Nghiên cứu chiết tách và chuyển hóa zerumbone trong một số cây thuốc thuộc họ gừng (zingiberaceae) việt nam và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư

1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng BTT-VN 10 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió vùng BTT-VN 11 1.5 Thành phần hoá học tinh dầu củ Gừng gió sau khi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Hà Nô ̣i - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số: 62440114

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Văn Ngọc Hướng

2 GS.TS Nguyễn Đình Thành

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả được nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 3 năm 2016

Ký tên

Vương Văn Trường

LỜI CẢM ƠN!

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Văn Ngọc

Hướng và GS.TS Nguyễn Đình Thành đã giao đề tài, tạo mọi điều kiện và

tận tình hướng dẫn em hoàn thành bản luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lưu Văn Chính đã nhiệt tình giúp đỡ

tôi trong quá trình làm luận án

Tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn đến các thầy, các cô trong Bộ môn Hoá Hữu cơ và các thầy, các cô của Khoa Hoá học đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án này Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và các phòng, ban chức năng đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn đến Đảng uỷ, Ban Tổng giám đốc Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga đã tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện công trình này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Phòng Vật liệu, tập thể Viện Độ bền Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga nơi tôi công tác và tiến hành các thực nghiệm của luận án Tập thể Phòng đã giúp đỡ, động viên

và chia sẻ nhiều khó khăn với tôi trong thời gian qua

Hà Nội, ngày 05 tháng 5 năm 2016 Tác giả luận án

Vương Văn Trường

MỤC LỤC

Trang

1.3.5 Hoạt tính phòng ngừa và chống tái phát ung thƣ của zerumbone 23

2.1 Hoá chất và phương tiện nghiên cứu 37

2.3.6 Phân lập zerumbone bằng phương pháp ép thuỷ lực, chiết và kết

tinh phân đoạn

45

2.8 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone với các chalcone thông

qua cầu liên kết 1-ethylen-4-methylen-1,2,3-triazol

57

2.9 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone với các chalcone thông

qua cầu liên kết trimethylen

62

3.1 Nguyên liệu zerumbone 66

3.3.5 Tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone với các chalcone thông

qua cầu liên kết 1-ethylen-4-methylen-1,2,3-triazol

3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các sản phẩm lai hoá của

zerumbone với các chalcone

147

1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng BTT-VN 10 1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió vùng BTT-VN 11 1.5 Thành phần hoá học tinh dầu củ Gừng gió sau khi đã tách

2.1 Hiệu suất tinh dầu tính theo nguyên liệu tươi của một số cây nghiên

cứu

40

2.2 Thành phần hoá học tinh dầu cây Gừng gió sau khi đã lọc tinh thể

zerumbone (Zingiber zerumbet)

41

2.3 Thành phần hoá học tinh dầu cây Gừng tía (Zingiber purpureum) 41

2.4 Thành phần hoá học tinh dầu Ngải xanh (Zingiber ottensii) 42

2.6 Hàm lƣợng zerumbone trong tinh dầu 4 cây thuốc thuộc họ Gừng 44

3.7 Kết quả tổng hợp của các sản phẩm ngƣng tụ zerumbone với các

hydrazide

78

3.8 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone với hydrazide béo (2a-f)

84

3.9 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone với hydrazide béo (2a-f)

85

3.10 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone với hydrazide thơm (2g-l)

86

3.11 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone với hydrazide thơm (2g-l)

zerumbone oxide với hydrazide béo 3a-f

3.16 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone oxide với các hydrazide béo 3a-f

96

3.17 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone oxide với các hydrazide thơm 3g-l

97

3.18 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các sản phẩm ngƣng tụ

zerumbone oxide với các hydrazide thơm 3g-l

98

3.28 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của các sản phẩm đích 12a-g 125 3.29 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các sản phẩm đích 12a-g 126

3.32 Kết quả tổng hợp các chất trung gian 14a-f 130 3.33 Các tín hiệu trong phổ 1H-NMR của các chất trung gian 14a-f 132 3.34 Các tín hiệu trong phổ 13C-NMR của các chất trung gian 14a-f 133

1.14 Phản ứng tổng hợp bicyclic acid carboxylic từ dẫn xuất dibrom 33

1.17 Phản ứng mở vòng từ dẫn xuất dibrom, phân cắt liên kết 1-2 34 1.18 Phản ứng mở vòng dẫn xuất 3-dimethyl amino, phân cắt liên kết 2-3 35

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.8 Cơ chế phản ứng ngƣng tụ zerumbone với hydrazide 78

3.11b Phổ 1H-1H COSY giãn của hợp chất 2g (khung zerumbone) 81

3.25 Cơ chế chuyển vị Beckman của zerumbone oxime 106

3.43 Phổ 13C-NMR của hợp chất 14b 132

sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep) dùng làm thuốc chữa viêm loét dạ dày thành

tá tràng nổi tiếng từ lâu đời [13]

Hai mươi lăm năm trở lại đây, cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) nổi lên

như là một hiện tượng và được các nhà khoa học Mỹ, Nhật Bản đặc biệt quan tâm nghiên cứu Các nghiên cứu đã chỉ ra hoạt chất zerumbone từ cây Gừng gió là ứng cử viên số một cho nghiên cứu thuốc mới chống ung thư [19,66,68] Cuối năm 2014, Rahman H.S và cộng sự đã tổng kết 150 công trình nghiên cứu về Gừng gió và zerumbone và đã khẳng định zerumbone ức chế mạnh sự phát triển của 17 loại ung thư người khác nhau [83]

Nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên thực vật cho sự phát triển kinh tế xã hội

là một nhiệm vụ chiến lược lâu dài của nhà nước và các nhà khoa học Một trong các hướng nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên thực vật giàu có của đất nước là nghiên cứu các cây dược liệu làm thuốc chữa bệnh cho nhân dân và nâng cao sức khoẻ cộng đồng Đây là việc làm thiết thực và cấp bách Theo hướng này, chúng tôi chọn đề tài

“Nghiên cứu chiết tách và chuyển hoá zerumbone trong một số cây thuốc thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Việt Nam và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư” Đề tài

4 Khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm chuyển hoá được

Đề tài cũng góp phần hỗ trợ cho việc thực hiện thành công Dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nước “Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất viên nang zerumboner

từ cây Gừng gió Việt Nam (Zingiber zerumbet Smith) để hỗ trợ điều trị ung thư”, mã

số CNHD-DASXTN 011/13-15 thuộc Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá dược đến năm 2020

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI ZINGIBER

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Zingiber

Chi Zingiber là chi lớn thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), Zingiber có khoảng

trên 100 loài Các loài này phân bố rộng rãi từ phía Đông Á đến vùng nhiệt đới Australia và đặc biệt có nhiều ở Malaysia [25] Riêng ở Việt Nam, họ Gừng hiện biết có 12 chi với 61 loài [2,3]

Các cây thuộc chi Zingiber có đặc điểm thực vật: là dạng cây thảo, cao

0,5-3,5 m Thân rễ mập phân nhánh nhiều, tạo thành “củ” nằm ngang Thịt “củ” nạc, thơm và có vị the Lá mọc so le theo hai phía đối xứng trên thân; phiến lá hình mác thuôn đến bầu dục dài hoặc hình đường chỉ; cuống lá rất ngắn hoặc hầu như không có; bẹ lá nguyên hoặc xẻ hai thùy; lá có mùi thơm nhẹ Cụm hoa bông, thường mọc

từ thân rễ, đôi khi ở ngọn “thân giả” Các hoa mọc sít nhau và mỗi hoa được bao bởi một lá bắc sắp xếp như dạng vẩy cá từ dưới lên trên; lúc đầu thường có màu xanh, sau chuyển dần sang màu vàng, đỏ nhạt, vàng sáng hoặc đỏ; cánh hoa hình ống mảnh, màu trắng, vàng hoặc hồng; bao phấn thường có dạng hình ống bao lấy vòi nhụy, bầu ba ô nhẵn hoặc có lông dày; quả nang 3 ô; hạt nhiều, hình trứng hay trái xoan, màu nâu đỏ, đen, trắng hay vàng [5]

Ở Việt Nam, Phạm Hoàng Hộ đã thống kê chi Zingiber gồm 11 loài [5]: Gừng (Zingiber officinale Roscoe), Gừng lá nhọn (Zingiber acuminatum Valeton), Gừng Nam Bộ (Zingiber cochinchinesis Gagn.), Gừng Eberhardt (Zingiber

eberhardtii Gagn.), Gừng lúa (Zingiber gramineum Bl.), Gừng một lá (Zingiber monophylum Gagn.), Gừng bọc-da (Zingiber pellitum Gagn.), Gừng tía (Zingiber purpureum Roscoe), Gừng đỏ (Zingiber rubens Roxb.), Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.), Gừng gió (Zingiber zerumbet (L) J E Sm.)

Nhiều loài trong chi Zingiber không chỉ là cây thuốc quí mà còn là nguồn

nguyên liệu có giá trị trong chế biến thực phẩm Các sản phẩm chế biến từ nhiều

loài thuộc chi Zingiber được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á nói riêng và

trên toàn thế giới nói chung [14]

1.1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu chi Zingiber

Thành phần tinh dầu của các cây họ Gừng nói chung cũng như các loài

Zingiber nói riêng đều rất phong phú Tuy nhiên thành phần chính vẫn là các chất

terpenoid

Tinh dầu Z officinale Ấn Độ có chứa hơn 50 hợp chất terpenoid khác nhau

gồm các hydrocarbon sesquiterpen, các sesquiterpen alcohol và các monoterpenoid Trong đó thành phần chính là zingiberene chiếm 39,12% và ar-curcumen chiếm 13,85% Zingiberene được biết đến với nhiều tính chất quí được sử dụng trong

ngành dược phẩm và hương liệu Trong tinh dầu thân rễ của Z purpureum, các

thành phần chính là monoterpen sainene chiếm 24,76% và terpineol chiếm 20,06% Terpineol cũng được sử dụng nhiều trong pha chế nước hoa và hương liệu Thành

phần chính của tinh dầu Z zerumbet là các hydrocarbon sesquiterpen, trong đó

thành phần chính là α-humulen chiếm 12,6%, monocyclic sesquiterpen keton zerumbone chiếm 34,71% Trong đó zerumbone là dẫn xuất oxi hoá của humulen được biết đến là chất có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh và đặc biệt là ức chế được nhiều dòng tế bào ung thư người [43]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY GỪNG GIÓ (Zingiber zerumbet Smith)

Cây Gừng gió có tên khoa học là Zingiber zerumbet (L) J E Sm (hay

Zingiber zerumbet Sm.) thuộc chi Gừng (Zingiber), họ Gừng (Zingiberaceae)

Ngoài ra cây Gừng gió còn có một số tên đồng nghĩa sau: Amomum zerumbet L (1753); Zingiber amaricans Blume (1872); Z.aromaticum Valeton (1918); Z

littorale Valeton (1918) [11] Ở mỗi nước, cây Gừng gió được gọi với nhiều tên

riêng: Riềng dại, Ngải mặt trời, Ngải xanh (Việt Nam), Khuhet phtu, Prateal vong atit (Campuchia), Gingembre fou (Pháp) và Phong khương (Trung Quốc) [2,5,13,14]

Nhưng trong quá trình phát triển ở các vùng lãnh thổ khác nhau, khí hậu khác nhau, nhiệt độ khác nhau loài Gừng gió (Z zerumbet) có nhiều thay đổi: Có loại Gừng gió (Z zerumbet) có hoa màu đỏ; có loại Gừng gió (Z zerumbet) có hoa màu trắng; cũng có loại Gừng gió (Z zerumbet) có hoa vừa đỏ vừa trắng Xem ảnh minh ho ̣a dưới đây (Hình 1.2) [6]

Trong luận văn của mình chúng tôi chọn loại Gừng gió có hoa màu đỏ, ruột

củ màu vàng xanh, vị the và không cay (xem Hình 1.1)

Hình 1.1: Ảnh cây, hoa và lát cắt cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Smith) vùng

Tam Đảo-Vĩnh Phúc; Ảnh Nguyễn Quốc Bình (11/2011)

Hình 1.2: Mười loại Gừng gió đã biến đổi

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Là dạng cây thảo, cao 1,2-1,7 m Thân rễ (“củ”) phân nhánh, vỏ ngoài màu trắng nhạt, thịt củ màu vàng nhạt hay màu vàng sáng, có mùi thơm Ống bẹ lá sắp xếp sít nhau tạo thành thân giả, phía ngoài có lông rải rác; lưỡi gà nguyên, dài 1,5-2,5 cm Lá mọc cách, ở hai phía đối nhau, gần như không cuống; phiến lá hình mác thuôn, kích thước 25-40 x 4-5 cm, thon ở gốc, chóp lá hình nhọn, mặt trên xanh lục đậm, mặt dưới xanh nhạt và có lông rải rác Cụm hoa bông, hình trụ hay trứng, kích thước 6-14 x 4-5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ, trên cán dài 10-30 cm, thẳng, có nhiều vẩy xếp lợp lên nhau bao quanh Cụm hoa có nhiều lá bắc xếp lợp lên nhau, lá bắc gần hình trứng, kích thước 3-4 x 2,5 cm Khi còn non có màu xanh, già lại chuyển sang màu đỏ Hoa mọc ở mỗi kẽ lá bắc; đài hình ống, dài 2,5 cm, ngắn hơn

lá bắc, màu trắng tràng hoa hình ống, dài 5-5,5 cm với các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ, kích thước 1,6 x 0,7 cm; môi dài 5 cm, mép có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ô Quả nang hình trụ hay bầu dục, dài 1,5 cm, khi chín có màu đỏ; hạt ít, màu đen, áo hạt màu trắng [14]

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố

Nhiều tác giả cho rằng Gừng gió có nguồn gốc từ Ấn Độ, được người dân nơi đây trồng và tự nhiên hóa tại nhiều nước Châu Á (Sri Lanka, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Malaysia, Indonesia, Philippin, Campuchia, Thái Lan…) Gừng gió là loài cây có nguồn gen đa dạng, sinh trưởng nhanh, chống chịu khỏe, nên có khả năng tự nhiên hóa mạnh [13,14]

Ở Việt Nam, cây mọc rải rác ở các tỉnh trung du, vùng núi thấp và đôi khi cả

ở đồng bằng Cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc ở ven rừng và dưới tán rừng kín ở vùng trung du và đồng bằng, cây mọc lẫn trong các lùm bụi dưới chân đồi hoặc quanh các làng bản [2]

1.2.3 Thành phần hoá học của cây Gừng gió

Để sử dụng triệt để và có hiệu quả cây Gừng gió, người ta nghiên cứu thành phần hoá học của nó Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chính của cây Gừng gió là các terpenoid, đặc biệt là các sesquiterpenoid và các dẫn xuất oxy của chúng Các hợp chất này nằm trong tinh dầu củ cây Gừng gió, vì vậy điều quan tâm trước tiên trong thành phần hoá học cây Gừng gió chính là tinh dầu của nó Nghiên cứu tinh dầu cây Gừng gió nhằm mục đích cho sự phát triển của công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hương liệu và mỹ phẩm Các nước đóng góp nhiều nhất trong lĩnh vực này là Pháp, Ấn Độ, Malaysia, Bangladesh [24,27,33,40,87,97] Tất cả các bộ phận của cây Gừng gió đều có tinh dầu Hàm lượng tinh dầu cũng như thành phần hoá học của tinh dầu ở các bộ phận khác nhau hoàn toàn khác nhau Ở mỗi bộ phận cây Gừng gió, hàm lượng tinh dầu và thành phần tinh dầu thay đổi theo mùa vụ, vùng trồng, khí hậu và thổ nhưỡng

1.2.3.1 Thành phần hoá học củ Gừng gió

Củ Gừng gió không có vị cay nhưng có mùi thơm mạnh, dễ chịu nên hàm lượng tinh dầu khá lớn Nghiên cứu củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự khẳng định rằng tinh dầu củ Gừng gió vùng này điều chế theo phương pháp cất cuốn hơi nước cho hiệu suất 0,25% Tinh dầu củ Gừng giómọc ở vùng Bình Trị Thiên (BTT) và Đắc Lắc (ĐL)-Việt Nam có các chỉ số hóa học được dẫn ra trong Bảng 1.1 [1] và thành phần hoá học được phân tích GC-MS được trình bày trong Bảng 1.2 [1,70] Bảng 1.2 cho thấy, tinh dầu củ Gừng gió Bình Trị Thiên có 7 thành phần chính, trong đó thành phần có hàm lượng lớn nhất là zerumbone chiếm 72,3% khối lượng tinh dầu, sau đó là humulen chiếm 4,2% Hầu hết các thành phần chính là sesquiterpen chúng chiếm 88,2% tổng lượng tinh dầu Nếu so sánh hàm lượng zerumbone trong tinh dầu cây Gừng gió BTT với tinh dầu Gừng gió Bang Kerala Miền Nam Ấn Độ thì thấp hơn (hàm lượng zerumbone trong tinh dầu vùng này là 76,3-84,8) [87]

Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió vùng BTT và ĐL-Việt Nam

1.2.3.2.Thành phần hóa học của tinh dầu thân và lá Gừng gió

Đặc điểm của cây Gừng gió là thân thảo mềm, thân gắn liền với lá nên khi khai thác thường khai thác thân lá với nhau Do đó việc nghiên cứu tinh dầu là nghiên cứu chung cho cả thân và lá Vào năm 1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự

đã điều chế tinh dầu thân lá Gừng gió BTT bằng phương pháp cất cuốn hơi nước, kết quả phân tích thành phần bằng GC-MS được cho ở Bảng 1.3[71]

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng BTT-VN

(%)

Lá (%) TT Tên chất

Thân (%)

Lá (%)

1.2.3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió

Bằng phương pháp cất cuốn hơi nước, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã thuđược tinh dầu hoa Gừng gió với thành phần được cho trong Bảng 1.4 [1,71]

Hơn 40 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh trưởng vùng BTT (chiếm khoảng 85 % tinh dầu) [1,71] và được chỉ ra trong Bảng 1.4

Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió vùng BTT-VN

lượng (%) TT Tên chất

Hàm lượng (%)

13

Qua bảng trên cho thấy, tinh dầu hoa Gừng gió có thành phần phức tạp hơn

so với tinh dầu củ và thân lá Tinh dầu hoa có tới 42 thành phần trong khi đó tinh dầu củ Gừng gió chỉ có 31 thành phần Nhưng điều đáng chú ý nhất là trong tinh dầu hoa Gừng gió vẫn có zerumbone với hàm lượng khá cao chiếm 3,2%

Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học củ, thân lá và hoa Gừng gió cho thấy một điều thú vị là thành phần β-caryophynen và zerumbone đều có trong thành phần tinh dầu của tất cả các bộ phận này Trong đó hàm lượng zerumbone là cao nhất trong củ, sau đó là thân lá và cuối cùng là hoa Nếu như tinh dầu Gừng gió vùng BTT có hàm lượng zerumbone thấp hơn tinh dầu Gừng gió Bang Kerala Miền Nam Ấn Độ, thì tinh dầu vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc lại có hàm lượng zerumbone cao hơn khá nhiều [8]

Văn Ngọc Hướng và cộng sự là những người đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thành phần hoá học tinh dầu cây Gừng gió vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc, xây dựng qui trình phân lập zerumbone từ tinh dầu có độ tinh khiết cao và hiệu suất tốt,

đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn và chống ung thư cả in vitro và in vivo Kết

quả cho thấy, tinh dầu củ Gừng gió vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc điều chế theo phương pháp cất cuốn hơi nước trong thiết bị đặc biệt có hiệu ứng muối cho hiệu suất gần 1,4% tính theo nguyên liệu tươi Tinh dầu có chất lượng tốt, màu vàng chanh, mùi dễ chịu và khi để lạnh thì kết tinh zerumbone Sau khi lọc thu tinh thể zerumbone, tinh dầu được phân tích GC-MS, kết quả được cho trong Bảng 1.5[8]

Bảng 1.5: Thành phần hoá học tinh dầu củ Gừng gió sau khi đã tách zerumbone kết

1.2.3.4 Các thành phần phi terpenoid trong củ Gừng gió

* Các curcuminoid

Curcuminoid là các sắc tố màu vàng tươi cho đến vàng thẫm Nó rất phổ

biến trong các cây thuộc họ Gừng, đặc biệt là chi Nghệ (Curcuma) mà điển hình là cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Do đó việc các nhà nghiên cứu Matthes

H.W.D, Luu B và Ourisson G (năm 1980) đã phân lập từ cặn chiết ether của củ

Gừng gió Trung Quốc được 3 curcuminoid là: diferuloylmethan (I), coumaroylmethan (II) và di-p-coumaroylmethan (III) [63] là điều dễ hiểu

feruloyl-p-* Các flavonoid

Năm 1980, cùng với việc phân lập được các curcuminoid các nhà nghiên cứu Matthes H W D., Luu B., và Ourisson G cũng phân lập được từ củ Gừng gió Trung Quốc một flavonol glycozit 3",4"-O-diaxetylafzelin (IV) [63]

Tiếp đó năm 1991, nhóm các nhà nghiên cứu Nhật Bản Masuda T., Jitoe A., Kato S và Nakatani N đã công bố phân lập được 4 flavonol glycozit từ cặn chiết axeton của củ Gừng gió Nhật Bản, lần lượt là: 2-O-axetyl-α-L-rhamnopyranozit (IV); 3-O- axetyl-α-L-rhamnopyranozit (V); 4-O- axetyl-α-L-rhamnopyranozit (VI), 3-O- α-axetyl-L-rhamnopyranozit (VII) [62]

1.2.4 Y học dân tộc và cây Gừng gió

Cây Gừng gió từ lâu đã được sử dụng phổ biến làm gia vị truyền thống trong nhiều món ăn và đồ uống ở Châu Á, trong khi tinh dầu của nó được sử dụng làm nước hoa Bên cạnh việc sử dụng làm gia vị thì riêng phần củ được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân tộc truyền thống để trị buồn nôn, chóng mặt, hen suyễn, say tàu

xe, chán ăn, khó tiêu, tiêu chảy, đau bụng, chuột rút, bong gân, ho, cảm lạnh, viêm họng, viêm xoang, đau nửa đầu, đau răng, tiểu đường, viêm khớp, thấp khớp [83]

Hiện nay, dịch chiết từ củ Gừng gió đã được nghiên cứu và cho thấy nó có hoạt tính sinh học rất phong phú như kháng khuẩn, hạ sốt, chống co giật, kháng viêm, chống ôxy hoá, trị đái đường, kháng u, chống ung thư, chống đông máu, giảm cholesterol,…[83]

Gừng gió có vị đắng, tính ấm, có tác dụng tán phong hàn, tán huyết ứ, kích thích, bổ và lọc máu, được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nhiều nướcChâu Á [2,13]

Trong y học dân gian của Việt Nam, nhân dân thường dùng củ Gừng gió làm thuốc kích thích, bồi dưỡng sức khỏe, tẩy độc và chữa viêm đau khớp Sau đây là một số bài thuốc cổ truyền dùng Gừng gió của nhân dân ta [2,4]:

+ Chữa bệnh chóng mặt, nôn nao, muốn ngất xỉu và dùng cho phụ nữ sau khi sinh: dùng củ thái mỏng, ngâm trong rượu 40-50o với liều 40-50 g tươi hay sấy khô trong một chai 650 ml Ngâm trong thời gian 15-20 ngày, gạn lấy rượu uống Mỗi ngày dùng 2-3 ly nhỏ (mỗi ly 15-20 ml)

+ Chữa trúng gió lạnh, bị ngất, tay chân giá lạnh: củ Gừng gió 20-30 g đem giã nhỏ chế thêm rượu, vắt lấy nước cốt uống, còn bã chưng nóng xoa bóp khắp mình

+ Chữa bị thương ứ máu, sưng tấy: dùng củ Gừng gió, Nghệ vàng, Nghệ đen mỗi vị 15 g đem giã nhỏ, chế thêm 1 chén giấm, vắt lấy nước cốt uống rồi lấy bã chưng nóng đắp vào chỗ đau

+ Chữa trâu bò, voi và ngựa bị dịch mùa hè, mắt đỏ, ăn không nuốt được: củ Gừng gió, Cốt khí tím, Chỉ thiên, Sắn dây các vị bằng nhau, giã thật nhỏ, hòa với nước uống

Tại Inđônêxia, củ Gừng gió được sử dụng làm thuốc kích thích đối với lớp màng niêm mạc dạ dày, ruột; làm thuốc chữa các bệnh đau dạ dày, tiêu chảy, kiết lị, sỏi mật … hoặc đắp ngoài để chữa các vết thương

Ở Lào, Campuchia, người ta coi củ Gừng gió là dược thảo có tác dụng tăng cường thể lực, được dùng làm thuốc bổ dưỡng, kích thích và làm thuốc lọc máu [14]

Ở Malaixia, củ Gừng gió được dùng làm thuốc chữa đau dạ dày, chữa chân tay bị co quắp, chữa bệnh ngoài da và dùng cho phụ nữ sau khi sinh nở để phòng bệnh sản phụ và tránh bị nhiễm trùng [14]

Ở Brunei Darussalam, người dân dùng nước sắc từ củ Gừng gió pha nước tắm cho trẻ sơ sinh; dùng lá Gừng gió hơ nóng để chữa viêm đau khớp và giảm đau nhức do mụn nhọt Còn người dân Philippin lại thường dùng củ Gừng gió phơi khô,

tán nhỏ thành bột làm thuốc chữa bệnh tiêu chảy, dùng củ Gừng gió sắc làm thuốc uống chữa ho và đặc biệt là điều trị bệnh viêm thấp khớp [14]

1.3 TỔNG QUAN VỀ ZERUMBONE

1.3.1 Nguồn gốc, cấu trúc và tính chất vật lý của zerumbone

Zerumbone (1) hay

(2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethyl-cycloundeca-2,6,10-trien-1-one được Dev S và cộng sự phân lập từ tinh dầu củ cây Zingiber zerumbet

vào năm 1956 [29], được xác định cấu trúc vào năm 1960 [29] và sau đó được chứng minh bằng phổ NMR [30] và tia X [34] Zerumbone có công thức phân tử

C15H22O, khối lượng phân tử 218,3, là tinh thể hình kim màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 65,3 oC, nhiệt độ sôi 321-322oC/760mmHg Zerumbone tan tốt trong các dung môi như ethanol, DMSO, trong nước ở 25 oC nó có độ tan 1,296 mg/L Zerumbone

có độ ổn định tối thiểu 2 năm khi được bảo quản dưới -20 o

C [83]

Zerumbone là một sesquiterpen đơn vòng 11 cạnh [51], trong cấu trúc có chứa 3 liên kết đôi; 1 liên kết đôi độc lập ở C6, 2 liên kết đôi ở C2 và C10 cùng với nhóm C=O tạo thành hệ dienon liên hợp Trong đó, liên kết đôi ở C2 là ít bị cản trở

nhất do nó cách xa nhóm thế gem-dimethyl ở C9 nhất Cấu trúc tia X cho thấy hệ

dienon nằm trong một mặt phẳng hơi méo và vuông góc với mặt phẳng chứa liên kết đôi độc lập ở C6 [54]

Công thức cấu tạo của zerumbone

1.3.2 Nguồn nguyên liệu cho zerumbone

Zerumbone được phân lập và xác định cấu trúc lần đầu tiên từ tinh dầu thân

rễ cây Z zerumbet năm 1960 [29] Tuy nhiên hàm lượng zerumbone trong tinh dầu

cây Z zerumbet lại thay đổi theo vùng, ví dụ hàm lượng zerumbone trong tinh dầu

cây Gừng gió trồng tại Bang Kerala ở Nam Ấn Độ có hàm lượng zerumbone từ

76,3÷84,8%, trong khi đó hàm lượng zerumbone trong tinh dầu cây Z zerumbet ở

Malaysia và Tahiti Island thấp hơn với hàm lượng lần lượt là 68,9% [87], 65,3% [40] Ở Việt Nam, hàm lượng zerumbone trong tinh dầu củ Gừng gió cũng thay đổi theo vùng, theo Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự hàm lượng zerumbone trong tinh dầu của Gừng gió vùng Bình Trị Thiên đạt 72,3% [70] Theo Văn Ngọc Hướng và cộng sự thì hàm lượng zerumbone cao nhất trong tinh dầu củ Gừng gió tại Vĩnh Phúc đạt 89,7% trong 5 tỉnh khảo sát gồm Lạng Sơn, Lào Cai, Sơn La, Hà Tây,

Vĩnh Phúc [12] Hàm lượng zerumbone trong cây Z zerumbet khác nhau phụ thuộc

vào bộ phận của cây, tuy nhiên hàm lượng zerumbone cao nhất ở thân rễ và thấp hơn ở lá và hoa Bảng 1.6 sau đây liệt kê hàm lượng zerumbone trong tinh dầu cây

Z zerumbet ở một số vùng trên thế giới

Bảng 1.6: Hàm lượng zerumbone trong tinh dầu cây Z zerumbet ở một số vùng

Ngoài Z zerumbet, zerumbone còn được tìm thấy trong một số cây thuộc họ

Zingibereceae, Bảng 1.7 sau đây liệt kê một số cây đã phát hiện có zerumbone

Bảng 1.7: Một số cây đã phát hiện có chứa zerumbone

Tên cây Vùng lãnh thổ Bộ phận

cây

Hàm lượng zerumbone (%)

Tài liệu tham khảo

Ngoài ra, người ta cũng tìm thấy zerumbone (4,0%) trong quả của cây

Xylopia aethiopica (Dunal) A Richard thuộc họ Na (Annonaceae) tại vùng Ibadan tây nam Nigieria [105]

1.3.3 Các phương pháp phân lập zerumbone

Mọi phương pháp phân lập zerumbone từ củ cây gừng gió đều nhằm thu được zerumbone đạt độ tinh khiết trên 98% để làm dược liệu với hiệu suất tốt mang lại hiệu quả kinh tế và có tính khả thi để áp dụng vào thực tế sản xuất Qua tham khảo các tài liệu đã công bố, có thể chia các phương pháp phân lập zerumbone thành 2 nhóm

1.3.3.1 Phân lập zerumbone qua tinh dầu

Từ củ Gừng gió tươi, Hitayama và cộng sự đã điều chế tinh dầu, rồi phân lập

ra zerumbone từ tinh dầu, tuy nhiên hiệu suất thu tinh dầu chỉ đạt 0,1-0,3% [33] Cũng theo cách này Salaiman và cộng sự cũng thu được tinh dầu với hiệu suất thấp đạt 0,2%

Trong đề tài cấp Nhà Nước mã số CNHD-ĐT018/10-11, PGS.TS Văn Ngọc Hướng và cộng sự đã xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất zerumbone có độ tinh khiết 99,5% với hiệu suất 0,38% từ củ Gừng gió tươi vùng Tam Đảo - Vĩnh Phúc Qui trình được thực hiện như sau: Nghiền nhỏ củ Gừng gió tươi, rồi cất cuốn hơi nước trong thiết bị đặc biệt có hiệu ứng muối (NaCl) có bẫy tinh dầu bằng dung môi, sau đó chiết dịch cất với dung môi, loại dung môi thu tinh dầu và để kết tinh phân đoạn tinh dầu thu được zerumbone Rõ ràng so sánh với các phương pháp khác, phương pháp này là phương pháp đơn giản, có hiệu suất tốt và kinh tế và có khả năng ứng dụng vào thực tế để sản xuất zerumbone [6]

1.3.3.2 Phân lập zerumbone bằng phương pháp chiết

a, Đi từ nguyên liệu củ Gừng gió tươi: Nghiền củ Gừng gió tươi rồi chiết

bằng MeOH hay EtOAc, loại dung môi thu cặn chiết, SKC cặn chiết để thu được zerumbone [34] Hiệu suất toàn bộ quá trình này không vượt quá 0,1% tính theo nguyên liệu tươi Cũng theo phương pháp này, tác giả Abdul và cộng sự chỉ thu được zerumbone với hiệu suất 0,062% tính theo nguyên liệu tươi [19]

b, Đi từ nguyên liệu củ Gừng gió khô

Vì nước trong củ Gừng gió tươi ngăn cản việc chiết tinh dầu bằng dung môi không phân cực Vì vậy người ta thái mỏng củ gừng gió, phơi khô, nghiền nhỏ và chiết bằng dung môi sau đó loại bỏ dung môi thu cặn chiết và SKC để thu được zerumbone Theo cách này Uraiwan Songsiang và cộng sự thu được zerumbone với hiệu suất 0,37% tính theo nguyên liệu khô, nếu tính theo nguyên liệu tươi là 0,03% [106]

1.3.4 Hoạt tính sinh học của zerumbone

Trong 35 năm trở lại đây, hoạt tính sinh học của zerumbone được nhiều nhà

khoa học quan tâm nghiên cứu Kết quả nghiên cứu cả in vitro và in vivo cho thấy

zerumbone có hoạt tính chống ung thư, chống viêm, chống oxi hoá, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch, chống xơ vỡ động mạch, giảm đau và kháng khuẩn [83]

Trong đó hoạt tính chống ung thư và chống tái phát ung thư được nghiên cứu nhiều nhất Năm 2014, Rahman H S và cộng sự đã tổng kết 150 công trình nghiên cứu cây Gừng gió và hoạt tính chống ung thư của zerumbone phân lập từ cây Gừng gió

và nhận thấy zerumbone ức chế mạnh sự phát triển của 17 loại ung thư người khác nhau như ung thư gan [69,74-76,89,92], ung thư tử cung [20], ung thư phổi [45,78], ung thư vú [101,110], ung thư đại tràng [45], ung thư tụy [101], ung thư buồng trứng [19], ung thư da [68], ung thư P-388D1 [37], ung thư máu [18,21,22,31,46,83,102,107]

Ở Việt Nam, năm 2005, PGS TS Văn Ngọc Hướng trong công trình nghiên cứu về hoạt chất chống ung thư và HIV từ cây cỏ Việt Nam, đã chiết tách

zerumbone từ củ cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) vùng Tam Đảo và khảo sát hoạt tính chống ung thư in vitro đối với 3 dòng ung thư người Hep-2, RD, KB; kết

quả cho thấy zerumbone ức chế mạnh đối với sự phát triển của dòng ung thư biểu

mô KB, ung thư màng tim RD và ung thư gan Hep-2 (Bảng 1.8) [7]

Bảng 1.8: Cường độ gây độc tế bào ung thư của zerumbone in vitro

So sánh hoạt tính chống ung thư đại tràng in vivo của zerumbone với

curcumin I, người ta thấy hoạt tính của zerumbone mạnh hơn của curcumin I rất nhiều, IC50 của zerumbone là 1,27 μg/ml, trong khi đó IC50 của curcumin I là 9,4 μg/ml [71]

So sánh hoạt tính chống ung thư của zerumbone với hoạt tính chống ung thư của cis-platin đối với ung thư tử cung người Hela, Abdul A B H và cộng sự nhận thấy IC50 của zerumbone là 2,5 μg/ml và IC50 của cis-platin là 1,6μg/ml Kết quả này cho thấy viễn cảnh tốt đẹp của zerumbone trong việc phát triển thuốc mới cho điều trị ung thư tử cung [20]

Khảo sát chi tiết hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan của zerumbone và platin, Sharifash Sakinah S A và cộng sự khẳng định rằng zerumbone gây độc chọn lọc tế bào ung thư, chống sự phát triển đột biến, còn cis-platin không có tính chất chọn lọc, nó độc với cả tế bào ung thư (cancerous cells) lẫn tế bào thường (non-cancerous cells) Các số liệu của họ cũng khẳng định cis-platin gây độc tế bào ung thư gan Hep G2 (IC50=7,08±0,073 μg/ml) yếu hơn so với độ độc của zerumbone đối với Hep-G2 (IC50=3,15±0,026 μg/ml) Điều này cho thấy zerumbone cũng rất có triển vọng trong việc nghiên cứu thuốc điều trị ung thư gan [92]

cis-Nghiên cứu hoạt tính chống ung thư của các loại thuốc, các công trình nghiên cứu tập trung đi sâu vào cơ chế tác dụng của thuốc với hy vọng tìm ra thuốc mới Với zerumbone cho đến nay, có ba cơ chế đã được các nhà khoa học đề cập

1.3.4.1.Cơ chế sinh học phân tử [103]

Cơ sở khoa học của cơ chế này đã được nhà khoa học Mỹ Takada nêu ra năm

2005 Cơ chế này dựa vào yếu tố nhân (NF-kB) (Nuclear factor kappa B) trong quá trình phát triển sinh học Cho đến nay, người ta đã khẳng định mọi tế bào đều có NF-kB và I-kB (inhibit-kappa B) Ở trạng thái bình thường NF-kB và I-kB liên kết không đồng hóa trị với nhau Nhưng vì một lý do nào đó như tác động độc hại của tia phóng xạ, của hóa chất, suy thoái môi trường hay sự xâm nhập của các vi khuẩn,

…, làm cho I-kB bị mất tác dụng điều khiển sự sinh sản tế bào theo lập trình của NF-kB, nên NF-kB được giải phóng và trở nên hoạt động bất thường

Chính sự hoạt động bất thường của NF-kB là nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh tật cho con người, đặc biệt là bệnh ung thư, viêm nhiễm, thần kinh, Alzheimer,… Theo Takada và cộng sự, zerumbone đóng vai trò như một I-kB, nó liên kết với NF-kB hoạt động nhờ nhóm chức sinh học của mình, gây ức chế sự hoạt động bất thường của NF-kB nên ngăn chặn được các bệnh tật do NF-kB hoạt hóa gây ra như bệnh ung thư, các bệnh viêm nhiễm,…

1.3.4.2 Cơ chế oxi hóa khử [36]

Cơ chế này được Hoffman A và cộng sự nêu lên năm 2002 Trong chu trình phát triển của tế bào luôn tồn tại cặp Glutathione (GSH) và Glutathyl sunphua (GS-SG) Cặp oxi hóa khử này có điện thế oxi hóa khử E = log(GS-SG)/(GSH)2

Tốc độ phát triển tế bào khác nhau thì nồng độ các tác nhân của cặp điện thế này thay đổi Do đó, điện thế E thay đổi Trong quá trình điều trị ung thư bằng zerumbone, do có sự cộng hợp ái nhân của GSH vào nhóm carbonyl α, β- không no của zerumbone tạo ra sản phẩm cộng hợp Michael làm cho nồng độ GSH thay đổi

và dẫn đến thay đổi điện thế E Như thế theo dõi điện thế E của tế bào ung thư (khối u) trong quá trình điều trị bằng zerumbone không những cho biết tác dụng của zerumbone đến sự phát triển của tế bào ung thư mà còn cho phép xác định được liều điều trị (dose treatment) của zerumbone cho đến lúc điện thế E của tế bào ung thư (khối u) bằng điện thế E của tế bào bình thường

1.3.4.3 Cơ chế thúc đẩy quá trình chết theo lập trình (apoptosis mechanism)

Tháng 12 năm 2009, trong phát minh của mình về nghiên cứu điều trị tế bào ung thư Hela bằng zerumbone, Abdul A.B.H đã khẳng định cơ chế này [18] Apoptosis là cách để tế bào tách ra khỏi mô già như là một phần trong cơ chế duy trì quá trình phát triển bình thường của cơ thể Apoptosis cũng là cách hối thúc các

tế bào già tự nguyện chết, không phải bắt buộc chết (cái chết này cũng là chết sinh

lý chủ động, nó khác với chết bệnh lý thụ động (neucrosis) Nó được gọi là cái chết

“sạch sẽ” của sinh học bởi tất cả các xác chết đều được chủ động dọn dẹp nhờ thực bào phân giải nên không có bất kỳ dấu tích nào để lại [17] Nếu quá trình Apoptosis

bị tổn thương hay bị khóa không thực hiện được thì các tế bào già, tế bào hư hỏng không bị chết mà vẫn phát triển phân chia vô tội vạ Khi đó sự cân bằng sinh học bị phá vỡ và gây nên bệnh tật, nhất là bệnh ung thư

Như thế, xúc tiến được quá trình Apoptosis của tế bào ung thư chính là lập lại được sự cân bằng sinh tử làm cho tế bào phát triển bình thường Điều này đã

được Abdul khẳng định in vitro trong khi nghiên cứu tác dụng của zerumbone lên tế

bào ung thư người Hela [18]

1.3.5 Hoạt tính phòng ngừa và chống tái phát ung thư của zerumbone

Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan tâm nghiên cứu hoạt tính phòng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone Đây là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỷ này Để khảo sát hoạt tính phòng ngừa ung thư Murakami A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức chế của zerumbone đối với tác nhân gây ung thư TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) do hoạt động của virut Epstein-Barr tạo ra Kết quả cho thấy zerumbone

là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 μM) [67] Các kết quả nghiên cứu trong năm 2006 của PGS.TS Văn Ngọc Hướng và cộng sự cho

thấy zerumbone không những chống lại sự phát triển ung thư báng Sarcoma 180 in

vivo mà còn phòng ngừa tái phát ung thư này ở giai đoạn hậu phẫu thuật Và đây

cũng là lần đầu tiên phát hiện hoạt tính phòng ngừa tái phát ung thư của zerumbone [10]

Để khẳng định nhóm chức có hoạt tính chống ung thư và phòng ngừa ung thư trong phân tử zerumbone, người ta tiến hành so sánh cường độ ức chế tác nhân gây ung thư của zerumbone với cường độ ức chế của các dẫn xuất của nó như sau:

Μm Kết quả trên cho thấy, nếu khử hoá nhóm chức carbonyl của zerumbone thành nhóm alcol (zerumbol) hay khử sâu hơn thành nhóm methylen (humulen) thì hoạt tính chống ung thư của zerumbone giảm đi một cách rõ rệt từ 0,14 μM