịch chiết cất loại dung môi chất… thu cao chiết tương ứng (cao Các thiết bị xác định cấu trúc chất: Phổ cộng chiết n-hexan, chloroform, dichloromethane hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, EtOAc) để tiếp tục nghiên cứu 13 C-NMR, HSQC HMBC đo máy Bruker 2.3.2 Phương pháp tách tinh chế chất Avance – 500 MHz, chất chuẩn nội TMS Các cao chiết dung mơi cho 1H-NMR tín hiệu dung mơi (CDCl3) khác tách tinh chế Đèn (UV phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí lớp BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm mỏng với hệ dung mơi thích hợp Sắc kí 365nm dùng để soi mỏng cột thường sử dụng silicagel pha thuận cho 13 C-NMR tử ngoại Ngoài dùng số trang thiết bị pha đảo Đối với chất có khối lượng phân khác máy quay cất chân khơng, máy sấy, tử khác sử dụng sắc kí cột máy nung, máy siêu âm, cân phân tích, cốc Sephadex LH–18 Trường hợp cần thiết có thủy tinh, bình tam giác, loại pipet, bình thể chạy cột lặp lại nhiều lần dùng định mức, giấy lọc, cột sắc ký… phương pháp kết tinh phân đoạn, kết tinh lại 2.3 Phương pháp nghiên cứu để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết 2.3.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật: chất theo dõi q trình tách Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) vào chất cột sắc kí lớp mỏng với hệ bình bề mặt lớp bột Chiết dung mơi thích hợp mẫu nhiệt độ từ 800℃ – 900℃ Sau đó, 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa dung dịch chiết lọc ngang qua tờ học hợp chất giấy lọc Quá trình chiết lặp lại nhiều Việc xác định cấu trúc hóa học lần, lần chiết khoảng 24h Gộp dịch chất thực thông qua việc chiết, cất loại dung môi áp suất thấp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều máy quay cất chân không, thu cao hai chiều (1D 2D-NMR) 1H–NMR, chiết tổng Có thể gia tăng hiệu chiết 13 cách đảo lộn, xốc 2.4 Điều chế cao chiết hoăc sử dụng máy siêu âm Cao chiết tổng 2.4.1 Điều chế cao tổng (cao methanol) chế thêm nước chiết phân lớp với n-hexan, chloroform, C–NMR, HSQC, HMBC Nguyên liệu hoa đu đủ đực sau thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khô, đem xay nhỏ loại dung môi áp suất thấp thu 54g cao n-hexane kg bột Phân lớp với chloroform, chiết lần, Lần 1: Cho 5kg bột nguyên liệu vào bình lần khoảng lít chloroform Sau cất cầu, cho lít dung dịch methanol, ngâm loại dung mơi áp suất thấp thu 12g khoảng 12 Cho vào máy siêu âm sử cao chloroform dụng tần số 40kHz khoảng Sau lấy Phân lớp với dichloromethane, chiết dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần kiệt lần, lần khoảng lít dichloromethane tạo dịch đặc Sau cất loại dung môi áp suất thấp Lần 2: Cho lít dung dịch methanol vào thu 52g cao dichloromethane bả nguyên liệu chiết lần 1, tiếp tục ngâm Phân lớp với ethyl acetate, chiết lần, khoảng 12 Cho vào máy siêu âm sử lần khoảng lít ethyl acetate Sau cất dụng tần số 40kHz khoảng Sau lọc loại dung mơi áp suất thấp thu 20g lấy dịch chiết đem cất loại dung môi đến gần cao ethyl acetate kiệt, thu dịch đặc 2.5 Phân lập hợp chất CP9 từ cao Lần 3: Tương tự lần Tiếp túc CPD cho lít dung dịch vào bã nguyên liệu Cao chiết dichloromethane (CPD, 52g) methanol chiết lần 2, ngâm khoảng 12 hòa Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số dichloromethane, sau tẩm với 150g silica 40kHz khoảng Sau lọc lấy dịch gel, cất quay bột tơi khô Tiến chiết đem cất loại dung môi thu dịch hành phân tách hỗn hợp cột silica đặc cuối gel pha thường, rửa giải gradient hệ 2.4.2 Điều chế cao n-hexane (CPH), dung môi dichloromethane/methanol với độ chloroform phân (CPC), dichloromethane (CPD), ethyl acetate (CPET) tan với cực lượng tối tăng (dichloromethane/methanol, thiểu dần 100:0 → Dồn dịch đặc sau lần chiết, cất loại 0:100, ) thu phân đoạn: CPD1 dung mơi bổ sung lít nước cất, sau (20,6g), CPD2 (4,0g), CPD3 (2,5g), CPD4 phân lớp với n-hexane, chloroform, (3,5g), CPD5 (15,1g) dichloromethane ethyl acetate Phân lớp với n-hexane, chiết lần, lần khoảng lít n-hexane Sau cất Phân đoạn CPD4 (3,5g) phân tách sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (20/1, v/v) thu phân đoạn: CPD4A (0,6g), CPD4B DMSO-d6) CP9 tín hiệu đặc trưng (1,5g), CPD4C (1,1g) proton olefinic methine H 6,62 (1H, Phân đoạn CPD4A (0,6 g) phân m, H-3) 5,86 (1H, dd, J = 11,0; 17,5 Hz, tách cột silica gel pha thường với hệ H-7), proton methylene vinylene H dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl 5,16 (1H, dd, J = 2,0; 17,5 Hz, H-8b) 4,97 acetate (2/1, v/v) thu phân đoạn: (1H, dd, J = 2,0; 11,0 Hz, H-8a), proton CPD4A1, CPD4A2, CPD4A3, CPD4A4 methylene H 2,11 (2H, m, H-4) 1,48 Tiếp tục phân tách phân đoạn (2H, t, J = 8,0 Hz, H-5), proton methyl CPD4A4 sắc ký cột silica gel pha H 1,70 (3H, s, H-9) 1,16 (3H, s, H-10) thường Phổ với hệ dung môi rửa giải 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) dichloromethane/methanol (10/1, v/v) thu CP9 tín hiệu 10 carbon, có carbon carboxylic acid C 169,34 hợp chất CP9 (6-hydroxy-2,6- dimethyl-2,7-octadienoic acid) (10 mg) (C-1), carbon oxymethine C 71,29 (C- CP9 6), carbon olefinic methine C 145,77 (6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7- octadienoic acid): chất dầu, không màu, công thức phân tử C10H16O3, M = 184 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6): δH 6,62 (1H, m, H-3); 2,21 (2H, m, H-4); 1,48 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-5); 5,86 (1H, dd, J = 11,0; 17,5 Hz, H-7); 4,97 (1H, dd, J = 2,0; 11,0 Hz, Ha-8); 5,16 (1H, dd, J = 2,0; 17,5 Hz, Hb-8); 1,70 (C-7) 141,52 (C-3), carbon methylene vinylene C 111,17 (C-8), carbon methylene C 40,61 (C-5) 23,08 (C4), carbon methyl C 27,67 (C-10) 12,22 (C-9), carbon bậc bốn C 127,83 (C-2) Phổ HMBC CP9 thể C-NMR tương tác H3-9 (H 1,70) C-1/C-2/C- (125 MHz, DMSO-d6): δC 169,34 (C-1); 3; H3-10 (H 1,16) C-5/C-6/C-7 cho phép 127,83 (C-2); 141,52 (C-3); 23,08 (C-4); định vị methyl C-9, C-10 Tương tác 40,61 (C-5); 71,29 (C-6); 145,77 (C-7); HMBC H2-5 (H 1,48) C-3/C-4/C- 111,17 (C-8); 12,22 (C-9) 27,67 (C-10) 6/C-7 thiết lập diện nhóm Kết methylene C-5 Thêm vào đó, tương tác 3.1 Kết phân lập hợp chất hóa học HMBC H-8 (H 5,16; 4,97) C-6/C-7 cao chiết dichloromethane xác nhận vị trí nhóm methylene vinylene Hợp chất CP9 phân lập dạng chất C-8 dầu, không màu Công thức phân tử Từ liệu phổ thu kết hợp với C10H16O3, M = 184 Phổ 1H-NMR (500 MHz, liệu phổ hợp chất tham khảo tài liệu[6], (3H, s, H-9); 1,16 (3H, s, H-10) 13 cho phép khẳng định hợp chất CP9 6- chất CP9 thể hoạt tính gây độc tế hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid bào ung thư dòng tế bào ung thư khảo sát với mức độ khác HO Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004), Cây 10 HO Tài liệu tham khảo O Công thức cấu tạo CP9 Đu đủ kỹ thuật trồng, Nxb lao động xã hội 3.2 Kết đánh giá hoạt tính gây độc Govindachari T.R., Naga rajan K and tế bào ung thư hợp chất CP9 Viswanathan N (1965) “Carpaine and Hợp chất CP9 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng tế bào ung thư người pseudocarpaine”, Tetrahedron letters No 24, pp 1907-1916 Tang (1979) “New A549, MCF-7, Hep3B thử nồng Chung-Shih độ khác nhau, cụ thể: A549 với nồng độ IC50 macrocyclic Δ1–piperideine alkaloids from 78,98±4,64µg, Hep 3B với nồng độ IC50 papaya leaves: dehydrocarpaine I and 72,25±3,13µg MCF-7 với nồng độ IC50 II”,Phytochemistry, 1979, vol 18, pp 651- 54,15±5,89µg 652 Kết luận Từ nguyên liệu hoa đu đủ đực, phương pháp khác thu cao chiết với dung môi hữu tương ứng: nhexane, chloroform, dichloromethane Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) ‘‘Điều tra hợp chất carotenoid số thực vật Việt Nam“, Tạp chí khoa học ĐHQGHN, khoa học tự nhiên công nghệ, (23), pp 130-134 ethyl acetate Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012) Bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký “Hai cycloratane triterpene lần mỏng phương pháp phổ đại (1H- phân lập từ Đu đủ (carica papaya L.)“, NMR, 13C-NMR,…) phân lập xác định Tạp chí hóa họctập 50 (4A), pp 166-169 cấu trúc hợp chất tinh khiết 6-hydroxy- Robert L Arslanian, Tara Anderson and 2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid (CP9) Frank Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư glucosides hợp chất CP9 dòng tế bào ung thư Journal of Natural Products, 53(6), pp phổi (A549), ung thư gan (Hep 3B), ung thư 1485-1489 vú (MCF-7) Kết thu cho thấy hợp R Stermitz of (1990), Penstemon “Iridoid ambiguous”, .. .Nghiên cứu chiết tách, phân lập hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất 6hydroxy- 2 ,6- dimethyl- 2,7- octadienoic acid từ phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đực (Carica L.) Study... (3H, s, H-9); 1, 16 (3H, s, H-10) 13 cho phép khẳng định hợp chất CP9 6- chất CP9 thể hoạt tính gây độc tế hydroxy- 2 ,6- dimethyl- 2,7- octadienoic acid bào ung thư dòng tế bào ung thư khảo sát với... and 2 ,6- dimethyl- 2,7- octadienoic acid (CP9) Frank Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư glucosides hợp chất CP9 dòng tế bào ung thư Journal of Natural Products, 53 (6) , pp phổi (A549), ung thư