Phân lập một số hợp chất từ keo ong dú Lisotrigona furva engel. và đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ VÂN PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ KEO ONG DÚ LISOTRIGONA FURVA ENGEL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ VÂN PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ KEO ONG DÚ LISOTRIGONA FURVA ENGEL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU – DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Nguyễn Thành TS Nguyễn Quỳnh Chi HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận đƣợc hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình mặt từ Thầy Cơ, bạn bè gia đình Nhân dịp này, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Nguyễn Thành, TS Nguyễn Quỳnh Chi, ngƣời Thầy, ngƣời Cơ tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi động viên suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cán bộ, nhân viên Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho đƣợc nghiên cứu khoa học Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới Thầy Cô Bộ môn Dƣợc liệu, Dƣợc học cổ truyền, Thực vật dƣợc – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội; Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học tồn thể Thầy Cơ trƣờng truyền đạt cho tơi kiến thức bổ ích, giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln sát cánh, động viên tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, tháng năm 2019 Học viên Hoàng Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, phân bố đặc điểm hình thái ong Dú 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.2 Ong Dú Việt Nam 1.3 Các sản phẩm ứng dụng từ ong Dú 1.3.1 Các sản phẩm thông dụng từ ong Dú .4 1.3.2 Keo ong Dú .5 1.4 Thành phần hóa học keo ong Dú 1.4.1 Flavonoid 1.4.2 Terpen 11 1.4.3 Phenolic 15 1.4.4 Các hợp chất khác 18 1.5 Hoạt tính sinh học keo ong Dú 19 1.5.1 Kháng khuẩn 21 1.5.2 Kháng nấm 23 1.5.3 Kháng viêm 23 1.5.4 Độc tế bào chống ung thư 23 1.5.5 Chống oxy hóa 24 1.5.6 Hoạt tính sinh học khác 24 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 26 2.2.1 Trang thiết bị 26 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Phương pháp chiết xuất phân lập 28 2.3.1.1 Chiết xuất 28 2.3.1.2 Phân lập chất 28 2.3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 30 2.3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào phương pháp MTT 30 2.3.2.1 Nguyên lý 30 2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 30 2.3.2.3 Chuẩn bị dòng tế bào 30 2.3.2.4 Các bước tiến hành 31 2.3.2.5 Tính kết .31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Phân lập hợp chất từ keo ong Dú Bình Định 32 3.1.1 Chiết xuất 32 3.1.2 Phân lập 33 3.1.2.1 Phân lập 10 phân đoạn từ F1 – F10 33 3.1.2.2 Phân lập hợp chất H1, H2, H3, H6 từ phân đoạn F5 33 3.1.2.3 Phân lập hợp chất H16 từ phân đoạn F4 34 3.1.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 35 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập .37 3.1.3.1 Hợp chất H1 37 3.1.3.2 Hợp chất H2 41 3.1.3.3 Hợp chất H6 43 3.1.3.4 Hợp chất H3 47 3.1.3.5 Hợp chất H16 49 3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro 52 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 55 4.1 Các chất phân lập đƣợc 55 4.2 Tác dụng gây độc tế bào in vitro 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CÁC TỪ VIẾT TẮT ATCC TIẾNG ANH The American Type Culture Collection CH2Cl2 δH, δC DEPT ED50 Effective dose 50% ESI EtOAc EtOH GC Electrospray Ionization HMBC HPLC HSQC IC50 Lu MCF-7 MeOH MIC MS MTT NMR PC50 SKLM Tổ chức tài nguyên tiêu chuẩn vật liệu sinh học Mỹ Dicloromethan Độ dịch chuyển hóa học proton carbon Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO GC-MS TIẾNG VIỆT Gas Chromatography Gas Chromatography Mass Spectometry Heteronuclear Multiple Bond Connectivity High Performance Liquid Chromatography Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy 50% inhibitory concentration Human lung carcinoma Human breast carcinoma Dimethyl sulfoxid Liều có hiệu 50% tổng số tế bào Ion hóa phun mù điện tử Ethyl acetat Ethanol Sắc ký khí Sắc ký khí ghép khối phổ Phổ tƣơng tác xa proton carbon Sắc ký lỏng hiệu cao Phổ tƣơng tác proton carbon Nồng độ ức chế 50% Dòng tế bào ung thƣ phổi Dòng tế bào ung thƣ vú Methanol Minimal inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration Mass Spectometry Khối phổ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromid Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân Nồng độ 50% số tế Preferential cytotoxicity 50 bào bị chết Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 1.2 1.3 1.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 Tên bảng Trang Các nhóm hợp chất phát từ keo loài ong Dú giới Hoạt tính sinh học keo lồi ong Dú khác 19 giới Nồng độ ức chế tối thiểu dịch chiết EtOH từ keo ong Dú 22 Tetragonisca fiebrigi số chủng vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu hợp chất phân lập từ keo ong 22 Dú Tetragonula laeviceps số chủng vi khuẩn Kết SKLM chất H1, H2, H3, H6 với hệ dung môi 36 sau màu thuốc thử Cerisulfat Kết SKLM hợp chất H16 với hệ dung môi sau 37 màu thuốc thử Cerisulfat Số liệu phổ NMR hợp chất H1 40 Số liệu phổ NMR hợp chất H2 43 Số liệu phổ NMR hợp chất H6 46 Số liệu phổ NMR hợp chất H3 48 Số liệu phổ NMR hợp chất H16 51 Kết thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thƣ chất 53 phân lập đƣợc (theo phƣơng pháp MTT) DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 1.2 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 4.1 Tên hình Hình thái học bên ong Dú Lisotrigona furva Engel Keo ong Dú (Stingless bee propolis) Keo ong Dú Lisotrigona furva Engel thu Bình Định Sơ đồ chiết keo ong Sơ đồ phân lập hợp chất H1, H2, H3, H6 từ phân đoạn F5 Sơ đồ phân lập hợp chất H16 từ phân đoạn F4 Sắc ký đồ chất H1, H2, H3, H6 với hệ dung môi III sau màu thuốc thử Cerisulfat Sắc ký đồ hợp chất H16 với ba hệ dung môi I, II, III sau màu thuốc thử Cerisulfat Cơng thức hóa học liên kết HMBC H1 Cơng thức hóa học liên kết HMBC H2 Cơng thức hóa học liên kết HMBC H6 Cơng thức hóa học H3 Cơng thức hóa học H16 Cấu trúc hợp chất phân lập từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel Trang 26 32 34 35 36 37 39 42 45 47 50 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Keo ong hỗn hợp nhựa với chất tiết từ tuyến nƣớc bọt loài ong, đƣợc sử dụng để hàn kín tổ, giúp bảo quản mật ong, bảo vệ phát triển ấu trùng, trứng thân khỏi công tác nhân gây bệnh [1] Các loài ong nhƣ ong Mật ngoại (Apis melifera, tơng Apini) lồi ong Dú (hay gọi stingless bee) (tơng Meliponini) cho nhiều keo ong Keo ong đƣợc sử dụng rộng rãi từ lâu giới, đƣợc dùng nhiều thực phẩm chức để tăng cƣờng sức khỏe, phòng chống bệnh tật Thành phần hóa học keo ong Mật Apis melifera giới đƣợc nhiều nhóm khoa học nghiên cứu cho thấy có chứa hợp chất nhƣ phenolic acid, phenolic ester, flavonoid, triterpen, stilben Dịch chiết tổng hợp chất phân lập từ keo ong có nhiều tác dụng sinh học nhƣ chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thƣ, chống viêm [26] Gần đây, nhà khoa học có nhiều quan tâm, nghiên cứu đến ong địa không vòi (stingless bee) hay gọi ong Dú loài ong phong phú mặt số lƣợng loài, với 300 loài giới Keo loài ong Dú giới chứa nhiều thành phần hóa học nhƣ flavonoid, terpen, hợp chất phenolic có nhiều tác dụng sinh học đáng ý nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thƣ, chống oxy hóa [22], [45] Các lồi ong Dú Việt Nam thuộc chi Trigona Lisotrigona Hiện có nghiên cứu thành phần hóa học keo ong Dú Trigona minor Bến Tre chƣa có nghiên cứu keo ong Dú Lisotrigona Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập số hợp chất từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro” với hai mục tiêu sau: Phân lập số hợp chất từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro số hợp chất phân lập đƣợc từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT H2 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC) PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT H6 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC) PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT H3 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR) PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT H16 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) ... tế bào ung thƣ vú Methanol Minimal inhibitory Nồng độ ức chế tối thi u concentration Mass Spectometry Khối phổ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromid Nuclear magnetic resonance... keo lồi ong Dú khác 19 giới Nồng độ ức chế tối thi u dịch chiết EtOH từ keo ong Dú 22 Tetragonisca fiebrigi số chủng vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thi u hợp chất phân lập từ keo ong 22 Dú Tetragonula... Baicalein (10) Năm 2017, từ keo ong Dú Melipona orbignyi, nhà khoa học Brazil phát hợp chất flavanon flavanonol nhƣ naringenin, aromadendrin, 7-Omethyl aromadendrin 7-O-methyl-naringenin [45] Naringenin