Phân lập và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất từ cây tỏi đá lê trễ (aspidistra letreae)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  VÕ MINH KHUÊ PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY TỎI ĐÁ LÊ TRỄ (ASPIDISTRA LETREAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU Thừa Thiên Huế, năm 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  VÕ MINH KHUÊ PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY TỎI ĐÁ LÊ TRỄ (ASPIDISTRA LETREAE) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS HỒ VIỆT ĐỨC Thừa Thiên Huế, năm 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu kết nghiên cứu ghi luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố cơng trình khác Họ tên tác giả Võ Minh Khuê ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu thực luận văn, nhận giúp đỡ quý báu, nhiệt tình nhiều thầy giáo, chun gia nhiều lĩnh vực, anh chị, bạn bè gia đình Trước hết, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau Đại học Trường Đại học Sư phạm Huế Trường Đại học Y Dược Huế, cảm ơn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi thầy cô, anh chị cơng tác Phịng Nghiên cứu Hợp chất thiên nhiên - Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế quãng thời gian học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cám ơn tập thể cán phịng Thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp tơi thử nghiệm hoạt tính sinh học Với lịng kính trọng biết sâu sắc, xin gởi lời cảm ơn chân thành đến TS Hồ Việt Đức, người tận tình hướng dẫn, hết lịng bảo, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, tơi muốn gởi đến gia đình, anh chị, bạn bè, người đồng hành, động viên suốt trình học tập nghiên cứu, công việc sống Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng 11 năm 2019 Võ Minh Khuê iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 VAI TRÒ CỦA HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỀN THUỐC 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHI ASPIDISTRA Ở TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.2.1 Các nghiên cứu chi Aspidistra Việt Nam 1.2.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Aspidistra giới 1.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Aspidistra .17 1.3 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÂY TỎI ĐÁ LÊ TRỄ 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu, xác định tên khoa học mẫu thu thập 22 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất 22 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng ung thư dịch chiết chất phân lập 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 XỬ LÝ MẪU VÀ CHUẨN BỊ CÁC CAO CHIẾT 25 3.2 QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .25 3.3 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 27 CHƯƠNG BÀN LUẬN 29 4.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 29 4.1.1 Hợp chất AL1: 2H-chromen-2-one 29 4.1.2 Hợp chất AL2: α-tocopherol 32 4.1.3 Hợp chất ALE4: (25S)-Spirost-1β,3α,5β-triol 34 4.2 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 I KẾT LUẬN 42 Về thành phần hóa học 42 Về hoạt tính sinh học 42 II KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL1 Phụ lục 2: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL2 Phụ lục 3: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ALE4 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CH2Cl2 Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Dichloromethane COSY Correlation Spectroscopy DMSO EtOAc Hela HepG2 IC50 Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Human cervix carcinoma Human hepatocellular carcinoma Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Heteronuclear Single Quantum Coherence Inhibitory Concentration 50% J (Hz) J coupling constant MBC Minimum Bactericidal Concentration 13 C-NMR H-NMR HMBC HMQC HSQC MDA-MB231 MeOH MIC Phổ tương tác hai chiều 1H1 H OD SK-LU-1 SRB δ (ppm) δ (ppm = part per million) NIH/3T3 NOESY Ung thư cổ tử cung người Ung thư gan người Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Nồng độ ức chế 50% Hằng số tương tác tính Hz Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Ung thư vú người Human breast carcinoma Methanol Minimum Inhibitory Concentration Human stomach gastric adenocarcinoma Tế bào lành Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Optical Density Human lung carcinoma Sulforhodamine B MKN-7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Nồng độ ức chế tối thiểu Ung thư dày người Nguyên bào sợi phôi chuột Phổ NOESY Mật độ quang Ung thư phổi người Độ dịch chuyển hóa học tính phần triệu Ghi chú: Tên phương pháp phổ, dòng tế bào, hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học viết theo nguyên Tiếng Anh để đảm bảo tính thống xác DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học Aspidistra sichuanensis (được xác định UPLC/Q-TOF MSE) 13 Bảng 1.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật Aspidistra elatior 17 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm khả gây độc tế bào mẫu nghiên cứu 28 Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR hợp chất AL1 hợp chất tham khảo 31 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR hợp chất AL2 hợp chất tham khảo 34 Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR hợp chất ALE4 hợp chất tham khảo 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Cây Tỏi đá lê trễ 21 Hình 2.2 Hoa thân rễ Tỏi đá lê trễ 21 Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn từ bột Tỏi đá lê trễ 25 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn n-hexane Tỏi đá lê trễ 26 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn EtOAc Tỏi đá lê trễ 27 Hình 4.1 Phổ 1H-NMR hợp chất AL1 29 Hình 4.2 Phổ 13C-NMR hợp chất AL1 30 Hình 4.3 Phổ HSQC hợp chất AL1 30 Hình 4.4 Phổ HMBC hợp chất AL1 31 Hình 4.5 Cấu trúc hóa học hợp chất AL1 phân lập từ Tỏi đá lê trễ 32 Hình 4.6 Phổ 1H-NMR hợp chất AL2 33 Hình 4.7 Phổ 13C-NMR hợp chất AL2 33 Hình 4.8 Cấu trúc hóa học hợp chất AL2 phân lập từ Tỏi đá lê trễ 34 Hình 4.9 Phổ 1H-NMR hợp chất ALE4 35 Hình 4.10 Phổ 13C-NMR hợp chất ALE4 36 Hình 4.11 Phổ COSY hợp chất ALE4 37 Hình 4.12 Phổ HMBC hợp chất ALE4 37 Hình 4.13 Phổ HSQC hợp chất ALE4 39 Hình 4.14 Các tương tác NOESY hợp chất ALE4 39 Hình 4.15 Phổ NOESY hợp chất ALE4 40 Hình 4.16 Cấu trúc hóa học hợp chất ALE4 phân lập từ Tỏi đá lê trễ 40 MỞ ĐẦU Bệnh ung thư ngày gia tăng nhanh chóng, khủng hoảng thực cho sức khỏe cộng đồng thách thức lớn cho hệ thống y tế toàn giới Tại nước phát triển, ung thư nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau tim mạch Theo thông báo WHO ung thư cơng bố năm 2012, năm tồn giới có khoảng 14,1 triệu ca mắc có đến 8,2 triệu ca tử vong bệnh ung thư Trong số đó, trường hợp tử vong nước phát triển chiếm khoảng 70% Dự báo hai thập kỷ tới số ca tử vong bệnh lên đến 13 triệu số ca mắc tăng thêm khoảng 22 triệu [15] Riêng Việt Nam, có khoảng 125.000 trường hợp mắc khoảng 94.700 người chết ung thư năm [2],[14] Hiện có nhiều phương pháp điều trị ung thư bao gồm phương pháp truyền thống (phẫu thuật, hóa trị, xạ trị) phương pháp (dùng thuốc điều trị thử nghiệm lâm sàng) phương pháp thường gây nhiều tác dụng phụ, ảnh hưởng đến thể Vì năm gần đây, nhà nghiên cứu có xu hướng tìm kiếm loại thảo dược có nguồn gốc tự nhiên để điều trị ung thư an toàn với thể Chi Tỏi rừng (Aspidistra) phát lần vào năm 1822 Nhưng năm 1911 có 11 lồi mơ tả giới Ở Việt Nam, chi bị quên lãng thời gian dài Đến cuối kỉ 20, có lồi Aspidistra ghi nhận lãnh thổ nước ta Tuy nhiên, thập niên qua số loài Aspidistra hệ thực vật Việt Nam phát thêm, với 43 lồi phát mơ tả (chiếm 1/3 tổng số loài Aspidistra giới) [1],[34] Do vậy, Việt Nam xem trung tâm đa dạng bậc chi Aspidistra Nhiều loài Aspidistra sử dụng y học cổ truyền để làm thuốc bổ, chữa long đờm, lợi tiểu, chữa gãy xương, tắc nghẽn động mạch, giải độc rắn cắn Các nghiên cứu dược lý đại chứng minh nhiều nhóm hợp chất tách từ chi (lectin, homoisoflavone, steroidal saponin) sở hữu nhiều hoạt tính quý kháng virus, kháng u, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn Đặc biệt số steroidal saponin thể tác dụng ức chế gần hồn tồn với q trình chép virus HIV, hứa hẹn phát triển thành thuốc chữa HIV tương [38] Zuo, S Q., Liu, Y N., Yang, Y., Guo, Z Q., Liu, C X., Guo, Z Y., He, H B., Tu, X and Zou K (2018), "Aspidsaponins A–D, Four new steroidal saponins from the rhizomes of Aspidistra elatior Blume and their cytotoxicity", Phytochemistry Letters, 25, 126-131 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL1 Phụ lục 2: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL2 Phụ lục 3: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ALE4 Phụ lục 1: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL1 Phổ 1H-NMR giãn hợp chất AL1 Phổ 13C-NMR giãn hợp chất AL1 Phụ lục 2: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT AL2 Phổ 1H-NMR giãn (a) hợp chất AL2 Phổ 1H-NMR giãn (b) hợp chất AL2 Phổ 1H-NMR giãn (c) hợp chất AL2 Phổ 13C-NMR giãn (a) hợp chất (AL2) Phổ 13C-NMR giãn (b) hợp chất AL2 Phụ lục 3: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT ALE4 Phổ 1H-NMR giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ 1H-NMR giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ 13C-NMR giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ 13C-NMR giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ 13C-NMR giãn (c) hợp chất ALE4 Phổ COSY giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ COSY giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ COSY giãn (c) hợp chất ALE4 Phổ HMBC giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ HMBC giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ HMBC giãn (c) hợp chất ALE4 Phổ HMBC giãn (d) hợp chất ALE4 Phổ HSQC giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ HSQC giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ NOESY giãn (a) hợp chất ALE4 Phổ NOESY giãn (b) hợp chất ALE4 Phổ NOESY giãn (c) hợp chất ALE4 ... phân lập chất từ phân đoạn EtOAc Tỏi đá lê trễ 3.3 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP Hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất tinh khiết thử nghiệm dòng tế. .. phân lập xác định dạng chất tinh khiết Hình 4.16 Cấu trúc hóa học hợp chất ALE4 phân lập từ Tỏi đá lê trễ 40 4.2 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP Trong hợp. .. HỌC SƯ PHẠM  VÕ MINH KHUÊ PHÂN LẬP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY TỎI ĐÁ LÊ TRỄ (ASPIDISTRA LETREAE) Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ