Mục tiêu luận án: Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib hydrocloride. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc dẫn xuất quinazoline. Nghiên cứu tổng hợp và xác định cấu trúc của các hợp chất lai giữa các dẫn xuất quinazoline với các azide qua cầu nối triazole. Mời các bạn tham khảo!
VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HĨA HỌC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT QUINAZOLIN Chuyên ngành : Hóa học hữu Mã số : 9.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Văn Tuyến TS Đặng Thị Tuyết Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Số 18 - Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi … ngày tháng năm 2019 A GIỚI THIỆU VỀ LUẬN ÁN Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Quinazoline lớp chất đầy tiềm thiết kế tổng hợp loại thuốc chống ung thư theo chế ức chế enzyme kinase [1-4] Gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva), lapatinib (Tykerb) vandetanib (Caprelsa) hợp chất quinazoline tiêu biểu đưa vào sản xuất thuốc điều trị ung thư Trong Gefitinib Erlotinib thuốc hoá trị liệu thụ thể yếu tố tăng sinh biểu bì (EGFR) hệ sử dụng để điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ Thuốc Erlotinb dẫn xuất quinazoline có tên thương mại Tarceva, sản xuất hãng dược phẩm Hoffmann La Roche Thuốc sử dụng có hiệu cao cho điều trị bệnh ung thư phổi khơng phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) có đột biến hoạt hóa EGFR Đây phương pháp đột phá điều trị UTPKPTBN tạo hội kéo dài thời gian sống với chất lượng sống cao Ở Việt Nam, thuốc Tarceva có thành phần erlotinib hydrochloride chưa sử dụng rộng rãi, trước hết chi phí điều trị Tarceva đắt tiền, 2.000 USD/chu kỳ điều trị (một chu kỳ =1 tháng), giá bán thị trường Việt Nam khoảng 42 triệu đồng/lọ /30 viên loại 150mg Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất quinazolin” hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn Mục tiêu luận án: Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc erlotinib hydrocloride Nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc dẫn xuất quinazoline Nghiên cứu tổng hợp xác định cấu trúc hợp chất lai dẫn xuất quinazoline với azide qua cầu nối triazole Nghiên cứu thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất lai tổng hợp ba dòng tế bào ung thư người bao gồm KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi tế bào nhỏ) Điểm luận án: a Đã tổng hợp thành cơng erlotinib hidrocloride theo quy trình cải tiến b Tổng hợp 23 dẫn xuất quinazoline 19 dẫn xuất lai chứa vòng triazole: * dẫn xuất lai erlotinib với azide khác qua cầu nối triazole * dẫn xuất quinazoline -4- amin chứa nhóm crown ete vị trí C-6, C-7 theo đường hồn tồn Các dẫn xuất dùng để lai hóa với azide có hoạt tính khác qua cầu nối triazole phản ứng click * 15 hợp chất lai crown ether quinazoline với azide qua cầu nối triazole c Đã khẳng định cấu trúc hợp chất lai từ kết phân tích liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR 13CNMR, HMBC, HSQC) phổ khối lượng (HRMS) d Đã đánh giá hoạt tính 19 dẫn xuất quinazoline ba dòng tế bào ung thư người bao gồm KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi tế bào nhỏ) có 13 chất có khả gây độc tế bào ung thư khảo sát Trong số có chất thể hoạt tính chống tế bào ung thư mạnh với giá trị IC50 có giá trị từ đến µM e Sử dụng mơ protein docking để dự đốn hoạt tính hướng đích hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c f Đã tổng hợp hợp chất 122a có hoạt tính ức chế mạnh ba dòng tế bào KB, Hep-G2 Lu với giá trị IC50 tương ứng 0,04 µM, 0,14 µM 1,03 µM, tương ứng cao gấp 100 lần so với erlotinib Hợp chất 123c có giá trị IC50 (1.49; 1.61; 1.81 µM) tương đương với chất chuẩn Ellipticine (IC50 1.95; 2.72; 1.38 µM) Bố cục luận án: Luận án gồm 129 trang gồm: Mở đầu trang Chương 1: Tổng quan 31 trang Chương 2: Thực nghiệm 25 trang Chương 3: Kết thảo luận 57 trang Phần tài liệu tham khảo có 122 tài liệu lĩnh vực liên quan luận án, cập nhật đến năm 2018 Phần phụ lục gồm 62 trang gồm loại phổ chất tổng hợp Phƣơng pháp nghiên cứu Các chất tổng hợp theo phương pháp tổng hợp hữu đại biết, có cải tiến vận dụng thích hợp vào trường hợp cụ thể Sản phẩm phản ứng làm phương pháp sắc kí cột kết tinh lại Cấu trúc sản phẩm xác định phương pháp phổ đại như: IR, HRMS, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, DEPT Hoạt tính sinh học thăm dò theo phương pháp Mossman ba dòng tế bào ung thư KB, Hep-G2và Lu Sử dụng mơ protein docking để dự đốn hoạt tính hướng đích hợp chất tổng hợp B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan luận án trình bày nội dung sau: - Các phương pháp tổng hợp quinazoline - Các phương pháp tổng hợp erlotinib Hoạt tính chống ung thư dẫn xuất quinazoline Phản ứng click Kỹ thuật protein docking CHƢƠNG THỰC NGHIỆM Thực nghiệm gồm 25 trang, trình bày chi tiết phương pháp nghiên cứu, quy trình tổng hợp, tinh chế, tính chất vật lý sản phẩm nhận như: điểm chảy, hình thái, màu sắc, hiệu suất phản ứng liệu chi tiết phổ IR, HRMS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, DEPT CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Luận án tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình tối ưu tổng hợp erlotinib hydrochloride (sơ đồ 3.1) nhằm đưa quy trình tổng hợp erlotinib hydrochloride có khả ứng dụng vào sản xuất Việt Nam, tổng hợp dẫn xuất quinazoline (sơ đồ 3.2) hợp chất lai khung quinazoline với nhóm triazole (sơ đồ 3.3) để tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp erlotinib hydrocloride (93) (a) BrCH2CH2OCH3, K2CO3, Bu4NHSO4, DMF, 110°C; (b) H2O, CH3OH, KOH, 30oC; (c) Urea, 210-220°C; (d) P2O5, xylene, đun hồi lưu; (e) HNO3, acid acetic băng, 0°C; (f) Na2S2O4, H2O, HCl; (g) DMF-DMA, acid acetic, toluen, 105°C; (h) 3-ethynylaniline, acid acetic, toluen, 60-110oC; (i) khí HCl, CH3OH, 15-20°C Sơ đồ 3.2: Tổng hợp dẫn xuất quinazoline chứa nhóm crown ether vị trí C-6, C-7 Thuốc thử điều kiện: (a) NH2OH.HCl, NaOH, MeOH, H2O, khuấy, 30-60 phút, 9598%; (b) Ac2O, hồi lưu, 8-12 h, 90-95%; (c) Na2S2O4, H2O, 50-65oC, 3-4 h, 80-85%; (d) 1,2dicloethan, 1,3-dibrompropan, K2CO3, Bu4NHSO4, acetone, hồi lưu, 10 h; (e) H2O, MeOH, KOH, 30oC, h; (f) Urea, 150-160 °C, h; (g) P2O5, xylene, hồi lưu, h; (h) HNO3, acid acetic băng, 0°C, h (i) DMF-DMA, acid acetic, toluene, hồi lưu, 4-6 h; (k) 3etynylaniline, acid acetic, toluene, 60oC-110oC, 4-6 h, 50-63% Sơ đồ 3.3: Tổng hợp hợp chất lai dẫn xuất quinazoline 119a-d với azide qua cầu nối triazole Thuốc thử điều kiện: equiv 4-anilinoquinazoline 119a-d, 1,1 azide equiv, 12 equiv DIPEA, 0,2 equiv CuI, THF, khuấy, 1-2 ngày, 70-90% 3.2 TỔNG HỢP ERLOTINIB HYDROCLORIDE Từ phương pháp tổng hợp erlotinib hydrochloride đề cập tài liệu tham khảo mô tả sơ đồ 1.15-1.23 kết nghiên cứu bước đầu nhóm tác giả, nhận thấy phương pháp có ưu nhược điểm định Hai khó khăn lớn phương pháp khử hóa nhóm nitro thành nhóm amin phản ứng tổng hợp chất trung gian 4-chloroquinazoline Để lựa chọn đường tổng hợp thuốc phù hợp với điều kiện Việt Nam, nghiên cứu kỹ ưu nhược điểm phương pháp kết hợp với nghiên cứu bước đầu, lựa chọn phương pháp phù hợp để nghiên cứu, cải tiến tổng hợp erlotinib hydrochloride sơ đồ 3.1 Sản phẩm 93 xác định cấu trúc phương pháp phổ đại 1H-NMR, 13C-NMR Erlotinib hydrocloride 93 chất rắn màu vàng có điểm chảy 228-229oC IR 3277, 3053, 3021, 2922, 2896, 2820, 2745, 2710, 1667, 1564, 1510, 1446, 1284, 1122, 8920 cm-1 1H-NMR (DMSO-d6) 11,45 (s, 1H, NH); 8,81 (s, 1H, H-Ar); 8,30 (s, 1H, H-Ar); 7,90-7,72 (m, 2H, HAr); 7,53-7,33 (m, 3H, HAr); 4,45-4,25 (m, 4H, CH2O); 3,79-3,70 (m, 4H, CH2O), 3,40 (s, 1H, C≡CH), 3,25 (s, 6H, OCH3) 13 C-NMR (DMSO-d6) 170,2; 159,1; 155,1; 151,2; 147,3; 142,3; 130,9; 125,8; 124,0; 122,3; 117,65; 114,2; 108,8; 100,9; 87,1; 80,6; 76,7; 73,5; 51,3 3.3 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA ERLOTINB- TRIAZOLE Việc tổng hợp hợp chất có cấu trúc lai hai nhiều chất có hoạt tính sinh học với vấn đề lý thú mẻ, nhiều nhà khoa học quan tâm Tổng hợp hợp chất lai từ hai hợp chất có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt chất hoạt động theo chế tác dụng khác làm tăng hoạt tính cải thiện nhược điểm hợp chất ban đầu Mặt khác, hợp chất có cấu trúc lai đưa vào thể thủy phân nhờ enzym thể tạo chất ban đầu, giảm hiệu ứng phụ tăng hiệu có thời gian bán hủy dài Để tìm kiếm mở rộng hoạt tính lý thú dẫn xuất erlotinib, nghiên cứu tổng hợp hợp chất lai erlotinib với azide qua cầu nối triazole phản ứng click Kết thu dẫn xuất 105a-d HN HN N H3C O O N N N O2 N O H3C H3C O H3C N O O O N N N N O NO2 N 105b 105a 1240C, 75% 1210C, 83% CN HN HN H3C H3C O O O O NO2 N N H3C N N H3C N O O O N N O CF N N N 105d 1400C, 90% 105c 1020C, 86% Hình 3.19: Cấu trúc hóa học số đặc trƣng vật lý hợp chất 105a-d Cấu trúc dự kiến hợp chất lai 105a-d khẳng định kiện phổ IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR chúng 6,7-Bis(2-methoxyethoxy)-N-(3-(1-(3-nitro-phenyl)-1H-1,2,3-triazol-4yl)phenyl) quinazoline-4-amine 109b HN H3C H3C O O O O N N N N NO N Chất rắn khơng màu Nhiệt nóng chảy 121oC Hiệu suất 83% IR (KBr) cm-1: 2930, 1623, 1583, 1535, 1507, 1442, 1350, 1238, 1034, 928 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ: 9.61 (1H, s, NH), 9.56 (1H, s), 8.81 (1H, t, J = Hz), 8.51-8.47 (2H, m), 8.40 (1H, s), 8.35-8.33 (1H, m), 7.95-7.92 (3H, m), 7.67 (1H, d, J = 5.5 Hz), 7.53 (1H, t, J = Hz), 7.23 (1H, s), 4.334.28 (4H, m, CH3OCH2CH2O), 3.81-3.75 (4H, m, CH3OCH2CH2O), 3.38 (3H, s, OCH3), 3.36 (3H, s, OCH3) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ: 156.4, 153.6, 152.9, 148.6, 148.1, 147.7, 140.2, 137.2, 131.6, 103.2, 129.2, 125.9, 123.1, 122.4, 120.6, 120.1, 119.1, 114.6, 108.2, 103.3, 70.1, 70.0, 68.4, 68.1, 58.4, 58.3 LC-MS/MS (m/z) Theo tính tốn: C28H28N7O6: 558.2023 [M+H]+, Tìm thấy: 558.2061 3.4 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI CỦA DẪN XUẤT QUINAZOLINE CHỨA NHĨM CROWN ETHER Ở VỊ TRÍ C-6, C-7 Những nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học (SAR) chất ức chế EGFR cho thấy khung 4anilinoquinazoline quan trọng hoạt động ức chế EGFR, nhóm vị trí C-6 C-7 chủ yếu đóng góp vào tính chất hóa lý chúng với khả tương thích tốt với nhánh cồng kềnh [15,16,104,105] Với lợi này, năm gần đây, nhiều dẫn xuất 4-anilinoquinazoline thiết kế tổng hợp liên tiếp Trong số đó, chất tương tự anilinoquinazoline kết hợp với chất ức chế men tyfin EGFR [17,106,107] SAR cho thấy dị vòng có chứa oxy có kích thước vòng cao 12 thành viên anilinoquinazoline hợp nhất, nhóm ưu tiên 4-anilino halogen clo, brơm, nhóm phenyl vị trí meta [17,107] Một số số chúng chứng minh hoạt động xét nghiệm phosphoryl hóa nội bào EGFR qua trung gian tế bào khối u người A431 [17] loại khác cho thấy có hoạt tính mạnh chống phân ly ức chế hai thụ 3.5 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI QUINAZOLINE-TRIAZOLE Sau có 4-anilinoquinazoline tiến hành tổng hợp hợp chất lai chúng với azide khác qua cầu nối triazole Kết thu loạt dẫn xuất lai với ba hợp phần Hợp phần 4anilinoquinazoline coi phần khung, vòng triazole hợp phần aryl gắn với nhóm thay đổi Hầu hết chất ức chế men EGFR-tyrosine kinase có 4-anilinoquinazoline, có nhóm chuỗi bên biến đổi Do đó, thay nhóm axetylen vị trí C-3 vòng phenyl phân tử quinazoline ban đầu hạt nhân triazole liên kết đơn làm cứng cấu trúc phân tử tạo thành Do làm tăng liên kết hydro vòng triazole xương sống peptide thụ thể EGFR từ cải thiện hoạt động ức chế hợp chất lai thu Bên cạnh đó, chúng tơi xem xét ảnh hưởng nhóm triazolyl đến chức hoạt hóa sinh học chất, đặc biệt hai nhóm nitro- trifluoromethylphenyltriazole Do đặc tính hóa học vật lý nitơ flo mà có mặt hai nhóm nguyên tử NO2 CF3 phân tử làm tăng hoạt tính dược học có lợi cho phân tử thu Do nhà hóa học hữu dược phẩm ngày quan tâm đến thiết kế tổng hợp khung chứa hai loại nhóm chức NO2 CF3 Với lí đó, chúng tơi tiếp tục sử dụng phản ứng click với xúc tác đồng (I) gắn kết alkyne trung gian quan trọng 119a-d với nitrophenyl- trifluoromethylphenylazide tạo hợp chất lai triazole thay 4anilinoquinazoline-mục tiêu 120-123a-d với hiệu suất 70-90% (sơ đồ 3.3) Cấu trúc hợp chất lai 120-123a-d xác định quang phổ 1HNMR, 13C-NMR MS (ESI) chúng Đáng ý, phổ 1H-NMR hợp chất lai cho thấy pic singlet 9,17-9,65 ppm tương ứng với 10 triazolyl proton, phổ 13C-NMR cho thấy đỉnh 120-123 ppm 147-149 ppm tương ứng với đặc tính CH Cq vòng triazole Phản ứng tổng hợp hợp chất lai theo sơ đồ 3.3 Kết thu dãy hợp chất lai hợp chất 119a-d 3.5.1 Tổng hợp hợp chất lai dẫn xuất 119a Các hợp chất lai dãy 120a-d tinh thể không màu có điểm chảy từ 186-267oC Hiệu suất tổng hợp 72%-90% 120a, 212oC, 87% 120b, 242-243oC, 87% 120c, 267oC 72% 120d, 186oC, 90% Hình 3.32: Cấu trúc hóa học đặc trƣng vật lí hợp chất lai 120a-d Cấu trúc hợp chất 120a chứng minh phổ IR, NMR N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)phenyl)quinazolin-4-amine (120a) 11 Chất rắn không màu Nhiệt độ nóng chảy 212oC Hiệu suất 87% IR (KBr) 3132, 2924, 2853, 1611, 1568, 1538, 1492, 1411, 1354, 1033, 924, 888, 773 cm-1 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.96 (1H, s, NH), 9.19 (1H, s), 8.65 (1H, s), 8.62 (1H, d, J = Hz), 8.50 (1H, t, J = 1.5 Hz), 8.26 (1H, d, J = 7.5 Hz), 8.03-7.95 (3H, m), 7.88 (2H, t, J = Hz), 7.82 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.68-7.65 (2H, m), 7.54 (1H, t, J = Hz) 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.9, 154.5, 149.7, 147.1, 144.1, 139.9, 134.5, 133.1, 131.3, 130.2, 129.3, 129.1, 127.8, 127.5, 126.4, 125.6, 123.0, 122.9, 122.5, 121.0, 119.3, 115.2 ESI-MS (m/z) Theo tính tốn: C22H16N7O2: 410.1287 [M+H]+; Tìm thấy: 410.3196 Cấu trúc chất 120b-d chứng minh tương tự hợp chất 120a phổ IR, NMR, MS 3.5.2 Tổng hợp hợp chất lai dẫn xuất 119b 121a 121b 121c 121d Cấu trúc hợp chất lai chất 119b Cấu trúc hợp chất lai 121d chứng minh phổ IR, NMR, HSQC, HMBC, DEPT, MS 12 5-(4-(3-([1,3]Dioxolo[4,5-g]quinazolin-8-ylamino)phenyl)-1H-1,2,3triazol-1-yl)-2-(trifluoro-methyl)benzonitrile (121d) Chất rắn màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy 256-257oC Hiệu suất 90% IR (KBr) 3282, 3132, 2238 (CN), 1615, 1580, 1529, 1493, 1470, 1439, 1386, 1315, 1271, 1242, 1217, 1183, 1135, 1030, 911, 845, 790, 688 cm-1 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.60 (1H, s, H-triazole), 9.53 (1H, s, NH), 8.59 (1H, s, H-19), 8.54 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-23), 8.49 (1H, s, H-2), 8.47 (2H, m, H-11, H-22), 8.14 (1H, s, H-5), 7.93 (1H, d, J = Hz, H-15), 7.63 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-13), 7.52 (1H, t, J = Hz, H-14), 7.19 (1H, s, H9), 6.25 (2H, s, OCH2) C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.9 (C-4), 13 153.0 (C-2), 152.4 (C-6), 148.6 (C-9a), 148.0 (C-16), 147.3 (C-8), 140.3 (C10), 139.7 (C-18), 137.5 (C-22), 132.7 (q, J = 32.5 Hz, C-21), 129.8 (C-12), 129.2 (C-14), 123.7 (C-23), 122.2 (C-15), 120.4 (C-13), 120.2 (C-17), 118.9 (C-11), 1181 (C-19), 115.0 (C≡N), 110.2 (C-4a), 107.7 (C-20), 104.6 (C-9), 102.3 (C-7), 98.9 (C-5) HRMS Theo tính tốn: C25H15F3N7O2: 502.1161 [M+H]+; Tìm thấy: 502.1233 Cấu trúc chất 121a-c chứng minh tương tự chất 121d phổ IR, NMR, MS 3.5.3 Tổng hợp hợp chất lai dẫn xuất 119c Kết tổng hợp hợp chất lai hợp chất 119c thu hợp chất lai 122a-d Cấu trúc hợp chất 122a chứng minh phổ IR, NMR, HSQC, HMBC, DEPT, MS 13 N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)phenyl)-7,8-dihydro [1,4] dioxino [2,3-g] quinazolin-4-amine (122a) Chất rắn màu vàng sáng Hiệu suất: 80% Nhiệt nóng chảy: 195oC IR (KBr) 3134, 1603, 1568, 1531, 1505, 1415, 1348, 1289, 1220, 1066, 901 cm-1 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.67 (1H, br.s, NH), 9.17 (1H, s), 8.49 (2H, s), 8.26 (1H, d, J = Hz), 8.14 (1H, s), 8.02-7.97 (2H, m), 7.95 (1H, d, J = Hz), 7.88 (1H, t, J = Hz), 7.63 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.51 (1H, t, J = Hz), 7.19 (1H, s), 4.42 (4H, d, J = 3.5 Hz, OCH2) 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.7, 152.9, 149.2, 147.1, 145.7, 144.1, 143.7, 140.2, 134.5, 131.3, 130.1, 129.2, 129.1, 127.5, 125.6, 122.8, 122.1, 120.6, 118.9, 112.3, 110.0, 108.5, 64.5, 64.2 HRMS (ESI+) m/z theo tính toán: C24H18N7O4 [M+H]+ 468.1342, thực tế: 468.1416 Cấu trúc hợp chất lại chứng minh phổ IR, NMR, MS 3.5.4 Tổng hợp hợp chất lai dẫn xuất 119d Cấu trúc hợp chất dãy 123a-c chứng minh phổ IR, NMR, MS N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)phenyl)-8,9-dihydro-7H[1,4] dioxepino[2,3-g]quinazolin-4-amine (123a) Chất rắn không màu Nhiệt độ nóng chảy 278oC Hiệu suất 79% 14 IR (KBr) 2926, 1609, 1574, 1537, 1479, 1415, 1350, 1330, 1064, 991 cm H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.81 (1H, s, NH), 9.17 (1H, s), -1 8.58 (1H, s), 8.48 (1H, s), 8.26 (1H, dd, J = Hz, J = Hz), 8.18 (1H, d, J = Hz), 8.02-7.97 (2H, m), 7.91 (1H, d, J = Hz), 7.89 (1H, td, J = 8.5 Hz, J = Hz), 7.65 (1H, d, J = Hz), 7.51 (1H, t, J = Hz), 7.26 (1H, d, J = Hz), 4.36-4.31 (4H, m, OCH2), 2.24 (2H, t, J = 5.5 Hz, OCH2CH2CH2O) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.7, 154.3, 153.0, 147.2, 144.2, 140.1, 134.7, 131.5, 130.2, 129.4, 129.2, 127.6, 125.7, 122.9, 122.6, 121.1, 121.0, 119.4, 117.5, 70.8, 70.7, 30.9 HRMS theo tính tốn: C25H20N7O4: 482.1499 [M+H]+; Tìm thấy: 482.1573 3.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT QUINAZOLINE, QUINAZOLINE-TRIAZOLE 3.6.1 Kết thử hoạt tính độc tế bào Q trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào thực phòng Hóa sinh ứng dụng viện Hóa học Các hợp chất sau tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư người, bao gồm KB (ung thư biểu mô, Hep-G2 (ung thư gan) Lu (ung thư phổi tế bào nhỏ) Chúng sử dụng Erlotinib, erlotinib hydrochloride (nguyên liệu bào chế thuốc chữa ung thư phổi tế bào nhỏ) ellipticine làm chất đối chứng dương tính Các kết thử hoạt tính trình bày Bảng 3.5 Như thể Bảng 3.5, nói chung, hợp chất tổng hợp thể tác dụng ức chế độc tế bào tốt hầu hết trường hợp có hoạt tính ức chế cao so với thuốc tham chiếu erlotinib erlotinib hydrochloride 15 Bảng 3.5: Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất tổng hợp đƣợc TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 R1,R2 R 2-NO2 H 3-NO2 4-NO2 3-CN-4-CF3 2-NO2 -OCH2O3-NO2 4-NO2 3-CN-4-CF3 2-NO2 -O(CH2)2O3-NO2 4-NO2 3-CN-4-CF3 2-NO2 -O(CH2)3O3-NO2 3-CN-4-CF3 Erlotinib Erlotinib.HCl Ellipticine Hợp chất IC50 (KB), µM IC50 (HepG2), µM IC50 (Lu), µM 119a 120a 120b 120c 120d 119b 121a 121b 121c 121d 119c 122a 122b 122c 122d 119d 123a 123b 123c 5.46 5.50 104.20 5.47 1.46 75.60 193.33 6.35 30.10 4.59 2.60 0.04 3.51 79.09 0.27 54.83 20.44 53.17 1.49 13.01 49.62 1.95 4.16 4.64 286.75 8.11 1.86 26.17 207.01 6.88 11.29 6.10 2.84 0.14 0.88 230.02 6.09 69.89 43.35 76.81 1.61 25.01 14.17 2.72 4.16 4.76 259.74 9.16 4.50 64.88 216.84 6.66 44.48 27.46 3.36 1.03 5.67 54.77 4.44 80.67 14.75 230.40 1.81 99.76 31.15 1.38 Sự thay dị vòng oxy khác vị trí khung quinazoline ảnh hưởng đến ức chế độc tế bào khác Kết hoạt tính cho thấy hợp chất 119a dẫn xuất dioxin 119c rõ ràng có hoạt tính độc tế bào mạnh dẫn xuất dioxolan dioxepine 119b, 119d Hiệu thay khơng thuận lợi kết cản trở vô trùng Đặc biệt nữa, hợp chất 119a 119c tìm 16 thấy chất ức chế độc tế bào chống lại ba dòng tế bào ung thư mạnh erlotinib erlotinib hydrochloride với IC50 có giá trị từ đến µM Bằng phản ứng click tạo cầu nối triazole liên kết hai hợp phần crown ether quinazoline 119 với azide tạo dãy hợp chất lai 120-123 có hoạt tính độc tế bào tăng lên đáng kể So sánh với dược điển thuốc tham chiếu có tác động độc tế bào với giá trị giá trị IC50 từ đến 100 µM hợp chất lai tổng hợp 120a, c, d, 121b, d, 122a, b , d 123c có tác động mạnh nhiều (với giá trị IC50 dao động từ 0.04 µM đến 25 µM) Kết cho thấy đường tổng hợp hợp chất đầy hứa hẹn hoạt động chống lại dòng tế bào ung thư Điều tra sơ mối quan hệ cấu trúc hoạt động (SAR) hợp chất lai tổng hợp 120-123 cho thấy chất vòng dị oxy nhóm aryl liên kết với vòng triazole ảnh hưởng đến hoạt tính độc tế bào đáng kể Ví dụ, kết cho thấy hoạt tính độc tế bào dioxan thay tương tự 122a-d mạnh so với dioxolane tương ứng, dioxepine, chất tương tự khơng có biến dị oxy (IC50: 122a> 120a> 123a> 121a, 122b> 121b> 123b> 120b, 122d> 123c ≈ 120d> 121d) Đặc biệt, hợp chất 122a cho thấy hoạt tính ức chế mạnh ba dòng tế bào KB, HepG2 Lu với giá trị IC50 tương ứng 0,04 µM, 0,14 µM 1,03 µM, tương ứng cao gấp 100 lần so với erlotinib Sự có mặt nhóm rút điện tử mạnh NO2, CF3 aryl liên kết với triazole cải thiện đáng kể hoạt động tế bào Kết cho thấy vào nhóm trifluoromethyl aryl dường tốt so với nhóm nitro (IC50: 120d> 120a> 120c> 120d, 121d> 121b> 121c> 121b, 123c> 123a> 123b) Ngồi ra, vị trí nhóm aryl dường ảnh hưởng đến hoạt tính độc tế bào chất Trên thực tế, với nhóm nitro, thay vị trí orto tốt vị trí meta para hầu hết trường hợp 17 3.6.2 Nghiên cứu docking hợp chất tổng hợp đƣợc thụ thể EGFR Các hợp chất thiết kế tổng hợp dựa khung cấu trúc hợp chất quinazoline tiêu biểu, đặc biệt erlotinib Trong số hợp chất tìm thấy hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c có hoạt tính gây độc tế bào tốt, đặc biệt hợp chất 122a cho thấy hoạt tính ức chế mạnh ba dòng tế bào KB, Hep-G2 Lu với giá trị IC50 tương ứng 0,04 µM, 0,14 µM 1,03 µM, tương ứng cao gấp 100 lần so với erlotinib Phương pháp mô protein docking sử dụng Protein docking kỹ thuật mơ hình hóa nhằm dự đốn vị trí cấu trúc thuận lợi mà phân tử chất gắn kết đích tác dụng nó, thường phân tử protein Do erlotinib có khả ức chế EGFR khơng hoạt hóa EGFR-TKD đột biến tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC) hướng đến nghiên cứu tương tác 120d, 122a, 122b, 123c với kiểu hình (phenotype) khác hệ EGFR Để chuẩn bị mơ hình protein, chúng tơi thu thập xử lý cấu trúc tinh thể tia X EGFR từ ngân hàng liệu Protein PDB (https://www.rcsb.org/): 1) EGFR hoạt hóa khơng đột biến mang mã 1M17 2ITX, 2) EGFR hoạt hóa mang đột biến L834R có mã 2ITV, 3) EGFR khơng hoạt hóa mang mã 4HJO 1XKK Các hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c xây dựng cấu trúc 3D sử dụng phần mềm LigPrep-Schrodinger (https://www.schrodinger.com/ligprep) Mô docking thực chương trình ICM-pro 3.8 (www.molsoft.com/icmpro) Kết docking cho thấy hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c có tương tác tốt với EGFR dạng hoạt hóa (đột biến hay khơng đột biến) khơng hoạt hóa hình 3.47 Do đặc tính thân dầu trung tâm hoạt động 18 đích, khung aminoquinazoline tạo mạng lưới dày đặc tương tác van der Waals với acid amin quan trọng Leu844, Val726, Ala743, Lys745 đột biến L858R Ngồi ra, nhóm triazole tương tác mạnh với acid amine thân dầu miệng túi Lys745 Nhìn chung hợp chất đầu cho thấy khả ức chế EGFR dạng hoạt hóa khơng hoạt hóa Tuy nhiên, khác với erlotinib, hợp chất thể hoạt tính yếu đích EGFR hoạt hóa(có khơng đột biến), hoạt tính đích EGFR khơng hoạt hóa mạnh Năng lượng liên kết tính cho Erlotinib ba hệ dao động từ -7,1 đến 9,9 kcal/mol Trong đó, hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c cho mức lượng tương tác với EGFR hoạt hóa cao erlotinib (từ -10,0 đến -10,6 kcal/mol) Năng lượng tính cho hệ EGFR khơng hoạt hóa cao (từ -10,6 đến -12,3 kcal/mol) Tóm lại, kết nghiên cứu mơ docking phân tử giúp dự đốn hoạt tính hướng đích hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c, góp phần giải thích chế gây độc tế bào hợp chất Kết hợp nghiên cứu lý thuyết thực nghiệm hợp chất 122a xem hit mới, làm định hướng cho tổng hợp hợp chất dẫn đường ức chế EGFR, hướng điều trị ung thư phổi tương lai 19 Compound 120d Compound 122a Compound 122b Compound 123c Hình 3.47: Sơ đồ 2D thể tƣơng tác docking hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c với vị trí hoạt động đích protein EGFR (Trong ngun tử phân loại theo mầu, số ô lượng liên kết (kcal/mol) hợp chất) 122a 120d IC50 (µM): 0.04 (KB); 0.14 IC50 (µM): 1.46 (KB); 1.86 (HepG2); 1.03 Lu (HepG2); 20 119c 122b IC50 (µM): 2.6 (KB); 2.84 (HepG2); IC50 (µM): 0.88 (HepG2); 123c IC50 (µM): 1.49 (KB); 1.61 (HepG2); 1.81( Lu) 122d IC50 (µM): 0.27 (KB); Hình 3.48: Cấu trúc số hợp chất lai có hoạt tính tốt 21 KẾT LUẬN Luận án tổng hợp thành cơng erlotinib hydrocloride theo quy trình cải tiến Đã tổng hợp 39 chất có 23 dẫn xuất quinazoline; 19 hợp chất lai chưa thấy công bố trước bao gồm: * hợp chất lai erlotinib –triazole * hợp chất lai N-(3-ethynylphenyl)quinazoline-4-amine (119a) azide qua cầu nối triazole * hợp chất lai N-(3-ethynylphenyl)-[1,3]dioxolo[4,5g]quinazoline-8-amine (119b) azide qua cầu nối triazole * hợp chất lai N-(3-ethynylphenyl)-7,8-dihydro[1,4]dioxino[2,3-g]quinazoline-4-amine (119c) azide qua cầu nối triazole * hợp chất lai N-(3-ethynylphenyl)-8,9-dihydro-7H[1,4]dioxepino [2,3-g]quinazoline-4-amine (119d) azide qua cầu nối triazole Đã chứng minh cấu trúc 19 hợp chất lai phương pháp phổ đại IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) Đã thử hoạt tính gây độc tế bào với 19 hợp chất tổng hợp ba dòng tế bào ung thư người KB, Hep-G2 Lu Kết cho thấy nhiều hợp chất lai có hoạt tính tốt, tốt nhiều so với erlotinib hợp chất 120a, 120d; 121b, 121d; 122a, 122b , 122d 123c Đặc biệt, hợp chất 122a cho thấy hoạt tính ức chế mạnh 22 ba dòng tế bào KB, Hep-G2 Lu với giá trị IC50 tương ứng 0,04 µM, 0,14 µM 1,03 µM, tương ứng cao gấp 100 lần so với erlotinib Sử dụng mơ protein docking để dự đốn hoạt tính hướng đích hợp chất 120d, 122a, 122b, 123c, góp phần giải thích chế gây độc tế bào hợp chất 23 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nghiên cứu quy trình cải tiến tổng hợp erlotinib Tạp chí Hóa học số 6e2, tập 54, tr (2016) Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất erlotinib N-(3-ethynylphenyl)-7,8dihydro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinazolin-4-amin Tạp chí Hóa học, số 5E34, tập 55, tr 13-16 (2017) Synthesis and cytotoxicity evaluation of novel substituted triazole– erlotinib hybrid compounds Vietnam iournnal of chemistry, volume 56, Number 4e1, (2018) Design, synthesis and evaluation of novel hybrids between 4anilinoquinazolines and substituted triazoles as potent cytotoxic agents Bioorganic & Meedicinal Chemistry Letters 28, 3741-3747.(2018) 24 ... tế bào Quá trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào thực phòng Hóa sinh ứng dụng viện Hóa học Các hợp chất sau tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư người, bao gồm... =1 tháng), giá bán thị trường Việt Nam khoảng 42 triệu đồng/lọ /30 viên loại 150mg Vì vậy, đề tài Nghiên cứu tổng hợp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất quinazolin hướng nghiên cứu có... thích chế gây độc tế bào hợp chất 23 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nghiên cứu quy trình cải tiến tổng hợp erlotinib Tạp chí Hóa học số 6e2, tập 54, tr (2016) Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất