TRẦN THANH HOA PHÂN lập một số hợp CHẤT từ DỊCH CHIẾT METHANOL của CÀNH cây máu CHÓ đá KNEMA SAXATILIS DE WILDE và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG gây độc tế bào IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THANH HOA PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THANH HOA PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU – DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Nguyễn Thành TS Nguyễn Quỳnh Chi HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài cho luận văn, nhận đƣợc giúp đỡ tận tình nhiều tập thể cá nhân Xin cảm ơn “Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia” GS.TS Nguyễn Văn Hùng chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài chi Knema Horsfieldia (Myristicaceae)” mã số 104.01-2017.47, cung cấp kinh phí để thực đề tài Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Nguyễn Thành – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Quỳnh Chi – Bộ môn Dƣợc liệu, Đại học Dƣợc Hà Nội giao đề tài quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Nguyễn Thành, ThS Trần Hữu Giáp với cán Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển – Viện hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng bảo tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể thầy giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại cho kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trƣờng Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân ln ủng hộ, động viên sống nhƣ suốt q trình hồn thành luận văn Do hạn chế thời gian nhƣ kiến thức nên luận văn khơng tránh đƣợc thiếu sót nên mong nhận đƣợc đóng góp thầy để tơi bổ sung, hồn thiện kiến thức phục vụ cho công việc sau Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019 Học viên Trần Thanh Hoa MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu họ Myristicaceae (Nhục đậu khấu) 1.2 Tổng quan chi Knema (Máu chó) 1.2.1 Về vị trí phân loại chi Knema 1.2.2 Về đặc điểm thực vật phân bố chi Knema (Máu chó) 1.2.3 Về thành phần hóa học chi Knema 1.2.4 Về hoạt tính sinh học chi Knema 15 1.3 Giới thiệu Máu chó đá (Knema saxatilis) 19 1.3.1 Về vị trí phân loại Máu chó đá (Knema saxatilis) 19 1.3.2 Về đặc điểm chung Máu chó đá (Knema saxatilis) 19 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 21 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất phân lập 22 2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro 24 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26 3.1 Chiết xuất, phân lập nhận dạng cấu trúc hợp chất phân lập 26 3.1.1 Chiết xuất 26 3.1.2 Phân lập hợp chất từ dịch chiết methanol 26 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập 29 3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 32 3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro hợp chất phân lập 42 Chƣơng 4: BÀN LUẬN .44 4.1 Về thành phần hóa học 44 4.2 Về tác dụng sinh học 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CÁC TỪ VIẾT TẮT H-NMR 13 C-NMR TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT Proton Nuclear Magnetic Resonance 13 Carbon Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ proton Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C Độ dịch chuyển hóa học proton cacbon δH, δC Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cell line The American Type Culture Collection Dòng tế bào ung thƣ phổi br Broad Broad CC Column Chromatography Sắc ký cột A-549 ATCC Tổ chức tài nguyên tiêu chuẩn vật liệu sinh học Mỹ Cấu trúc hóa học CTHH d Doublet Doublet dd Doublet doublet Doublet doublet DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit DPPH Diphenyl picril hydrazilhydrate Diphenyl picril hydrazilhydrat ED50 50% effective dose Liều có hiệu 50% EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat ESI-MS HSV1 Electrospray Lonization- Mass Spectory Herpes simplex virus Ion hóa khối phổ Vi-rút herpes simplex loại HT-29 Human colon cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ đại tràng HO-8910 Cellosaurus cell line Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng KB Epidermoid carcinoma of cavity Dòng tế bào ung thƣ biểu mô IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% m Multiplet Multiplet MCF-7 Human breast carcinoma Dòng tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol Methanol MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazol brom MTT MS Mass Spectroscopy Phổ khối lƣợng MDA-MB231 Breast cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ vú NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân NCI-H187 Small cell lung carcinoma Dòng tế bào ung thƣ phổi tế bào nhỏ OD Optical Density Mật độ quang học OVCAR-3 Ovarian cancer cell line Dòng tế bào ung thƣ buồng trứng Sắc ký lớp mỏng SKLM s Singlet Singlet SW13 Human adrenal carcinoma cell Tế bào ung thƣ tuyến thƣợng thận RPMI Roswell park memorial institute Môi trƣờng nuôi cấy học viện Roswell Park Memorial phát triển DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hoạt tính chất phân lập từ Knema glomerata 16 Bảng 1.2 Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase hợp chất từ Knema laurina 17 Bảng 3.1 Kết SKLM chất CDM 10, CDM 13 sau màu thuốc thử Cerisulfat 30 Bảng 3.2 Kết SKLM chất CDM sau màu thuốc thử Cerisulfat 31 Bảng 3.3 Kết SKLM chất CDM 6, CDM sau màu thuốc thử Cerisulfat 32 Bảng 3.4 Số liệu phổ hợp chất CDM 10 tài liệu tham khảo [10], [16] 33 Bảng 3.5 Số liệu phổ hợp chất CDM tài liệu tham khảo [18] 35 Bảng 3.6 Số liệu phổ hợp chất CDM tài liệu tham khảo [39] 37 Bảng 3.7 Số liệu phổ hợp chất CDM tài liệu tham khảo 39 Bảng 3.8 Số liệu phổ hợp chất CDM 13 tài liệu tham khảo [34] 41 Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro với hai dòng tế bào ung thƣ ngƣời năm hợp chất phân lập 43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập đƣợc từ chi Knema Hình 1.2 Các hợp chất alk(en)yl phenol phân lập đƣợc từ chi Knema Hình 1.3 Các hợp chất acid anacardic phân lập đƣợc từ chi Knema 11 Hình 1.4 Các hợp chất lignan phân lập đƣợc từ chi Knema 12 Hình 1.5 Các hợp chất terpen phân lập đƣợc từ chi Knema 13 Hình 1.6 Các hợp chất phân lập từ loài Knema pachycarpa Việt Nam 14 Hình 1.7 Một số hình ảnh Máu chó đá (Knema saxatilis) 19 Hình 3.1 Sắc ký đồ chất CDM 10, CDM 13 sau màu thuốc thử cerisulfat 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ chất CDM sau màu thuốc thử cerisulfat 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ chất CDM 6, CDM sau màu thuốc thử cerisulfat 31 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất CDM 10 33 Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất CDM 34 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất CDM 36 Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất CDM 38 Hình 3.8 SKLM CDM (1); CDM + Taxifolin (2); Taxifolin (3) với hệ dung môi CH2Cl2/Aceton = 85/15 39 Hình 3.9 Cấu trúc hợp chất CDM 13 40 Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất flavonoid phân lập từ cành Knema saxatilis 44 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn từ cành Máu chó đá 26 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cắn chiết methanol 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, nguồn tài nguyên cỏ sở quan trọng để sàng lọc tìm thuốc Nhiều hoạt chất tách chiết từ dƣợc liệu đƣợc nghiên cứu xác định cấu trúc tác dụng dƣợc lý Kết hợp với công nghệ bào chế đại nhiều dƣợc phẩm mang giá trị cao đƣợc đời nhƣ viên nang cao Bạch (Ginkgo biloba), viên chứa dịch chiết tỏi có hoạt chất allicin (Allimax), viên nén cao Cúc gai dài (Cardus marianus) chứa hoạt chất silymarin (Cigenol) Bên cạnh đó, nhiều hoạt chất từ dƣợc liệu đƣợc tinh chế đạt đến độ tinh khiết sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc tiêm nhƣ paclitaxel từ loài Taxus revifolia (Taxol, Mĩ); vinblastin từ loài Vinca rosea (Velban, Pháp), artemisinin từ loài Artemisia annua (tạo dẫn chất artemether, dạng tiêm bắp) Tất điều nói lên tiềm to lớn chƣa đƣợc khai phá hết nguồn tài ngun dƣợc liệu, đặc biệt với nƣớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi cho thảm thực vật đa dạng phát triển nhƣ Việt Nam Chi Máu chó (Knema) thuộc họ Nhục đầu khấu Myristicaceae lồi xanh quanh năm có nƣớc Đơng Nam Á nhƣ Thái Lan, Malaysia, Việt Nam [53] Ở Việt Nam tìm thấy khoảng 13 lồi thuộc chi Máu chó phân bố tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Bộ Tên gọi Máu chó xuất phát từ đặc điểm chung lồi thân có nhựa tiết màu đỏ Nhiều loài thuộc chi Knema đƣợc sử dụng y học cổ truyền làm thuốc chữa ghẻ, mụn nhọt Các nghiên cứu giới cho thấy, chi Knema có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng vi-rút, kháng lao, chống ung thƣ, chống viêm, chống oxy hóa, độc tế bào tác dụng ức chế acetylcholinesterase [42] Cây Máu chó đá có tên khoa học Knema saxatilis de Wilde loài đặc hữu Việt Nam phân bố tỉnh miền Trung chƣa đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học nhƣ tác dụng sinh học [53] Quá trình sàng lọc cho thấy dịch chiết có tác dụng ức chế 100% phát triển dòng tế bào ung thƣ tuyến thƣợng thận SW13 nồng độ µg/ml [3] Chính vậy, đề tài: “Phân lập số hợp chất từ 60 61 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ PHỔ 1H-NMR, 13 C-NMR, APCI-MS CỦA CHẤT CDM 62 63 64 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHỔ 1H-NMR, ESI-MS CỦA CHẤT CDM 65 66 PHỤ LỤC 4: PHỔ 1H CỦA TAXIFOLIN THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHỔ 1H-NMR, 13C-NMR, APCI-MS CỦA CHẤT CDM 10 68 69 70 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ PHỔ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS CỦA CHẤT CDM 13 71 72 73 PHỤ LỤC 7: KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO STT Tên mẫu CDM4 CDM6 CDM7 CDM10 CDM13 Ellipticine Nồng độ mẫu thử (g/ml) 256 64 16 IC50 256 64 16 IC50 256 64 16 IC50 256 64 16 IC50 256 64 16 IC50 IC50 74 Phần trăm ức chế d ng tế bào ung thƣ Lu MCF-7 89 75 56 51 40 11 46 62.9 91 75 50 45 37 34 35 16 30 64 96 82 71 61 21 49 38 23 20 175 94 95 87 56 53 23 43 10 35 12.4 55.27 98 97 81 28 48 32 30 18.9 125.21 0.37 0.48 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THANH HOA PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT METHANOL CỦA CÀNH CÂY MÁU CHÓ ĐÁ KNEMA SAXATILIS DE WILDE VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY... de Wilde (Máu chó Poilane) Knema saxatilis de Wilde (Máu chó đá) Knema sessiliflora de Wilde (Máu chó hoa khơng cọng) Knema squamulosa de Wilde (Máu chó vảy nhỏ) Knema tonkinensis de Wilde (Máu. .. tế bào in vitro đƣợc thực hiện, với mục tiêu: Phân lập 3-5 hợp chất từ dịch chiết methanol cành Máu chó đá xác định cấu trúc hóa học chất phân lập đƣợc Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro