Phân lập và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy in vitro của một số hợp chất từ nụ vối ( Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.et Perry thu hái ở Quảng Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HUỲNH NHƯ TUẤN PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TỤY IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ NỤ VỐI [Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry] THU HÁI Ở QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HUỲNH NHƯ TUẤN PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TỤY IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ NỤ VỐI [Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry] THU HÁI Ở QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Mạnh Hùng TS Hà Vân Oanh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình q báu thầy cơ, nhà khoa học, cán Viện, Trường gia đình bạn bè Trước hết, cho phép tơi bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Trần Mạnh Hùng TS Hà Vân Oanh, người thầy, người tận tình hướng dẫn động viên suốt thời gian thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM, tập thể Phòng thí nghiệm Hóa Dược, Khoa Hố tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cám ơn thầy ThS Nghiêm Đức Trọng, anh chị kỹ thuật viên môn Thực vật Dược, Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội TS Hoàng Lê Sơn, Khoa bào chế chế biến, Viện Dược liệu hỗ trợ tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln khích lệ, cổ vũ tơi để có kết ngày hơm Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2019 Học viên Huỳnh Như Tuấn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Vối 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.1.1 Tên gọi vị trí phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.1.3 Phân bố 1.1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.2.1 Flavonoid 1.1.2.2 Tinh dầu 1.1.2.3 Triterpenoid 1.1.2.4 Các hợp chất khác 10 1.1.3 Tác dụng dược lý 11 1.1.3.1 Độc tính tế bào 11 1.1.3.2 Tác dụng chống tăng đường huyết 12 1.1.3.3 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 13 1.1.3.4 Tác dụng kháng virus 13 1.1.3.5 Tác dụng chống oxy hóa 13 1.1.3.6 Tác dụng chống viêm 14 1.1.4 Độc tính 14 1.1.5 Công dụng, thuốc 14 1.1.5.1 Công dụng 14 1.1.5.2 Bài thuốc 14 1.2 Tổng quan ung thư tuyến tụy 15 1.2.1 Giới thiệu ung thư tuyến tụy 15 1.2.1.1 Tuỵ ung thư tuyến tuỵ 15 1.2.1.2 Phân loại ung thư tuyến tụy 16 1.2.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư tuyến tụy 16 1.2.1.4 Một số dòng tế bào ung thư tuyến tụy 17 1.2.2 Một số hợp chất phân lập từ tự nhiên có khả kháng ung thư tuyến tụy dòng tế bào PANC-1 MIA PACA-2 17 1.2.2.1 Một số hợp chất phân lập từ thuốc Việt Nam 17 1.2.2.2 Một số hợp chất phân lập từ thuốc khác giới 19 1.2.2.3 Một số hợp chất phân lập từ keo ong 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương tiện nghiên cứu 21 2.2.1 Hóa chất 21 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 21 2.2.3 Tế bào ung thư nuôi cấy tế bào 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 23 2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần phân đoạn 23 2.3.1.2 Phương pháp phân lập hợp chất 23 2.3.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất 24 2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 24 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào 24 2.3.2.2 Phương pháp đánh giá khả kích hoạt caspase-3 26 2.3.2.3 Phương pháp phân tích q trình tự chết tế bào (apoptosis) 26 2.3.2.4 Phương pháp phân tích chu kỳ tế bào (cell cycle arrest) 27 2.3.3 Xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Kết chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ nụ Vối 29 3.1.1 Điều chế cao chiết tổng cao chiết phân đoạn 29 3.1.2 Phân lập hợp chất từ nụ Vối 30 3.2 Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tuỵ in vitro dòng tế bào PANC-1 MIA PACA-2 hợp chất phân lập 40 3.2.1 Thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh tế bào 40 3.2.2 Thử nghiệm kích hoạt caspase-3 41 3.2.3 Thử nghiệm phân tích q trình tự chết tế bào (apoptosis) 43 3.2.4 Thử nghiệm phân tích chu kỳ tế bào 44 Chương BÀN LUẬN 46 4.1 Về chiết xuất, phân lập số hợp chất 46 4.2 Về đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tuỵ in vitro hợp chất phân lập 47 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT δ CC Độ dịch chuyển hoá học Cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) Sắc ký cột (Column Chromatography) cs Cộng CTPT Công thức phân tử DCM Dichloromethan DMC 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon DMSO Dimethylsulfoxid DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol GF254 Gypsum fluorescent 254 nm FBS Huyết thai bò (Fetal Bovine Serum) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal Inhibitory Concentration) J Hằng số tương tác MeOH Methanol OD Mật độ quang (Optical Density) ROS Các gốc tự có oxy (Reactive Oxygen Species) PBS pp (tr.) Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate Buffered Saline) Nồng độ ức chế 50% tế bào môi trường nuôi cấy không dinh dưỡng Trang SKLM Sắc ký lớp mỏng H-NMR 13 C-NMR PC50 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các hợp chất chalcon phân lập từ Vối Bảng 1.2 Các hợp chất flavanon phân lập từ Vối Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 1.5 Các hợp chất flavon, flavonol, dihydroflavonol phân lập từ Vối Các hợp chất terpenoid phân lập từ Vối Một số hợp chất kháng tế bào PANC-1 phân lập từ thuốc Việt Nam 18 Một số hợp chất kháng tế bào PANC-1 MIA Bảng 1.6 PACA-2 phân lập từ thuốc khác 19 giới Bảng 1.7 Một số hợp chất kháng tế bào PANC-1 phân lập từ keo ong 20 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR CO1 33 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR CO2 34 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR CO3 35 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR CO4 37 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR CO5 38 Kết đánh giá hoạt tính chống tăng sinh tế bào Bảng 3.6 ung thư tụy hợp chất phân lập từ nụ 40 Vối Bảng 3.7 Kết thử nghiệm kích hoạt caspase-3 tế bào PANC-1 DMC 42 Kết phân tích q trình tự chết (apoptosis) Bảng 3.8 tế bào PANC-1 có mặt DMC µM, 10 µM 30 µM 44 Tỉ lệ (%) tế bào PANC-1 pha G0/G1, S, Bảng 3.9 G2/M apoptosis (sub-G1) sau xử lí với hợp chất DMC (CO1) nồng độ 3, 10 30 µM 45 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình 1.1 Tên hình Cơng thức cấu tạo 7-hydroxy-5-methoxy-6,8dimethylisoflavon Trang Hình 1.2 Các hợp chất chalcon phân lập từ Vối Hình 1.3 Các hợp chất flavanon phân lập từ Vối Hình 1.4 Các hợp chất flavon, flavonol, dihydroflavonol phân lập từ Vối Cơng thức cấu tạo triterpenoid khung ursan (A), Hình 1.5 olean (B), lupan (C), taraxastan (D) multiflorane (E) Hình 1.6 Các hợp chất khác phân lập từ Vối 10 Hình 1.7 Vị trí cấu tạo tuyến tụy 15 Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo Arctigenin 19 Hình 1.9 Phản ứng làm đổi màu phép thử chống tăng sinh tế bào với kít Dojindo 25 Hình 3.1 Sơ đồ điều chế cao chiết từ nụ Vối 29 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất CO1 CO2 30 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất CO3 CO4 31 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất CO5 32 Hình 3.5 Cấu trúc hố học hợp chất CO1 34 Hình 3.6 Cấu trúc hố học hợp chất CO2 35 Hình 3.7 Cấu trúc hố học hợp chất CO3 36 Hình 3.8 Cấu trúc hố học hợp chất CO4 37 Hình 3.9 Cấu trúc hố học hợp chất CO5 39 Hình thái tế bào PANC-1 kính hiển vi quang học Hình 3.10 sau xử lý với DMC nồng độ khác 24 41 Phụ lục 3.1 Phổ 1H-NMR CO2 (đo CD3OD, 400 MHz) Phụ lục 3.2 Phổ 13C-NMR CO2 (đo CD3OD, 100 MHz) PHỤ LỤC 4: PHỔ CỦA HỢP CHẤT CO3 Hợp chất CO3 : Kaempferol Phụ lục 4.1 Phổ 1H-NMR CO3 (đo CD3OD, 400 MHz) Phụ lục 4.2 Phổ 13C-NMR CO3 (đo CD3OD, 100 MHz) PHỤ LỤC 5: PHỔ CỦA HỢP CHẤT CO4 Hợp chất CO4 : Quercetin Phụ lục 5.1 Phổ 1H-NMR CO4 (đo CD3OD, 400 MHz) Phụ lục 5.2 Phổ 13C-NMR CO4 (đo CD3OD, 100 MHz) PHỤ LỤC 6: PHỔ CỦA HỢP CHẤT CO5 Hợp chất CO5 : Kaempferol 3-O-β-D-rutinosid Phụ lục 6.1 Phổ 1H-NMR CO5 Phụ lục 6.2 Phổ giãn 1H-NMR CO5 (4,0-8,5 ppm) Phụ lục 6.3 Phổ giãn 1H-NMR CO5 (3,2-3,9 ppm) Phụ lục 6.4 Phổ 13C-NMR CO5 Phụ lục 6.5 Phổ giãn 13C-NMR CO5 (95-180 ppm) Phụ lục 6.6 Phổ giãn 13C-NMR CO5 (15-80 ppm) ... rõ tác dụng chống tăng đường huyết hợp chất DMC (3) phân lập từ nụ Vối Theo công bố Yingdi Luo Yanhua Lu (2012), DMC có khả bảo vệ tế bào MIN6 chống lại tự chết tế bào (apoptosis) thông qua việc... 1.1.5.1 Công dụng Từ xưa, nụ vối nhân dân Việt Nam nấu nước uống vừa thơm vừa có tác dụng tiêu cơm, nhu n tràng Liều dùng hàng ngày: 10 - 20g Lá vối tươi hay khô sắc đặc thuốc sát trùng dùng rửa mụn