Tóm tắt Luận án tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer-drugFe3O4-folate) lên tế bào ung thư

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Chế tạo được hệ nano đa chức năng gồm: vật liệu kích thước nano Fe3O4 (có tính chất từ) được bọc bởi polyme tương thích sinh học, gắn yếu tố hướng đích (folate), mang thuốc (drug) ((Curcumin, Doxorubicin) (tính chất quang)), phân tán tốt trong nước, có khả năng nhắm đích ung thư. Thử nghiệm và đánh giá được hiệu quả tác động của hệ hạt nano lên các dòng tế bào ung thư như HT29; HeLa; HepG2... và trên động vật thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… LÊ THỊ THU HƢƠNG Nghiên cứu chế tạo đánh giá hiệu tác động hệ nano đa chức (polymer-drug-Fe3O4-folate) lên tế bào ung thƣ Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2018 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1: TS Hà Phƣơng Thƣ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: GS.TSKH Nguyễn Xuân Phúc Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ngày nay, phát triển khoa học công nghệ đem lại nhiều tiến vƣợt bậc sinh y học nhƣng loài ngƣời phải đối diện với nhiều loại bệnh nan y, điển hình bệnh ung thƣ Hiện có nhiều thuốc điều trị ung thƣ thị trƣờng Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn loại thuốc điều trị ung thƣ tan nƣớc dễ bị đào thải, tính định hƣớng chọn lọc khơng cao dù hay nhiều ảnh hƣởng không tốt sức khỏe bệnh nhân có tác dụng phụ kèm theo nhƣ triệu chứng buồn nôn, tiêu chảy, gây thiếu máu, giảm miễn dịch thể Nguyên nhân phần lớn phƣơng thức điều trị không tác động cục lên khối u mà ảnh hƣởng đến phận lớn mô quan lành thể [1] Để khắc phục nhƣợc điểm phƣơng pháp nêu trên, nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano, sử dụng vật liệu với kích thƣớc nano mét làm phƣơng tiện dẫn loại thuốc đặc trị ung thƣ nhƣ Curcumin, Paclitaxel, Doxorubicin… đến khối u cách an toàn [2–4] Bên cạnh vật liệu nano từ đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ nhằm ứng dụng sàng lọc tế bào ung thƣ, chẩn đốn ung thƣ hình ảnh cộng hƣởng từ MRI, nhiệt trị cách làm tăng nhiệt độ vùng khối u đƣợc đặt từ trƣờng, đặc biệt dẫn truyền thuốc dƣới ảnh hƣởng nam châm [5, 6] Các hạt nano từ thuốc chống ung thƣ đƣợc bọc lớp vỏ polymer thiên nhiên polymer tổng hợp … đƣợc gắn thêm số yếu tố hƣớng đích Hệ nano đa chức nhƣ tăng hiệu tác động tế bào ung thƣ định, giải phần yêu cầu phƣơng pháp hóa trị phải có tính chọn lọc cao tế bào ung thƣ Lợi ích là: Sử dụng vật liệu cho phép giảm liều thuốc dùng, giúp ngƣời bệnh tránh đƣợc tác dụng phụ không mong muốn; tập trung thuốc vào vị trí khối u, tránh tác động đến tế bào lành [7, 8] Nhƣ vậy, sử dụng hạt nano lõi Fe3O4, lớp vỏ bọc polime nhƣ chitosan biến tính, dextran biến tính, alginate, copolime…, gắn thêm đuôi folate nhƣ phƣơng tiện chuyên chở thuốc Curcumin (Cur) Doxorubicin (Dox) đến đích khối u ung thƣ cách an toàn Trên giới, số nghiên cứu hệ nano đa chức dùng y sinh học, đặc biệt điều trị ung thƣ đƣợc công bố [9–11], nhiên, hƣớng nghiên cứu với nhiều triển vọng Ở Việt Nam, số nhóm nghiên cứu cơng bố cơng trình liên quan đến việc tổng hợp hạt nano từ ứng dụng xử lí môi trƣờng Các nghiên cứu định hƣớng sử dụng hạt nano từ y sinh chủ yếu khai thác khả nhiệt từ trị vật liệu [14–16] Tính chất quang khả hƣớng đích đƣợc nghiên cứu hạn chế Trên sở đó, chúng tơi thực luận án “Nghiên cứu chế tạo đánh giá hiệu tác động hệ nano đa chức (polymer-drugFe3O4-folate) lên tế bào ung thƣ” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Chế tạo đƣợc hệ nano đa chức gồm: vật liệu kích thƣớc nano Fe 3O4 (có tính chất từ) đƣợc bọc polyme tƣơng thích sinh học, gắn yếu tố hƣớng đích (folate), mang thuốc (drug) ((Curcumin, Doxorubicin) (tính chất quang)), phân tán tốt nƣớc, có khả nhắm đích ung thƣ - Thử nghiệm đánh giá đƣợc hiệu tác động hệ hạt nano lên dòng tế bào ung thƣ nhƣ HT29; HeLa; HepG2 động vật thực nghiệm Các nội dung nghiên cứu luận án - Tổng hợp vật liệu nano đa chức mang thuốc curcumin doxorubicin hạt nano Fe3O4 bọc polime thiên nhiên (Ocacboxylmetyl chitosan alginate) có gắn yếu tố hƣớng đích folate - Xác định đặc trƣng vật liệu chế tạo đƣợc phƣơng pháp hố lí đại: FTIR, UV-Vis, phổ huỳnh quang, XRD, VSM, TGA, SEM, TEM… - Xác định tác động hệ nano đa chức dòng tế bào ung thƣ: Hep-G2, HeLa, LU-1,… chuột nhắt trắng mang khối u CHƢƠNG TỔNG QUAN Trong chƣơng này, tổng quan vấn đề liên quan đến việc chế tạo hệ nano đa chức đánh giá hiệu tác động hệ lên tế bào ung thƣ Hệ đa chức chứa thành phần: nano Fe 3O4 đƣợc bọc polime, mang thuốc (drug) gắn folate Cụ thể: Tổng quan tính chất, phƣơng pháp tổng hợp ứng dụng hạt nano Fe 3O4 Đặc biệt rõ vấn đề cần giải để sử dụng đƣợc hạt nano Fe 3O4 lĩnh vực y sinh; Tính chất khả ứng dụng loại polime thiên nhiên thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ O-cacboxyl metyl chitosan, alginate, dextran; Đặc trƣng tính chất số nghiên cứu sử dụng dƣợc chất: curcumin Doxorubicin; Phƣơng pháp gắn folate lên hệ hạt nano hiệu hƣớng đích tác nhân CHƢƠNG ĐIỀU KIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1 Tổng hợp vật liệu Các hệ nano đa chức đƣợc tổng hợp theo sơ đồ hình 2.1 Trong đó, lõi hạt nano từ (Fe3O4) đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp đồng kết tủa ion Fe2+ Fe3+ (với tỉ lệ mol 1:2) điều kiện đồng kết tủa thơng thƣờng [41] đồng kết tủa có sử dụng kĩ thuật vi sóng thiết bị Sineo-Uwave 1000 Hạt nano Fe3O4 sau đƣợc bọc OCMCS (1 mg/ml) alginate với nồng độ khác Trong bƣớc tiếp theo, Curcumin Doxorubicin đƣợc mang lên hệ nhờ tƣơng tác hấp phụ với lõi từ phản ứng với lớp vỏ polime Cuối hệ mang thuốc đƣợc tối ƣu hóa đƣợc lựa chon để gắn thêm yếu tố hƣớng đích folate chấm lƣợng tử CdTe Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp hệ dẫn thuốc đa chức 2.2 Các phƣơng pháp đặc trƣng tính chất hệ Tính chất hệ đƣợc xác định phƣơng pháp đại: Nhiễu xạ tia X, phổ hồng ngoại, phổ UV-Vis, phổ huỳnh quang, phân tích nhiệt, hiển vi điện tử quét, hiển vi điện tử truyền qua Hiệu suất, dung lƣợng mang thuốc khả giải phóng thuốc đƣợc xác định phƣơng pháp phổ UV-Vis Độc tính tế bào mẫu đƣợc xác định theo phƣơng pháp Skehan Likhiwitayawuid [171, 172] Phƣơng pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đƣợc sử dụng để định lƣợng Fe có mô chuột Đánh giá tác động hệ đa chức chuột: Chuột mang u kích thƣớc 7-10 mm đƣợc chia thành nhóm, nhóm con, gồm có: nhóm chứng (chuột có u khơng điều trị) nhóm đƣợc điều trị lần lƣợt FA, FAD, FADF Trong chu kì điều trị, thuốc đƣợc tiêm trực tiếp vào khối u với liều 50 l/con 40 phút sau tiêm, chuột đƣợc cố định ống nhựa đƣa vào cuộn dây hệ đốt từ RDOHFI với tần số 178 kHz, cƣờng độ từ trƣờng 90 Oe, thời gian đốt 30 phút/con Hai chu kì liền cách ngày Ghi nhận thay đổi kích thƣớc khối u Qua đánh giá tác dụng điều trị hạt nano từ mang Doxorubicin mơ hình chuột mang khối ung thƣ phổi Phương pháp xử lí số liệu: Excel 2010, OriginPro SPSS 22.0 CHƢƠNG HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG OCMCS MANG CURCUMIN 3.1 Tổng hợp hạt nano Fe3O4 Hạt Fe3O4 đƣợc tổng hợp thành công theo phƣơng pháp đồng kết tủa (liên kết Fe-O đặc trƣng đỉnh hấp thụ 575 cm-1 phổ hồng ngoại), cấu trúc spinel đảo (phổ XRD), từ độ bão hoà 70,5 emu/g, có tính chất siêu thuận từ với giá trị Mr Hc  có kích thƣớc trung bình khoảng 15 nm 3.1.2 Hạt nano Fe3O4 tổng hợp kĩ thuật vi sóng 3.1.2.1 Tính chất từ Từ trễ Mr lực kháng từ Hc mẫu chế tạo đƣợc  chứng tỏ vật liệu có tính chất siêu thuận từ (bảng 3.1) Vi sóng khơng làm thay đổi tính chất vật liệu Từ độ bão hoà mẫu M5 cao so với mẫu lại, đạt 69 emu/g Giá trị không khác biệt nhiều so với mẫu Fe3O4 đồng kết tủa điều kiện thông thƣờng (70,5 emu/g) Bảng 3.1: Các thông số từ mẫu Fe3O4 tổng hợp kĩ thuật vi sóng Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 Ms 53,9 56,2 56,7 63,0 69,0 64,6 59,6 60,6 60,7 62,7 64,5 (emu/g) Hc 2,5 14 4 2,5 0 20 0 18 2 2 21 (Oe) Mr 0,5 1,0 0,2 0,4 0 1,7 0 2 0,1 0,2 1,9 (emu/g) Nhƣ vậy, M5 mẫu tốt mặt từ tính 3.1.2.2 Phổ nhiễu xạ tia X Giản đồ XRD mẫu M5 xuất đầy đủ pic đặc trƣng Fe 3O4 khơng có pic khác chứng tỏ mẫu M5 hình thành cấu trúc spinel đơn pha Kết khẳng định M5 mẫu tốt cấu trúc pha tinh thể 3.1.2.3 Phổ hồng ngoại Trên hình 3.4 thấy mẫu Fe3O4 xuất pic đặc trƣng cho liên kết Fe-O vị trí khoảng 570 cm-1 Tuy nhiên số mẫu xuất thêm pic cƣờng độ thấp khoảng 630 cm-1 tƣơng ứng với có mặt thành phần Fe2O3 mẫu [174] Phổ đồ cho thấy M5 mẫu có độ tinh khiết cao với pic đặc trƣng cƣờng độ pic lớn Nhƣ vậy, qua khảo sát từ độ, cấu trúc tinh thể phổ hồng ngoại, lựa chọn mẫu M5 để thực nghiên cứu 3.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng curcumin lên tính chất hệ mang curcumin (FOC1-FOC5) Lƣợng curcumin đƣợc thay đổi từ 20 - 100 mg khảo sát tính chất từ nhƣ độ bền hệ thông qua đo giá trị Zeta hệ Kết đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết khảo sát hàm lượng curcumin Mẫu FOC1 FOC2 FOC3 FOC4 FOC5 Khối lƣợng curcumin (mg) 20 40 60 80 100 Từ độ bão hoà (Ms, emu/g) 54,9 52,9 49,0 35,3 25,8 Thế Zeta (mV) 40,2 32,6 30,4 18,2 8,1 Kết đo từ độ bão hoà mẫu FOC1-5 cho thấy lƣợng curcumin tăng dần từ 20 đến 100 mg, từ độ bão hoà mẫu giảm dần, đặc biệt mẫu FOC4 FOC5 Thế Zeta mẫu FOC1-5 có giá trị dƣơng hạt từ đƣợc bọc lớp polime O-cacboxylmetyl chitosan với nhiều nhóm chức NH2 bề mặt Xu hƣớng biến đổi trị số Zeta mẫu tƣơng tự nhƣ biến đổi từ độ bão hoà Các mẫu FOC1-3 lớn 30 mV chứng tỏ mẫu trì đƣợc trạng thái ổn định [170] Trong đó, mẫu FOC4 FOC5 Zeta thấp hẳn (dƣới 20 mV) Do đó, để đảm bảo hệ đa chức mang đƣợc nhiều thuốc giữ đƣợc tính chất từ độ bền tốt, sử dụng khối lƣợng curcumin chế tạo 60 mg Khối lƣợng đƣợc dùng để chế tạo hệ Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol Hàm lƣợng curcumin thực tế vào hệ đƣợc định lƣợng theo phƣơng pháp phân tích nhiệt (mục 3.3.4) 3.3 Hệ nano mang curcumin FOC mang curcumin gắn folate FOCF 3.3.1 Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại FOC FOCF đƣợc so sánh với phổ hồng ngoại thành phần: Fe3O4, OCMCS, Curcumin axit folic Sự chuyển dịch pic đặc trƣng chứng tỏ hệ đƣợc tổng hợp thành công 3.3.2 Phổ huỳnh quang Curcumin hợp chất có khả phát huỳnh quang Sau nhận kích thích xạ có bƣớc sóng 442nm, dung dịch FOC phát xạ phổ huỳnh quang với bƣớc sóng cực đại 515 nm So với phổ huỳnh quang curcumin dung mơi Hình 3.11: Phổ huỳnh quang FOC curcumin etanol/nƣớc (tỉ lệ 1:1) với cực đại 542 nm, phổ FOC có chuyển dịch xanh (chuyển dịch 27nm phía bƣớc sóng ngắn) giải thích có tƣơng tác phân tử curcumin với Fe3O4/OCMCS Về cƣờng độ, dung dịch FOC phát huỳnh quang yếu hẳn so với curcumin tự Nguyên nhân có mặt Fe3O4 mẫu làm giảm khả phát huỳnh quang curcumin [132] 3.3.3 Ảnh hiển vi điện tử quét (FeSEM) Hình thái học bề mặt hệ FOC FOCF đƣợc xác định ảnh SEM cho thấy kích thƣớc hạt vào khoảng 30 nm, lớn kích thƣớc hạt Fe3O4 ban đầu (khoảng 20 nm) chứng tỏ curcumin axit folic hấp phụ lên bề mặt hạt nano Fe3O4 3.3.4 Phân tích nhiệt Trên đƣờng TGA FOC FOCF xuất tƣơng ứng khoảng khối lƣợng tăng nhiệt độ Giai đoạn khối lƣợng dải nhiệt độ từ 360 đến 430oC xuất giản đồ phân tích nhiệt mẫu tƣơng ứng với phân hủy OCMCS curcumin, đó, giai đoạn khối lƣợng thứ hai 299oC mẫu FOCF axit folic bị chuyển hóa Từ thơng số giản đồ phân tính nhiệt xác định đƣợc hàm lƣợng curcumin Fe3O4 FOC 45% 48%, hàm lƣợng axit folic, curcumin Fe3O4 mẫu FOCF lần lƣợt 26%, 25% 46% Nhƣ vậy, dung lƣợng hấp phụ curcumin tƣơng ứng 0,95 mg 0,54 mg/mg Fe3O4 mẫu FOC, FOCF Dung lƣợng hấp phụ curcumin FOCF giảm so với FOC Mặc dù vậy, FOCF mang đƣợc lƣợng curcumin nhiều so với nghiên cứu khác [134, 176, 177] Hình 3.14 mơ tả cấu trúc FOC FOCF, curcumin đƣợc hấp phụ bề mặt hạt Fe3O4 Hình 3.1: Mơ hình cấu trúc hệ FOC FOCF 3.3.5 Giản đồ nhiễu xạ tia X tính chất từ 80 (a)Fe3O4 (440) (b) Fe3O4/OCMCS/Cur (c) Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol (511) (400) (422) (200) (a) 60 40 Ms (emu/g) (311) (c) (b) 20 1.5 (b) 1.0 (c) 0.5 0.0 -25 -20 -15 -10 -5 0 -20 (c) Fe3O4/OCMCS/Cur/folic (b) Fe3O4/OCMCS/Cur -40 (a) (a) Fe3O4 -60 30 40 50 o 2theta ( ) 60 70 Hình 3.15: Giản đồ nhiễu xạ tia X (a) Fe3O4, (b) FOC (c) Fe3O4/OCMCS/Cur/Fol -80 -15000 -10000 -5000 5000 10000 15000 H (Oe) Hình 3.16: Đƣờng cong từ trễ (a) Fe3O4,(b) FOC (c) FOC /Fol nhiệt độ phòng Giản đồ nhiễu xạ tia X FOC FOCF (hình 3.15) xuất pic tƣơng ứng với mặt phẳng mạng đặc trƣng Fe3O4 (200), (311), (400), (422), (511) (440), chứng tỏ cấu trúc spinel Fe3O4 khơng thay đổi q trình dẫn thuốc Các phép đo từ chứng minh hệ nano mang thuốc giữ nguyên đƣợc cấu trúc tinh thể (hình 3.10) Từ độ bão hòa FOC FOCF NPs vào khoảng 50 emu/g, thấp 20 emu/g so với Fe3O4 tự do hấp phụ curcumin axit folic lên bề mặt Fe3O4 Ngoài ra, giá trị từ dƣ Mr lực kháng từ Hc hệ gần chứng minh tính chất siêu thuận từ hạt Fe3O4 kích thƣớc dƣới 30 nm [169] 3.3.6 Kết đốt nóng cảm ứng từ Kết đốt nóng cảm ứng đƣợc trình bày bảng 3.4 Khi nồng độ oxit sắt từ giảm, nhiệt độ bão hòa Ts tốc độ tăng nhiệt ban đầu dT/dt (xác định t=0) giảm Nồng độ hạt từ từ 0,3 mg/ml trở lên cho nhiệt độ bão hòa lên tới 42oC cao sau 10 phút Bảng 3.4: Thông số đốt nóng cảm ứng mẫu mang curcumin Nồng độ (mg/ml) 0,1 FOC Ts (1500 s) 45,5 dT/dt 0,02 FOCF Ts (1500 s) 38,6 dT/dt 0,01 0,3 50,0 0,03 44,2 0,02 0,5 54,6 0,04 54,7 0,03 0,7 58,6 0,06 58,9 0,04 64,3 0,09 67,5 0,06 Thời gian lƣu 10 phút kéo dài thiết lập đƣợc trì điều kiện từ trƣờng đốt Vì tế bào ung thƣ trải qua q trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) khoảng nhiệt độ từ 42–46◦C [73], hệ FOCF hồn tồn ứng dụng điều trị ung thƣ phƣơng pháp nhiệt trị 3.3.9 Độc tính tế bào Các ảnh chụp huỳnh quang cho thấy xâm nhập curcumin vào bên tế bào HT29 (tín hiệu màu xanh) ủ với FOC (hình 3.21) Ngun nhân tín hiệu màu xanh lục curcumin có khả tự phát huỳnh quang kích thích laze Agon Ở mẫu đối chứng khơng xuất tín hiệu Kết đồng thời chứng tỏ kết hợp curcumin lên hệ mang nano không ảnh hƣởng tới khả nhập bào curcumin, hệ nano đảm bảo đƣa đƣợc curcumin vào tế bào 4.1.2 Dung lượng thuốc (LC) hiệu suất mang thuốc (EE) Dung lƣợng mang thuốc mẫu đƣợc trình bày bảng 4.1 Các kiện cho thấy nồng độ alginate yếu tố quan trọng tác động tới hiệu suất mang Dox Nồng độ alginate cao, khả mang Dox lớn Hiện tƣợng đƣợc giải thích hình thành liên kết Dox alginate bề mặt hạt nano Fe3O4 Tuy vậy, hàm lƣợng alginate tăng từ FA2D đến FA10D, khối lƣợng hệ tăng nên dung lƣợng thuốc không tăng cách liên tục Dung lƣợng thuốc hệ đạt giá trị cực đại mẫu FA4D, lựa chọn mẫu cho thử nghiệm sinh học Bảng 4.1: Giá trị EE LC Mẫu EE (%) FA2D 61,2±0,5 FA4D 78,5±0,3 FA6D 85,0±0,9 FA8D 87,2±0,8 FA10D 90,8±0,7 LC (%) 17,9±0,2 19,0±0,1 17,5±0,2 15,6±0,1 14,4±0,1 4.1.3 Phân bố kích thước ảnh TEM hệ Dải phân bố kích thƣớc hạt hệ nano xác định phổ DLS phụ thuộc nhiều vào nồng độ alginate Trƣớc mang thuốc Dox, hạt Fe3O4 bọc alginate FA4 FA8 có kích thƣớc thuỷ động 18 nm 91 nm Nồng độ cao alginate mẫu FA8 tạo lớp vỏ bọc dày mở rộng kích thƣớc thuỷ động hạt tính ƣa nƣớc alginate Mang Dox hệ mẫu FA4D FA8D làm tăng rõ rệt kích thƣớc hạt dung dịch (tƣơng ứng 255 480 nm), đồng thời dải phân bố kích thƣớc trở nên rộng so với FA4 FA8 Tƣơng ứng với lƣợng thuốc Dox, FA8D chứa nhiều Dox FA4D nên tăng kích thƣớc nhiều so với FA4D Hệ FA4D có kích thƣớc thích hợp so với FA8D cho ứng dụng y sinh Ảnh TEM cho thấy kích thƣớc hạt thay đổi từ đến 13 nm, kích thƣớc trung bình vào khoảng 9,3 nm tƣơng ứng với kích thƣớc tính đƣợc từ phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (Hình 4.5) theo phƣơng trình Scherrer (D=K/(cos)8 nm [161] 4.1.4 Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) tính chất từ 11 Lin (cps) (400) (440) (422) -10000 -1 -5000 40 20 H (Oe) 5000 10000 -1 (511) 60 Ms (emu g ) (220) FA2 FA4 FA6 FA8 FA10 FA4D FA8D Fe3O4 FA4D Ms (emu g ) (311) -20 -40 30 40 50 o 2theta ( ) 60 70 -60 H (Oe) Hình 4.5: Giản đồ XRD FA4D -40 -20 Hình 4.6: Tính chất từ hệ hạt Các pic đặc trƣng tinh thể Fe3O4 mẫu FA4D xuất đầy đủ giản đồ XRD FA4D (hình 4.5) Các pic có cƣờng độ tƣơng đối thấp so với Fe3O4 tự do có mặt thành phần hữu (alginate Dox) hệ Bảng 4.2: Các thông số từ mẫu bọc alginate Mẫu FA2 Ms 61,2 (emu/g) Hc (Oe) 18 Mr 1,5 (emu/g) FA4 FA6 FA8 FA10 FA4D FA8D 69,5 65,3 65,8 63,9 51,6 33,9 Fe3O4 Fe3O4 [176] [177] 43 25 14 1,4 50 4,1 52 3,2 45 2 12 1,0 13 1,1 17 1,6 108 Trên hình 4.6 nhận thấy từ dƣ hệ số kháng từ mẫu xấp xỉ 0, chứng minh hệ hạt siêu thuận từ Thêm vào đó, giá trị Hc Mr FA4D FA8D lớn nhiều so với mẫu khơng mang thuốc Điều Dox làm thay đổi tính chất dị hƣớng từ vật liệu [186] Từ độ giảm tăng nồng độ alginate (từ FA4 đến FA10) Giá trị từ độ mẫu FA4 cao dãy mẫu Nguyên nhân tƣợng hàm lƣợng alginate, chất phi từ, tăng dần mẫu Riêng FA2, từ độ bão hoà thấp dãy mẫu đƣợc giải thích nồng độ alginate nhỏ, polime không đủ bao phủ bề mặt hạt từ, chúng bị oxi hố phần khơng khí q trình sấy mẫu, trở thành Fe 2O3 có từ độ thấp [164] Từ độ bão hoà FA4D FA8D, mẫu mang Dox giảm mạnh so với mẫu không mang thuốc (tƣơng ứng 51,6 33,9 emu/g) chứng tỏ Dox đƣợc mang lên hệ với lƣợng đáng kể Sự giảm sâu từ độ mẫu 12 FA8D so với FA4D kết việc mang lƣợng Dox lớn hệ Tuy giảm, giá trị từ độ bão hoà FA4D FA8D đủ lớn để tách khỏi hệ phản ứng dễ dàng, nhanh chóng từ trƣờng ngồi 4.1.5 Kết đốt nóng cảm ứng từ Kết đốt nóng cảm ứng từ mẫu FA4 FA4D với nồng độ khác (từ 0,5 đến 3,0 mg/ml), mẫu Fe3O4 tự do, FA4, FA8, FA4D nồng độ 3,0 mg/ml xác định điều kiện từ trƣờng tần số 178 kHz cƣờng độ 80 Oe đƣợc trình bày hình 4.7 bảng 4.3 Các đặc trƣng đốt nóng cảm ứng từ hình 4.7a 4.7b cho thấy giá trị nhiệt độ bão hoà Ts (xác định thời gian đốt 1500 s) phụ thuộc vào nồng độ Khi nồng độ hạt từ giảm (bằng cách pha loãng với nƣớc), nhiệt độ bão hoà Ts tốc độ tăng nhiệt ban đầu dT/dt giảm Tất mẫu đạt nhiệt độ 42°C cao 20 phút Hệ có khả trì đƣợc khoảng nhiệt độ tiếp tục chiếu từ Do tế bào ung thƣ bị tiêu diệt vùng nhiệt độ 42–46oC [73], hệ nano từ chế tạo (cả hệ không mang thuốc FA4 hệ mang thuốc FA4D) có khả làm hạt nhân tạo nhiệt tốt cho ứng dụng nhiệt trị Mặc dù từ độ bão hồ có chênh lệch lớn (hình 4.6), nhƣng khả đốt nóng mẫu khơng khác nhiều Do đó, FA4D trở thành tác nhân điều trị ung thƣ kết hợp: vừa có khả hố trị liệu, vừa có khả nhiệt trị Bảng 4.3: Số liệu đốt nóng cảm ứng từ mẫu FA4, FA4D, FA8 Fe3O4 Mẫu FA4 FA4D Nồng độ (mg/ml) T1500s (oC) dT/dt SAR (W/g) 0,5 49,7 0,03 225,7 52,1 0,03 129,6 62,1 0,04 85,7 68,4 0,06 85,0 0,5 48,1 0,02 150,5 ILP (nHm2.kg-1) 11,6 13 50,5 0,03 112,9 59,2 0,04 73,2 65,1 0,05 66,9 9,2 FA8 62,1 0,05 64,1 8,8 Fe3O4 60,1 0,07 103,1 14,1 Công suất toả nhiệt (SAR) FA4 FA4D giảm theo nồng độ chất lỏng từ Hiện tƣợng đƣợc giải thích nồng độ tăng, khoảng cách hạt từ giảm, tạo tƣơng tác lƣỡng cực từ mạnh chúng Ở nồng độ thấp, hạt đủ xa để sinh nhiệt hiệu môi trƣờng Hiện tƣợng tƣơng tự quan sát đƣợc hạt nano Fe3O4 bọc PAA [189] nano ferrit tổ hợp [15] 4.1.6 Phân tích nhiệt Cả mẫu khối lƣợng khoảng nhiệt độ từ 80-550oC Giai đoạn khối lƣợng thứ hai mẫu khác nhau, FA4 xuất pic toả nhiệt nhƣng 12% khối lƣợng suốt q trình đốt nóng Sự khối lƣợng trình phân huỷ alginate mẫu, Ngƣợc lại, FA4D có pic 24% khối lƣợng (gấp đôi so với FA4) 380 oC Sự khối lƣợng thành phần hữu hệ bị phân huỷ Pic lƣợng chứng minh tạo phức Dox với lớp vỏ alginate hệ 14 12 10 -5 -15 -20 -5 -10 -15 -20 -25 100 200 300 400 500 600 700 800 o Nhiet ( C) -30 b) 20 18 16 14 12 10 100 200 300 400 500 600 700 800 TG dong nhiet Dong nhiet (V) -10 a) 16 Dong nhiet (V) TG (/%) TG dong nhiet TG (/%) 10 o Nhiet ( C) Hình 4.9: Giản đồ phân tích nhiệt FA4 (a) FA4D(b) Hình 4.10 mơ tả cấu trúc chung hạt nano Fe3O4 bọc alginate mang doxorubicin (FA4D FAD) hạt tƣơng ứng gắn thêm folate (FADF) Trong đó, Dox đƣợc mang lớp vỏ alginate nhờ tƣơng tác hóa học 14 Hình 4.1: Sơ đồ cấu trúc FAD FADF 4.1.7 Q trình giải phóng thuốc in vitro Trong 12 h đầu tiên, tốc độ nhả thuốc lớn (đƣờng biểu diễn có độ dốc lớn) lƣợng thuốc tách đạt 21,0% 29,5 % sau 12 h pH=7,4 pH=5 tƣơng ứng Nói chung, lƣợng Dox tách mơi trƣờng trung tính so với môi trƣờng axit Sau 120 h, khoảng 61% tổng lƣợng Dox FA4D tách khỏi hệ pH=5 42% pH=7,4 Q trình giải phóng Dox khỏi hệ nano đƣợc thực thuỷ phân phức chất tạo thành Dox alginate phân huỷ lớp vỏ alginate trình thuỷ phân Cả trình thuỷ phân đƣợc tăng tốc môi trƣờng axit Do môi trƣờng khối u ung thƣ môi trƣờng axit, tƣợng cho thấy hệ dẫn thuốc nano FA4D phù hợp để điều trị ung thƣ 70 % Dox giai phong 60 50 40 30 pH=7.4 pH=5 20 10 0 20 40 60 80 Thoi gian (h) 100 120 Hình 4.11: Quá trình nhả thuốc FA4D pH 7,4 pH 4.1.8 Độc tính tế bào Doxorubicin hợp chất có độc tính cao với tế bào thƣờng [140] có giá trị IC50 thấp với số dòng tế bào ung thƣ (thấp g/ml) [147] Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng dịng tế bào Hep-G2, LU-1, RD, FL Vero (hình 4.12) Kết nghiên cứu cho thấy hệ nano mang 15 Dox có độc tính cao dịng tế bào (giá trị IC50 từ 0,60 đến 1,41g/ml) Các giá trị cao so với Dox tự Điều đƣợc lí giải q trình nhả chậm Dox từ hệ nano [147] Bên cạnh đó, giá trị IC50 dòng tế bào ung thƣ Hep-G2, LU-1, RD FL thấp so với dòng tế bào thƣờng (Vero) chứng tỏ hệ nano biểu độc tính tế bào ung thƣ cao so với tế bào lành Do đó, hệ dẫn thuốc cho phép hố trị liệu an tồn cho điều trị ung thƣ giảm đƣợc độc tính với tế bào thƣờng 1.4 60 40 20 a) 0.8 0.72 25 b) 0.60 0.6 0.39 0.4 0.0 01 05 Nong (g/ml) 1.20 1.41 1.30 0.96 1.0 0.2 0.2 FA4D DOX 1.2 Hep-G2 LU-1 RD FL Vero 80 IC50 (g/ml) Ti le te bao song (%) 100 0.21 Hep-G2 LU-1 0.11 RD 0.16 FL Vero Dong te bao Hình 4.12: Đƣờng cong đáp ứng liều tƣơng quan giá trị IC50 hệ FA4D 4.2 Ảnh hƣởng lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng tới tính chất hệ nano Kĩ thuật vi sóng đƣợc sử dụng để tổng hợp nano Fe3O4 với nhiều ƣu điểm, đáng kể kĩ thuật cho phép rút ngắn thời gian phản ứng tổng hợp đƣợc lƣợng lớn Trong phần này, khảo sát điều kiện tổng hợp nano Fe3O4 với kĩ thuật vi sóng so sánh hiệu diệt tế bào hệ đa chức với lõi hạt Fe3O4 tổng hợp vi sóng với hạt Fe3O4 đồng kết tủa đơn Để đánh giá khả đốt nóng cảm ứng tƣơng tác với hệ sinh học vật liệu, tiến hành tạo mẫu FA FAD với thành phần phƣơng pháp nhƣ FA4 FA4D từ hạt Fe3O4 M5 chế tạo kĩ thuật vi sóng 4.2.1 Một số đặc trưng vật liệu kết đốt nóng cảm ứng Các mẫu FA FAD có độ bền cao, thể giá trị Zeta âm lớn Đƣờng cong đốt nhiệt thể xu hƣớng tƣơng tự so với mẫu tổng hợp điều kiện đồng kết tủa thơng thƣờng So sánh nhiệt độ bão hồ (xác định thời điểm 1500 s) FA FAD (bảng 4.6) với kết tƣơng ứng FA4 FA4D (bảng 4.3) nhận thấy khơng có khác biệt đáng kể hiệu ứng đốt nóng mẫu tổng hợp nhờ vi sóng so với điều kiện tổng hợp thơng thƣờng 16 4.2.2 Độc tính tế bào Kết so sánh giá trị IC50 mẫu chế tạo vi sóng chế tạo đồng kết tủa thơng thƣờng đƣợc trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7: IC50 hệ mẫu vi sóng so với mẫu đồng kết tủa thơng thường Dịng tế HepLU-1 RD FL Vero HeLa bào G2 Dox 0,11 0,16 0,21 0,39 1,30 Dox 0,25 0,18 0,35 1,34 FA4D 0,60 1,20 0,72 0,96 1,41 FAD 0,81 0,67 1,02 1,43 FADF 0,44 0,87 1,39 0,68 Mẫu đối chứng thí nghiệm xác định IC50 FA4D Mẫu đối chứng thí nghiệm xác định IC50 FAD FADF Kết bảng 4.7 cho thấy mẫu FAD gây tác động lên dịng tế bào Hep-G2, LU-1 Vero khơng khác biệt đáng kể so với mẫu FA4D Điều cho thấy việc sử dụng kĩ thuật vi sóng để chế tạo Fe 3O4 không đáp ứng mặt vật liệu mà đảm bảo mặt tƣơng tác với hệ sinh học Sự bảo tồn tính chất vật liệu tƣơng tác sinh học hệ FAD so với FA4D chất phƣơng pháp kĩ thuật vi sóng chúng tơi sử dụng phƣơng pháp đồng kết tủa Ƣu điểm kĩ thuật thao tác đơn giản, thời gian phản ứng đƣợc rút ngắn Đặc biệt, kĩ thuật cho phép tổng hợp đƣợc lƣợng lớn hạt nano Fe3O4 Do đó, nghiên cứu để tổng hợp hệ mang Dox gắn folat quantum dots mẫu thực thử nghiệm điều trị in vivo, sử dụng hạt Fe3O4 điều chế kĩ thuật vi sóng 4.3 Hệ nano mang Dox gắn folate (FADF) CdTe (FADQ) 4.3.1 Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại chứng minh tồn axit folic hệ FADF 4.3.2 Phổ huỳnh quang Phổ huỳnh quang FADF so với axit folic có chuyển dịch rõ ràng đỉnh phát xạ (từ 420 nm thành 428 nm) Đỉnh phổ 428 nm cách xa nhiều so với đỉnh phổ Dox chứng tỏ thành phần huỳnh quang, axit folic chiếm ƣu mẫu FADF Kết lần khẳng định có mặt axit folic hệ Mặt khác, phổ huỳnh quang mẫu FAD có cƣờng độ thấp nhiều so với Dox, huỳnh quang 17 Dox bị dập tắt hồn tồn mẫu FADF (khơng có đỉnh phổ vùng 612 nm) Trong trƣờng hợp FADF, cƣờng độ huỳnh quang mẫu giảm so với axit folic cho phép dùng FADF làm đầu dò huỳnh quang để quan sát tƣơng tác hệ nano với hệ sinh học 50000 cuong 420 428 30000 S1 (Counts) 40000 folic FADF FAD DOX 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 20000 450 20000 10000 10000 400 450 500 550 600 buoc song (nm) a) 650 700 580 nm FAQ 0.05 mg Fe3O4/ml FAQ 0.1 mg Fe3O4/ml FAQ 0.2 mg Fe3O4/ml FAQ 0.4 mg Fe3O4/ml FAQ 0.8 mg Fe3O4/ml 450 b) 500 550 FAQD 0.05 mg Fe3O4/ml FAQD 0.1 mg Fe3O4/ml FAQD 0.2 mg Fe3O4/ml FAQD 0.4 mg Fe3O4/ml FAQD 0.8 mg Fe3O4/ml 500 550 600 650 700 612 nm 600 Wavelength (nm) 650 700 Hình 4.17: Phổ huỳnh quang FAD, FADF so với axit folic Dox (a) mẫu chứa chấm lƣợng tử CdTe (b) Các mẫu FAQ FADQ chứa CdTe có pic huỳnh quang vị trí 580 nm đặc trƣng CdTe Ngoài ra, mẫu FADQ mang Dox cho huỳnh quang vị trí 612 nm, tƣơng tự nhƣ FAD 4.3.6 Q trình giải phóng Dox thụ động chủ động nhờ hiệu ứng đốt nóng cảm ứng Mơ hình phóng thích Dox thụ động điều kiện 37oC từ mẫu FADF đƣợc thực cho kết tƣơng tự nhƣ mẫu FAD Thay đổi pH dung dịch gần nhƣ không ảnh hƣởng tới khả đốt nóng hệ FADF từ trƣờng Ngay nhiệt độ tƣơng đƣơng với nhiệt độ thể (khoảng 37oC), Dox đƣợc giải phóng từ 4,7 đến 11,2% từ FAD FADF Từ trƣờng cƣờng độ 80 Oe cho nhiệt độ đốt nóng cao hơn, q trình giải phóng thuốc diễn nhanh hơn, đồng thời lƣợng Dox đƣợc giải phóng lớn Khác với q trình giải phóng thuốc thơng thƣờng, q trình đốt nóng cảm ứng sinh nhiệt từ bên hạt kích thích trình giải phóng thuốc diễn nhanh Nhƣ vậy, điều chỉnh từ trƣờng ngồi để điều khiển tốc độ lƣợng thuốc phóng thích Một số nghiên cứu khác giải phóng thuốc cách chủ động Bảng 4.9: Thông số giải phóng Dox đốt nóng với từ trường khác FAD pH FAD pH7.4 FADF pH FADF pH 7.4 Thời gian Nhiệt % Dox Nhiệt % Dox Nhiệt % Dox Nhiệt % Dox (s) độ độ độ độ giải giải giải giải phóng 18 (oC) phóng ± (oC) SD 30 phóng ± (oC) SD 30 phóng ± (oC) ± SD 30 SD 30 70 Oe 750 39,27 11,2±1,3 40,23 6,0±0,7 37,63 10,9±0,4 38,11 4,7±1,0 1500 43,08 28,8±0,8 44,52 25,3±1,3 42,35 29,1±0,6 43,48 24,4±0,7 2250 45,32 49,5±0,9 46,05 37,9±1,8 43,68 46,7±1,7 44,99 37,2±1,3 3000 45,87 56,3±1,5 46,81 41,5±1,2 44,30 51,6±1,0 45,71 39,4±2,0 80 Oe 750 46,13 30,1±1,5 45,56 21,5±0,5 45,87 28,2±2,0 46,22 20,6±0,9 1500 51,25 53,5±0,6 50,78 38,8±2,1 50,19 48,0±1,4 51,74 35,4±0,9 2250 51,98 67,6±0,9 51,43 49,4±1,7 51,16 62,7±0,9 52,10 45,1±1,7 3000 52,16 78,1±1,6 51,83 56,4±1,2 51,24 74,2±1,8 52,31 51,0±1,5 Nhƣ vậy, hệ FADF FADQ có tính chất vật liệu phù hợp để sử dụng đƣợc cho đối tƣợng sinh học 4.3.7 Độc tính tế bào 4.3.7.1 Độc tính tế bào FADF 1.4 CdTe FAQ FAQD 4.0 3.5 1.0 0.8 0.6 0.4 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.2 0.0 IC50>5 ug/ml 4.5 IC50 (g/ml) IC50 (gml) 1.2 DOX FAD FADF 0.5 Hep-G2 LU-1 Vero Dong te bao HeLa Hình 4.24: Độc tính tế bào hệ mẫu chứa doxorubicin 0.0 Hep-G2 LU-1 RD Vero Hình 4.26: Độc tính tế bào hệ mẫu chứa CdTe (CdTe, FAQ FADQ) So với Dox nguyên chất, FADF có độc tính dịng tế bào Hep-G2, LU-1, Vero HeLa thấp (IC50 lớn hơn) Nguyên nhân q trình nano hố làm Dox tạo liên kết hoá học với bề mặt hạt nano, làm chậm trình tác động Dox tế bào So với FAD, FADF thể độc tính cao mẫu này, yếu tố folat giúp mẫu bám đích tế bào tốt 19 Mặc dù vậy, FAD FADF với IC50 thấp (dƣới g/ml) cho thấy khả hoá trị tốt dòng tế bào nghiên cứu 4.3.7.2 Độc tính tế bào hệ chứa chấm lượng tử CdTe Đối với dòng tế bào, giá trị IC50 FAQ cao chút so với CdTe, có nghĩa gắn kết CdTe với hạt nano Fe3O4 ma trận polyme alginate độc tính CdTe giảm (hình 4.26) Mẫu mang đồng thời CdTe Dox (FADQ) có hiệu để điều trị ung thƣ (giá trị IC50 cho Hep-G2, LU-1, RD Vero lần lƣợt 1,34; 3,83; 1,35 2,13 g/ml) nhờ kết hợp Dox thuốc ung thƣ chấm lƣợng tử CdTe Nhƣ vậy, mẫu FAD, FADF, FADQ thực nhiều chức nhƣ nhiệt từ trị, phát huỳnh quang hoá trị diệt tế bào ung thƣ FADQ biểu diệt tế bào tốt đồng thời thể độc tính cao với động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng) mang khối u (chuột chết yếu sau tiêm 50 l/con) Do đó, tiếp tục tiến hành thử nghiệm hiệu tác động mẫu FAD, FADF chuột, mẫu FA đƣợc sử dụng thêm để so sánh 4.3.8 Độ bền FAD, FADF FADQ môi trường sinh lí FAD, FADF FADQ đƣợc xác định độ bền dung dịch có nồng độ muối 0,2 M pH khác nhờ phép đo Zeta Kết đƣợc trình bày bảng 4.12 Bảng 4.1: Thế Zeta (mV) FAD, FADF FADQ dung dịch có nồng độ NaCl 0,2 M pH khác pH FAD FADF FADQ -19,2 ± 1,9 -18,5 ± 2,1 -9,4 ± 2,1 -32,0 ± 2,6 -30,4 ± 1,7 - 13,8 ± 2,3 -33,2 ± 1,5 -32,2 ± 2,9 -15,6 ± 1,8 -43,1 ±1,2 -39,0 ± 2,5 -19,4± 1,4 Kết bảng 4.12 cho thấy mẫu Fe3O4 bọc alginate mang Dox Zeta âm, kể pH Nguyên nhân tƣợng lớp vỏ alginate hạt từ giàu nhóm COO-, tƣơng tự nhƣ kết đƣợc công bố trƣớc liên quan đến hạt từ bọc alginate [194] Thế Zeta FADF không khác biệt đáng kể so với FAD Trong vùng pH từ đến 9, FAD FADF có độ bền tốt (với trị số Zeta 30 mV) Mẫu FADQ có độ bền thấp mẫu 20 4.3.9 Kết thử nghiệm in vivo 4.3.9.2 Phân bố sắt quan Định lƣợng Fe mẫu mô quan cho thấy, lƣợng Fe mô đặc biệt khối u (trừ máu) chuột nhóm FADF cao so với nhóm chứng Tuy nhiên so sánh thống kê chƣa thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh hàm lƣợng Fe từ quan nhóm FAD so với nhóm chứng có xu hƣớng tƣơng tự (p=0,08) Hình 4.29: Kết định lƣợng sắt quan sau tiêm tĩnh mạch (G: gan, L: lách, M: máu, T: thận, U: u) 4.3.9.3 Kết điều trị in vivo hệ nano kết hợp với đốt nóng cảm ứng từ Trong suốt trình điều trị, trọng lƣợng chuột nhóm khơng khác biệt đáng kể thời điểm đo Kích thƣớc trung bình khối u thời điểm phân nhóm khơng có khác biệt đáng kể nhóm Sau đốt từ lần, kích thƣớc khối u nhóm FADF có dấu hiệu khơng phát triển Đƣờng biểu diễn kích thƣớc khối u có xu hƣớng ngang Nhóm chuột có khối u nhỏ rõ rệt so với nhóm cịn lại sau lần đốt từ, tƣơng ứng thời điểm đo thứ (p