HOÀNG THỊ vân PHÂN lập một số hợp CHẤT từ KEO ONG dú LISOTRIGONA FURVA ENGEL và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG gây độc tế bào IN VITRO LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học

Thành phần hóa học của keo ong Mật Apis melifera trên thế giới đã được nhiều nhóm khoa học nghiên cứu và cho thấy có chứa các hợp chất như phenolic acid, phenolic ester, flavonoid, trit

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ VÂN

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ KEO ONG

DÚ LISOTRIGONA FURVA ENGEL VÀ ĐÁNH GIÁ

TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ VÂN

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ KEO ONG

DÚ LISOTRIGONA FURVA ENGEL VÀ ĐÁNH GIÁ

TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Nguyễn Thành

TS Nguyễn Quỳnh Chi

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các Thầy Cô, bạn bè và gia đình

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Lê

Nguyễn Thành, TS Nguyễn Quỳnh Chi, là những người Thầy, người Cô đã tận tình

hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ, nhân viên Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu khoa học tại đây

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô trong Bộ môn Dược liệu, Dược học cổ truyền, Thực vật dược – Trường Đại học Dược Hà Nội; Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học cùng toàn thể các Thầy Cô trong trường đã truyền đạt cho tôi những kiến thức bổ ích, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!

Hà Nội, tháng 4 năm 2019

Học viên

Hoàng Thị Vân

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm hình thái của ong Dú 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Phân bố 2

1.1.3 Đặc điểm hình thái 2

1.2 Ong Dú tại Việt Nam 3

1.3 Các sản phẩm ứng dụng từ ong Dú 4

1.3.1 Các sản phẩm thông dụng từ ong Dú 4

1.3.2 Keo ong Dú 5

1.4 Thành phần hóa học của keo ong Dú 7

1.4.1 Flavonoid 9

1.4.2 Terpen 11

1.4.3 Phenolic 15

1.4.4 Các hợp chất khác 18

1.5 Hoạt tính sinh học của keo ong Dú 19

1.5.1 Kháng khuẩn 21

1.5.2 Kháng nấm 23

1.5.3 Kháng viêm 23

1.5.4 Độc tế bào và chống ung thư 23

1.5.5 Chống oxy hóa 24

1.5.6 Hoạt tính sinh học khác 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Phương tiện nghiên cứu 26

2.2.1 Trang thiết bị 26

2.2.2 Dung môi, hóa chất 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 28

2.3.1.1 Chiết xuất 28

2.3.1.2 Phân lập các chất 28

2.3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được 30

2.3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT 30

2.3.2.1 Nguyên lý 30

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 30

2.3.2.3 Chuẩn bị các dòng tế bào 30

2.3.2.4 Các bước tiến hành 31

2.3.2.5 Tính kết quả 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Phân lập các hợp chất từ keo ong Dú Bình Định 32

3.1.1 Chiết xuất 32

3.1.2 Phân lập 33

3.1.2.1 Phân lập 10 phân đoạn từ F1 – F10 33

3.1.2.2 Phân lập 4 hợp chất H1, H2, H3, H6 từ phân đoạn F5 33

3.1.2.3 Phân lập hợp chất H16 từ phân đoạn F4 34

3.1.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được 35

3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 37

3.1.3.1 Hợp chất H1 37

3.1.3.2 Hợp chất H2 41

3.1.3.3 Hợp chất H6 43

3.1.3.4 Hợp chất H3 47

3.1.3.5 Hợp chất H16 49

3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro 52

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 55

4.1 Các chất phân lập được 55

4.2 Tác dụng gây độc tế bào in vitro 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

1 Kết luận 59

2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CÁC TỪ

ATCC The American Type Culture

của proton và carbon

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid

ED50 Effective dose 50% Liều có hiệu quả trên 50%

tổng số tế bào ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun mù điện tử EtOAc Ethyl acetat

GC Gas Chromatography Sắc ký khí

GC-MS Gas Chromatography Mass

Spectometry Sắc ký khí ghép khối phổ HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Connectivity

Phổ tương tác xa proton - carbon

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear single-quantum

correlation spectroscopy

Phổ tương tác proton - carbon

IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50%

Lu Human lung carcinoma Dòng tế bào ung thư phổi MCF-7 Human breast carcinoma Dòng tế bào ung thư vú

MIC Minimal inhibitory

concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MS Mass Spectometry Khối phổ

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PC50 Preferential cytotoxicity 50 Nồng độ tại đó 50% số tế

bào bị chết SKLM Sắc ký lớp mỏng

1.3 Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết EtOH từ keo ong Dú

Tetragonisca fiebrigi trên một số chủng vi khuẩn

22

1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất phân lập từ keo ong

Dú Tetragonula laeviceps trên một số chủng vi khuẩn

22

3.1 Kết quả SKLM của các chất H1, H2, H3, H6 với 3 hệ dung môi

sau khi hiện màu bằng thuốc thử Cerisulfat

36

3.2 Kết quả SKLM của hợp chất H16 với 3 hệ dung môi sau khi hiện

màu bằng thuốc thử Cerisulfat

37 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất H1 40 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất H2 43 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất H6 46 3.6 Số liệu phổ NMR của hợp chất H3 48 3.7 Số liệu phổ NMR của hợp chất H16 51 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư của các chất

phân lập được (theo phương pháp MTT)

53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.1 Hình thái học bên ngoài của ong Dú Lisotrigona furva Engel 3 1.2 Keo ong Dú (Stingless bee propolis) 6 2.1 Keo ong Dú Lisotrigona furva Engel thu tại Bình Định 26 3.1 Sơ đồ chiết keo ong 32 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất H1, H2, H3, H6 từ phân đoạn F5 34 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất H16 từ phân đoạn F4 35 3.4 Sắc ký đồ của các chất H1, H2, H3, H6 với hệ dung môi III sau

khi hiện màu bằng thuốc thử Cerisulfat

36

3.5 Sắc ký đồ của hợp chất H16 với ba hệ dung môi I, II, III sau khi

hiện màu bằng thuốc thử Cerisulfat

37

3.6 Công thức hóa học và các liên kết HMBC chính của H1 39 3.7 Công thức hóa học và các liên kết HMBC chính của H2 42 3.8 Công thức hóa học và các liên kết HMBC chính của H6 45 3.9 Công thức hóa học của H3 47 3.10 Công thức hóa học của H16 50 4.1 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ keo ong Dú Lisotrigona

furva Engel

55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Keo ong là hỗn hợp nhựa cây cùng với chất tiết từ tuyến nước bọt của loài ong, được sử dụng để hàn kín tổ, giúp bảo quản mật ong, bảo vệ sự phát triển của ấu trùng, trứng và bản thân khỏi sự tấn công của tác nhân gây bệnh [1] Các loài ong như ong

Mật ngoại (Apis melifera, tông Apini) và các loài ong Dú (hay còn gọi là stingless bee)

(tông Meliponini) cho nhiều keo ong Keo ong được sử dụng rộng rãi từ rất lâu trên thế giới, và hiện nay được dùng nhiều trong các thực phẩm chức năng để tăng cường sức

khỏe, phòng chống bệnh tật Thành phần hóa học của keo ong Mật Apis melifera trên

thế giới đã được nhiều nhóm khoa học nghiên cứu và cho thấy có chứa các hợp chất như phenolic acid, phenolic ester, flavonoid, triterpen, stilben Dịch chiết tổng và các hợp chất phân lập từ keo ong có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống viêm [26] Gần đây, các nhà khoa học có nhiều quan tâm, nghiên cứu đến ong bản địa không vòi (stingless bee) hay còn gọi là ong Dú vì các loài ong này phong phú về mặt số lượng loài, với hơn 300 loài trên thế giới Keo của các loài ong Dú trên thế giới cũng chứa nhiều thành phần hóa học như flavonoid, terpen, hợp chất phenolic và có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa [22], [45]

Các loài ong Dú ở Việt Nam thuộc 2 chi Trigona và Lisotrigona Hiện nay mới chỉ có nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong Dú Trigona minor ở Bến Tre và chưa có nghiên cứu nào về keo ong Dú Lisotrigona Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phân lập một số hợp chất từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel và đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro” với hai mục tiêu sau:

1 Phân lập một số hợp chất từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel

2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro của một số hợp chất phân lập được từ keo ong Dú Lisotrigona furva Engel

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm hình thái của ong Dú

thuộc hai chi là Lisotrigona và Trigona [11], [36]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Hình thái học bên ngoài của ong Dú có ba bộ phận cơ thể: đầu, ngực và bụng Các bộ phận quan trọng có trên đầu bao gồm râu, mắt đơn, mắt kép Phần ngực có hai cặp cánh và ba cặp chân Chân sau của hầu hết các ong Dú thợ có một túi phấn để thu thập và vận chuyển phấn hoa và các vật liệu khác Phần thứ ba của cơ thể là bụng Điểm đáng chú ý là bao phủ bên ngoài cơ thể ong Dú là một lớp lông [29]

Các loài ong Dú có kích thước nhỏ hơn nhiều so với ong Mật Loài Lisotrigona

furva Engel có chiều dài toàn thân là 3,23 - 3,66 mm; chiều dài cánh trước là 2,33 -

2,60 mm Phần đầu có chiều rộng là 1,14 - 1,23 mm và chiều dài là 1,05 – 1,23 mm [17]

Hình 1.1: Hình thái học bên ngoài của ong Dú Lisotrigona furva Engel

A: mặt lƣng; B: mặt bên; C: chân; D: phần đầu; E: phần ngực [59]

1.2 Ong Dú tại Việt Nam

Các loài ong Dú ở Việt Nam thuộc 2 chi Trigona và Lisotrigona Chi Trigona đã phát hiện đƣợc các loài: Trigona laeviceps, Trigona gressitti, Trigona pagdeni,

Trigona fuscobalteata, Trigona minor phân bố ở tỉnh Bến Tre và các tỉnh miền Trung Trigona ventralis phân bố tại Hòa Bình Chi Lisotrigona đã phát hiện đƣợc các loài: Lisotrigona carpenteri phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh; Lisotrigona cacciae

phân bố ở nhiều tỉnh miền nam, Lisotrigona furva phân bố ở Bình Định [11], [36]

Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Tống Xuân Chinh và cộng sự về cấu trúc

tổ, đặc tính bầy đàn của 35 tổ ong Dú thuộc 3 loài: Lisotrigona carpenteri Engel,

Trigona laeviceps Smith và Trigona ventralis Smith tại Rừng Quốc gia Cúc Phương

cho thấy, 3 loài ong Dú này có các cách làm tổ khác nhau và số lượng ong trưởng

thành trên mỗi tổ cũng khác nhau Trong đó, loài Trigona ventralis xây dựng tổ với 10.000 ong trưởng thành và thường làm tổ trong thân cây sống Loài Trigona laeviceps

xây dựng tổ với số lượng lên đến 1200 ong trưởng thành, tạo ra nhiều hốc khác nhau

để làm tổ và chủ yếu xây dựng tổ trên cây.Loài Lisotrigona carpenter xây dựng tổ với

số lượng ong trong bầy đàn ít nhất là 400 ong trưởng thành [11]

Theo một nghiên cứu mới đây nhất về keo ong Dú Trigona minor tại tỉnh Bến

Tre, Việt Nam năm 2017, dịch chiết EtOH của keo loài ong Dú này có khả năng ức chế dòng tế bào gây ung thư tuyến tụy PANC-1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của dịch chiết này đã xác định được 15 hợp chất triterpenoid-cycloartan, trong đó có 5 hợp chất mới và một triterpenoid-lanostan Trong số các hợp chất được xác định, acid 23-hydroxyisomangiferolic B và acid 27-hydroxyisomangiferolic là hai hợp chất có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư tuyến tụy ở người PANC-1 tốt nhất với giá trị

PC50 lần lượt là 4,3 và 3,7 µM [36]

Hiện nay, ong Dú được nuôi nhiều tại các địa phương: Vĩnh Long, Gia Lai, Đồng Nai, Bình Định, Khánh Hòa, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thanh Hóa, Hòa Bình, Quảng Ninh,…

1.3 Các sản phẩm ứng dụng từ ong Dú

1.3.1 Các sản phẩm thông dụng từ ong Dú

Ong Dú là những sinh vật có vai trò sinh thái quan trọng như giúp thụ phấn cho nhiều loài thực vật hoang dã, cây trồng, giúp tăng số lượng, chất lượng của quả, hạt và làm tăng sản lượng lương thực [49] Các sản phẩm của ong Dú bao gồm: mật ong, sáp ong, phấn hoa được biết đến do có nhiều hoạt tính sinh học và có giá trị về mặt kinh tế, giá trị dinh dưỡng, sức khỏe và thẩm mỹ [29]

Mật ong Dú có chứa nhiều thành phần khác nhau và có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Mật ong Dú bao gồm các thành phần như: glucose, fructose, sucrose, maltose, acid amin, cacbohydrat, hợp chất phenolic, acid hữu cơ, vitamin, khoáng chất, chất béo, các enzym và các hợp chất tự nhiên khác Mật ong Dú là thực phẩm bổ

dưỡng cho sức khỏe Mật ong Dú có tác dụng kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, giúp vết thương nhanh lành,…[3]

Sáp ong Dú được tiết ra từ các tuyến ở bụng của ong Dú thợ, dùng để xây tổ, bao gồm các hydrocacbon, monoester, acid béo, alcol và một số chất khác Sáp ong có tác dụng kháng khuẩn, giúp vết thương nhanh lành, làm đẹp da, bảo vệ da chống lại tia

UV [29]

Phấn hoa được các ong Dú thợ thu thập và lưu trữ trong tổ Số lượng lớn phấn hoa có thể thu hoạch bởi người nuôi ong Phấn hoa giàu protein, vitamin (A, B, C, D, E), khoáng chất giúp cung cấp chất dinh dưỡng cho người [3], [29]

Sữa ong chúa là một chất lỏng do các ong thợ còn non tiết ra, được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng của ong chúa và ong thợ Thành phần dinh dưỡng của sữa ong chúa bao gồm: protein, fructose, glucose, sucrose, acid béo, các khoáng chất K, Mg,

Ca, Na, Zn, Fe, Cu, … Sữa ong chúa giúp tăng cường sức đề kháng cho con người [3]

Nọc ong Dú được tiết ra từ tuyến nọc của ong Dú thợ, dưới dạng chất lỏng trong suốt, có mùi vị đặc biệt, đắng và cay, khô nhanh.Các thành phần hóa học của nọc ong bao gồm: tryptophan, cholin, glycerin, acid phosphoric, acid palmitic, acid béo, vitelin, apromin, các peptid, các enzym, histamin và melittin Cùng với sự phát triển của khoa học, nọc ong chủ yếu được sử dụng trong các loại thuốc thông qua cách châm nọc ong Một vài bệnh có thể được chữa bằng cách châm nọc ong như bệnh thần kinh, thấp khớp, phế quản, hen suyễn, bệnh động mạch vành và liệt dương [3]

Keo ong Dú cũng là một sản phẩm từ ong Dú mà trước đây chỉ được dùng để bảo

vệ tổ ong, chưa được con người khai thác sử dụng Hiện nay, trong các sản phẩm từ ong Dú thì keo ong Dú ngày càng được quan tâm và có nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh học tại các nước trên thế giới [21], [39], [46]

1.3.2 Keo ong Dú

Một số loài ong được biết là sản sinh ra keo ong, bao gồm ong Mật thuộc tông

Apini và ong Dú thuộc tông Meliponini Có hơn 300 loài đã được báo cáo trong tông Meliponini, trong đó có 43 loài thuộc hai chi Lisotrigona và Trigona được tìm thấy ở

các vùng khác nhau của châu Á, trong đó có Việt Nam [36]

Về mặt sinh học, keo ong Dú là gồm hỗn hợp nhựa cây, sáp, hạt phấn, bùn và đất Ong Dú dùng keo để hàn các vết nứt ở tổ, để cố định các túi mật, túi phấn, trứng trong tổ Ngoài ra chúng còn dùng keo như vũ khí để bảo vệ tổ để tránh sự xâm nhập của kiến, gián, các vi sinh vật Để khai thác keo ong Dú, chỉ cần lấy dao nhỏ để tách ra khỏi tổ Tùy vào từng đàn ong Dú, mỗi năm có thể khai thác keo ong Dú từ 1 – 2 lần, tốt nhất nên kết hợp với việc khai thác mật ong Dú, phấn hoa ong Dú trong cùng một lần [19], [47]

Hình 1.2: Keo ong Dú (Stingless bee propolis)

(a) trong tổ và (b) sau thu hoạch

Trong những năm gần đây, nhiều báo cáo khoa học đã chứng minh tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ dạ dày

từ keo ong của các loài ong Dú khác nhau [45] Keo ong Dú được biết đến là kháng sinh tự nhiên có hiệu quả trong việc chữa lành các vết thương và nhiễm trùng trong cơ thể và là thành phần của kem đánh răng, nước xịt họng [3], [31]

Tại Brazil, keo ong Dú đã được sử dụng để điều trị các bệnh về đường hô hấp và

da Nhiều nghiên cứu cho thấy keo ong Dú Brazil có khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn, bảo vệ dạ dày [4], [13], [20], [41] Keo ong Dú

ở Indonesia có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư ở người [12] Ở Nhật Bản, Brazil, keo ong được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm với mục đích duy trì và cải thiện sức khỏe [32] Keo ong Dú tại Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Malaysia có khả năng chống ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa [36], [37], [41], [49]

1.4 Thành phần hóa học của keo ong Dú

Trên thế giới, thành phần keo ong Mật đã được nhiều nhóm khoa học quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước khác nhau Thành phần keo ong Mật đa dạng với nhiều nhóm hợp chất như flavonoid, triterpen, phenolic Đã có khoảng 300 hợp chất được phân lập từ keo ong Mật [26]

Tuy nhiên các nghiên cứu về keo ong Dú chủ yếu bắt đầu từ thế kỷ 21 Các nhà khoa học đã quan tâm đến keo ong Dú do sự đa dạng về số loài, cũng như sự đa dạng

về mặt địa lý, nguồn thực vật

Thành phần hóa học của keo ong Dú được nghiên cứu nhiều trong các năm gần đây, gồm các nhóm chất như flavonoid, terpen, phenolic, benzophenon… Nhiều hợp chất mới đã được phân lập từ keo ong Dú Gần đây, các hợp chất như xanthon, alcaloid lần đầu tiên được phân lập từ keo ong Dú Đặc biệt alcaloid là nhóm hợp chất chưa từng được phát hiện từ keo ong Mật [10]

Dựa trên tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về keo ong Dú, các kết quả nghiên cứu

về thành phần hóa học của keo ong Dú được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.1 Các nhóm hợp chất phát hiện từ keo các loài ong Dú trên thế giới

1 Melipona beecheii Mexico Tinh dầu [38]

Tinh dầu [51]

2 Melipona compressites Brazil Tinh dầu [34]

3 Melipona fasciculata Brazil

Flavonoid

6 Melipona quadrifasciata

anthidioides Brazil

Diterpen [56] Phenolic;

Flavonoid [44] Tinh dầu [34] Triterpen; Sterol [5]

7 Melipona scutellaris Brazil Benzophenon [14]

11 Tetragona clavipes Brazil Tinh dầu [34]

12 Tetragonula biroi Friese Philipin Flavonoid [39]

15 Tetragonula pagdeni Thái Lan Phenolic [57]

16 Tetrigona melanoleuca Thái Lan Triterpen [43]

17 Trigona apicalis Malaysia Phenolic;

Flavonoid [42]

18 Trigona minor Việt Nam Triterpen [36]

19 Trigona spinipes Brazil Triterpen cycloartan;

Flavonoid [22]

20 Trigona sp Ấn Độ Hợp chất khác [12]

1.4.1 Flavonoid

Flavonoid là nhóm hợp chất thường gặp trong keo ong Mật cũng như keo ong

Dú Thành phần flavonoid trong keo ong Dú thường được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp HPLC hay HPLC kết hợp với phổ khối MS Một số hợp chất flavonoid được phân lập và xác định dựa trên các phương pháp đo phổ khác nhau

Năm 2015, nhóm tác giả nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong Dú

Tetragonula biroi Friese tại Philippin đã phân lập được 4 hợp chất flavonoid là

propolin A, propolin E, propolin H, glyasperin A [39]

Propolin A (1) Propolin E (2)

Propolin H (3) Glyasperin A (4)

Năm 2016, từ keo ong Dú Trigona apicalis tại Malaysia, bằng phương pháp

HPLC các nhà khoa học đã xác định được các hợp chất flavonoid là myricetin, naringin, quercetin, hesperitin, kaempferol và baicalein [42]

Myricetin (5) Naringin (6) Quercetin (7)

Hesperitin (8) Kaempferol (9) Baicalein (10)

Năm 2017, từ keo ong Dú Melipona orbignyi, các nhà khoa học Brazil đã phát

hiện ra các hợp chất flavanon và flavanonol như naringenin, aromadendrin, methyl aromadendrin và 7-O-methyl-naringenin [45]

7-O-Naringenin (11) Aromadendrin (12)

7-O-methyl aromadendrin (13) 7-O-methyl-naringenin (14)

Nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong Dú Scaptotrigona bipunctata tại

Brazil của Cisilotto và cộng sự năm 2018 đã xác định các hợp chất Flavon 6,8-C diglycosyl hóa trong đó có vicenin-1 và vicenin-2 bằng phương pháp ESI-MS [10]

Vicenin-1 (15) Vicenin-2 (16)

1.4.2 Terpen

a Tinh dầu

Tinh dầu thông thường bao gồm các hợp chất monoterpen và sesquiterpen, hợp chất hydrocarbon, và một số aldehyd, alcol, acid, ester Thành phần tinh dầu ở keo ong thường có hàm lượng thấp nên ít được nghiên cứu hơn so với các nhóm hợp chất không bay hơi Trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên cứu về thành phần tinh dầu keo ong Dú

Năm 1999, Bankova và cộng sự đã xác định thành phần tinh dầu của keo ong Dú

từ các loài Melipona compressites, Tetragona clavipes, Melipona quadrifasciata

anthidioides ở Brazil [4]

Thành phần tinh dầu keo ong Dú Melipona compressites gồm các hợp chất terpen như α-pinen nerolidol, spathulenol và các hợp chất khác như acid cinnamic

(3,7%), ethylphenol (10%), hydrocarbon C8-C25 (27,5%)

Thành phần tinh dầu keo ong Dú Tetragona clavipes được phát hiện có 39 hợp

chất, trong đó các hợp chất terpen chiếm thành phần chính như verbenol (3%), verbenon (3,1%), nerolidol (12,3%), spathulenol (10,4%), T-muurolol (3,5%)

Từ keo ong Dú Melipona quadrifasciata anthidioides đã phát hiện được 32 hợp

chất, trong đó chủ yếu là các hợp chất monoterpen với p-Cimen-8-ol (11,4%), verbenon (6,5%) chiếm thành phần chính [4]

Năm 2006, Pino và cộng sự đã nghiên cứu thành phần tinh dầu của keo ong Dú

Melipona beecheii tại Yucata, Mexico bằng phương pháp GC-MS đã phát hiện được

92 hợp chất có trong tinh dầu keo ong này, trong đó các thành phần chính gồm các hợp

chất terpen như α-pinen (17,6%), β-caryophyllen (11,8%), spathulenol (9,7%),

caryophyllen oxid (9,5%), β-bourbonen (9,2%), β-pinen (6,7%), α-copaen (4,8%) và trans-verbenol (4,0%) [38]

Năm 2016, tinh dầu keo ong Dú Melipona beecheii tại Veracruz, Mexico được

xác định có chứa β-fenchen (14,53-15,45%), styren (8,72-9,98%) và benzaldehyd (7,44-7,82 %) cùng với các hợp chất monoterpen như (Z)-ocimenon (5,33-5,67%), α-

pinen (3,98-4,66%), m-cymen (3,90-4,58%), trans-isocarveol (2,71-2,89%), limonen

(2,66-2,90%), verbenon (2,46-2,72%), β-pinen (2,15-2,57%), acampholenal 2,35%), m-cymenen (2,05-2,33%), trans-pinocamphon (2,05-2,19%) và trans-pulegol (1,89-2,23%) [51]

(2,09-b Hợp chất diterpen

Năm 2000, Bankova và cộng sự nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong

Dú Melipona quadrifasciata anthidioides tại Brazil đã phân lập được các chất là acid

ent-kauren-19-oic (acid kaurenoic), acid ent-15β-3-methylbutanoyloxy kauren-19-oic [56]

-16-Acid ent-kaur-16-en-19-oic

(acid kaurenoic) (17)

Acid ent-15β-3-methylbutanoyloxy-16-

kauren-19-oic (18)

Bằng phương pháp khối phổ phân giải cao (HR-MS), năm 2014 từ keo ong Dú

Tetragonula carbonaria tại Australia, đã phát hiện ra các flavanon cùng với 1 diterpen

là acid abietic [33] Năm 2018, các hợp chất hydroxydehydroabietic, acid

7-oxydehydroabietic và pinusenocarp được phát hiện trong keo ong Dú Melipona

quadrifasciata tại Brazil [10]

Acid abietic (19) 7-hydroxydehydroabietic (20)

Acid 7-oxydehydroabietic (21) Pinusenocarp (22)

c Hợp chất triterpen

Các hợp chất triterpen là nhóm hợp chất thường gặp, được phát hiện hay phân lập

từ các loài ong Dú khác nhau

Năm 2008, nhóm tác giả nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong Dú

Trigona spinipes tại Brazil đã phân lập được các triterpen khung cycloartan là acid

mangiferolic và acid 3β-hydroxy-24-methylencycloartan-26-oic [22]

Acid mangiferolic (23) Acid 3β-hydroxy-24-methylencycloartan

-26-oic (24) Năm 2015, triterpen khung dammaran là dipterocarpol đã được phân lập từ 2 loài

keo ong Dú tại Thái Lan là Tetragonula laeviceps và Tetrigona melanoleuca [43]

Ngoài ra, từ keo ong Dú Tetrigona melanoleuca đã phân lập được một số

triterpen khác như acid 3-O-acetyl ursolic, ocotillon I, ocotillon II, hỗn hợp aldehyd ursolic và oleanolic, cabralealacton [43]

Acid 3-O-acetyl ursolic (26) Ocotillon I (27)

Dipterocarpol (25)

(29) R 1 = R 2 = CH 3 R 3 = H (30) R 1 = H R 2 = R 3 = CH 3

Ocotillon II (28) Hỗn hợp aldehyd ursolic và oleanolic

(29-30)

Cabralealacton (31-32)

Năm 2017, từ keo ong Dú Trigona minor tại Việt Nam đã phân lập đƣợc 16 hợp

chất triterpen trong đó có 5 hợp chất mới (33-37) khung cycloartan, cùng với 10 hợp chất đã biết khung cyloartan gồm cycloartenon (38), acid mangiferonic (39), acid 23-hydroxymangiferonic (40), acid 27-hydroxymangiferonic (41), acid mangiferolic (23), acid 23-hydroxymangiferolic (42), acid 27-hydroxymangiferolic (43), acid 27-hydroxyisomangiferolic (44), (24E)-3β-hydroxycycloart-24-en-26-al (45), (23E)-27-nor-3β-hydroxy-cycloart-23-en-25-on (46), và 1 triterpen khung lanostan là lanosterol (47)[36]

R1 R2 R3 R4(35) COOH OAc H βOH

Nhiều acid phenolic được phát hiện từ các loài keo ong Dú khác nhau Năm

2014, các hợp chất phenolic như acid benzoic, acid dihydrocinnamic, acid cinnamic là

thành phần được xác định có trong keo ong Dú tại Brazil Melipona orbignyi bằng phương pháp GC-MS [7]

Cũng năm 2014 tại Brazil, nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong Dú

Melipona fasciculata đã xác định được các dẫn xuất galloyl glucose bằng phương pháp

HPLC [16]

Năm 2016, acid gallic được xác định trong keo ong Dú Trigona apicalis tại Malaysia bằng phương pháp HPLC [42] Acid gallic, acid ellagic cũng được xác định

trong keo ong Dú Melipona fasciculata tại Brazil [16]

Năm 2017, từ dịch chiết EtOH của keo ong Dú Scaptotrigona depilis và Melipona quadrifasciata anthidioides đã phát hiện ra các acid như acid benzoic, acid

cinnamic, acid vanilic, acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric [5]

Các dẫn chất ester hay glucosid của các acid phenolic cũng được phát hiện từ keo

ong Dú Từ keo ong Dú Melipona subnitida đã phân lập được 2 hợp chất

6-O-p-coumaroyl-D-galactopyranose và glucopyranose [46]

6-O-cinnamoyl-1-O-p-coumaroyl-β-D-Năm 2017, bằng phương pháp HPLC, từ keo ong Dú Melipona quadrifasciata

anthidioides tại Brazil cũng xác định được nhiều dẫn chất glucosid của gallic, acid cinnamic và acid p-coumarinic trong đó có cinnamoyl-galloyl-hexoside và coumaroyl-galloyl-hexoside[44]

b Coumarin và dẫn chất

Từ keo ong Dú Melipona scutellaris tại Brazil đã phân lập được 2 coumarin mới

là 4-propyl coumarin (49), 4-phenyl coumarin (50) và 5 hợp chất coumarin đã biết

(51-55) [15]

(48) R 1 =Cinnamoyloxy

(54) R 2 =H

(49) R 1 =Cinnamoyloxy R 2 =H (52) R 1 =H R 2 =prenyl (53) R 1 =Cinnamoyloxy R 2 =prenyl

(50) R 1 =H (51) R 1 =OH

c Xanthon

Một số hợp chất xanthon đã đƣợc phát hiện từ keo ong Dú ở Thái Lan Năm

2015, các nhà khoa học Thái Lan đã công bố phân lập đƣợc hai hợp chất α-mangostin

(55) và γ- mangostin (56) từ keo ong Tetragonula pagdeni [57] Cùng năm 2015 nhóm

nghiên cứu của Bankova đã công bố phát hiện ra 6 hợp chất xanthon gồm α-mangostin (55), γ-mangostin (56), mangostanin (57), 8-deoxygartanin (58), gartanin (59) và

garcinon B (60) từ keo ong Tetragonula laeviceps [43]

α-mangostin (55) γ – mangostin (56)

Mangostanin (57) 8-deoxygartanin (58)

d Lignan

Năm 2015 từ keo ong Dú Tetragonula laeviceps tại Thái Lan đã phân lập đƣợc 1

hợp chất lignan là methylpinoresinol [43]

Năm 2019, từ keo ong Dú Tetragonula biroi tại Indonesia, Ryo Miyata và cộng

sự đã phân lập đƣợc 2 hợp chất mới là Sulawesin A và Sulewesin B [35]

Sulawesin A (62) Sulawesin B (63)

1.4.4 Các hợp chất khác

a Alcaloid

Alcaloid là các hợp chất chƣa từng đƣợc phát hiện từ keo ong Mật Năm 2018,

từ keo ong Dú Scaptotrigona bipunctata Brazil, một số alcaloid có chứa khung

piperidin nhƣ lobelin, lobelanidin, lenobanonolin, norlobelin và norlebelanidin đã

Gartanin (59) Garcinon B (60)

Methylpinoresinol (61)

được xác định bằng phương pháp HRMS [10] Đây là nghiên cứu đầu tiên phát hiện ra hợp chất alcaloid từ keo ong

Scaptotrigona depilis và Melipona quadrifasciata anthidioides [5]

1.5 Hoạt tính sinh học của keo ong Dú

Dựa trên tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về keo ong Dú, các kết quả nghiên cứu

về hoạt tính sinh học của keo ong Dú được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của keo các loài ong Dú khác nhau trên thế giới

7 Melipona scutellaris Brazil

Giảm đau, kháng viêm [21] Kháng viêm;

Brazil Chống oxy hóa [10]

12 Scaptotrigona depilis Brazil

Phòng ngừa và điều trị mất cân bằng oxy hóa;

Ức chế tăng sinh tế bào khối u

[5]

13 Scaptotrigona postica Brazil Kháng virus [9]

14 Tetragonisca fiebrigi Brazil

alpha-[57]

19 Tetrigona

melanoleuca

Thái Lan Kháng khuẩn [43]

20 Trigona apicalis Malaysia Chống oxy hóa [42]

21 Trigona laeviceps Thái Lan

Ức chế các dòng tế bào ung thư Chago, Kato-III, SW620, BT474 và Hep-G2

[53]

22 Trigona minor Việt Nam Ức chế dòng tế bào PANC-1

gây ung thư tuyến tụy ở người

Nghiên cứu của Campos và cộng sự năm 2014 cho thấy dịch chiết EtOH từ keo

ong Dú Melipona orbignyi có tác dụng kháng khuẩn tốt với vi khuẩn Gram dương (Staphylococus aureus) với giá trị MIC là 3,1 mg/ml [7]

Một nghiên cứu khác của Campos và cộng sự năm 2015 cho thấy dịch chiết

EtOH từ keo ong Dú Tetragonisca fiebrigi có tác dụng kháng khuẩn tốt trên cả vi

khuẩn Gram dương và Gram âm với các giá trị MIC tương ứng ở bảng sau: [8]

Bảng 1.3 Nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết EtOH từ keo ong Dú

Tetragonisca fiebrigi trên một số chủng vi khuẩn

Các hợp chất terpen phân lập được từ keo ong Dú Tetragonula laeviceps và trong

một nghiên cứu của Sanpa và cộng sự năm 2015 cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

tốt (bảng 1.4) [43]

Bảng 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất phân lập từ keo ong Dú

Tetragonula laeviceps trên một số chủng vi khuẩn

Hợp chất (µg/ml) Vi khuẩn Gram dương

B.c L.m M.l S.a S.e S.p MRSA α-mangostin 3,13 0,78 6,25 3,13 1,56 0,78 3,13 Mangostanin 12,5 0,78 25 12,5 25 3,13 12,5 8-deoxygartanin 3,13 1,56 25 1,56 1,56 1,56 1,56 Gartanin 2 12,5 25 12,5 25 6,25 12,5 Dipterocarpol 2 25 25 >25 >25 6,25 25 γ-mangostin 2 12,5 25 25 25 6,25 12,5 Garcinon 3,13 6,25 3,13 6,25 3,13 1,56 6,25 Methylpinoresinol 2 25 25 25 >25 25 25

Chú thích: B.c.: Bacillus cereus; L.m.: Listeria monocytogens; M.l.: Micrococcus luteus; S a.:

Staphylococus aureus; S.e: Staphylococus epidemidis; S.p.: Streptococus pyogens; MRSA: Tụ cầu

vàng kháng Methicillin

1.5.2 Kháng nấm

Nghiên cứu của Campos và cộng sự năm 2014 cho thấy dịch chiết EtOH từ keo

ong Dú Melipona orbignyi có tác dụng kháng nấm Candida albicans với giá trị MIC là

3,1 mg/ml [7]

Một nghiên cứu khác của Campos và cộng sự năm 2015 cho thấy dịch chiết

EtOH từ keo ong Dú Tetragonisca fiebrigi có tác dụng kháng một số chủng nấm như:

Candida glabrata ATCC 90030, Candida glabrata ESA 123, Candida albicans ATCC

90028, Candida albicans ESA 345 với các giá trị MIC (mg/ml) tương ứng lần lượt là:

7,00 ± 0,29; 7,91 ± 0,27; 7,90 ± 0,31; 9,25 ± 0,38 [8]

1.5.3 Kháng viêm

Năm 2015, kết quả nghiên cứu trên dịch chiết EtOH từ ong Dú Tetragonisca

fiebrigi cho thấy tác dụng kháng viêm tốt do ức chế enzyme hyaluronidase Nồng độ

cao nhất của dịch chiết được đánh giá (75 mg/ml) có khả năng ức chế 43,06 ± 3,06% hoạt tính enzym hyaluronidase [8]

Một nghiên cứu khác được tiến hành năm 2017 cũng cho thấy dịch chiết MeOH

từ keo ong Dú Melipona orbignyi có tác dụng kháng viêm tốt Nồng độ cao nhất của

dịch chiết được đánh giá (75 mg/ml) có khả năng ức chế 35,6 ± 2,4 % hoạt tính enzym hyaluronidase [22]

1.5.4 Độc tế bào và chống ung thư

Nghiên cứu của Campos và cộng sự năm 2015 cho thấy keo ong Dú

Tetragonisca fiebrigi tại Brazil có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư hồng cầu -

bạch cầu ở người Hoạt tính chống ung thư của dịch chiết EtOH có thể liên quan đến

sự có mặt của các hợp chất phenolic như acid coumaric, acid cinnamic và các dẫn

xuất Dịch chiết EtOH của keo ong Dú Tetragonisca fiebrig có khả năng gây độc tế

bào phụ thuộc vào nồng độ Ở nồng độ cao nhất được đánh giá (500 𝜇g/mL), dịch

chiết này ức chế 67 ± 2,5% sự phát triển của các tế bào Nồng độ gây độc tế bào hiệu quả nhất của dịch chiết EtOH là 250 và 500 𝜇g/mL [8]

Keo ong Dú Tetragonula laeviceps tại Thái Lan chứa α-mangostin có hoạt tính

ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và dịch chiết keo ong Dú Trigona

sirindhornae tại Thái Lan có khả năng ức chế dòng tế bào gây ung thư biểu mô tế bào

vảy đầu và cổ (HNSCC) [38], [55]

Một nghiên cứu thực nghiệm của Kustiawan và cộng sự năm 2014 cho thấy keo

ong Dú Trigona incisa, Trigona fuscobalteata tại Indonesia có khả năng ức chế một số

dòng tế bào ung thư người như dòng tế bào ung thư gan HepG2, dòng tế bào ung thư đại tràng SW620 [28]

1.5.5 Chống oxy hóa

Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của keo ong Dú Melipona

fasciculata Smith tại Brazil cho thấy keo của loài ong này có khả năng chống oxy hóa

do chứa các acid phenolic, gallotannin và ellagitannin Keo ong Dú Melipona subnitida cũng được xác định là hợp chất giàu hoạt tính chống oxy hóa do sự có mặt

của hợp chất phenolic[46], [16]

Nghiên cứu của Vongsak và cộng sự năm 2015 cho thấy γ-mangostin có trong

keo ong Dú Lepidotrigona ventralis Smith, Lepidotrigona terminata Smith và

Tetragonula pagdeni Schwarz tại Thái Lan có khả năng quét các gốc tự do [57]

1.5.6 Hoạt tính sinh học khác

a Kháng virus

Năm 2015, nghiên cứu của Carvalho và cộng sự cho thấy dịch chiết MeOH của

keo ong Dú Scaptotrigona postica (Brazil) có khả năng ức chế sự sao chép và sự xâm

nhập vào tế bào của virus HSV (Herpes simplex virus) Tác dụng này được xác định là

do các Flavon C-glycosyl, catchin-3-O-gallat và acid 3,4-dicaffeoylquinic gây ra [9]

b Chống sâu răng

Năm 2011, dịch chiết của keo ong Dú Melipona fasciculata tại Brazil được xác định có khả năng ức chế Streptococus mutans, loài vi khuẩn là tác nhân chính gây

bệnh sâu răng [30]

c Điều trị bệnh hen suyễn

Thử nghiệm về hiệu quả điều trị bệnh hen suyễn bằng keo ong Dú

Scaptotrigona aff postica tại Brazil cho thấy dịch chiết từ loài keo ong Dú này có khả

năng làm giảm các bệnh lý liên quan đến hen suyễn do ức chế sự di chuyển các tế bào

viêm vào phế nang và sự phát triển của hệ thống gây viêm dị ứng [18]

d Bảo vệ dạ dày

Năm 2015, nghiên cứu thực nghiệm từ dịch chiết keo ong Dú Melipona

scutellaris tại Brazil có khả năng bảo vệ dạ dày do tăng sản xuất các tác nhân bảo vệ

dạ dày là nitric oxid và prostaglandin [41]

e Ức chế enzyme Xanthin Oxidase

Kết quả nghiên cứu của Ryo Miyata và cộng sự năm 2019 trên keo ong Dú

Tetragonula biroi cho thấy hợp chất 4- (4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl) -

3,5,7-trihydroxycoumarin đƣợc phân lập từ mẫu keo ong này có tác dụng ức chế mạnh

enzym Xanthin Oxidase với giá trị IC50 là 3,9 μM Giá trị IC50 này gần với giá trị của

Allopurinol, là một thuốc đƣợc sử dụng điều trị bệnh gút (gout) (IC50 = 1,0 µM) [35]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Keo ong Dú thu tại nhà nuôi ong ở Hoài Ân, Bình Định vào tháng 7/2017 Loài ong Dú này được PGS.TS Nguyễn Thị Phương Liên, Phòng côn trùng học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam xác định

tên khoa học là Lisotrigona furva Engel., tông Meliponini, họ Apidae Mẫu sinh vật

được lưu tại phòng côn trùng học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, mã số BĐ/04/17

Hình 2.1 Keo ong Dú Lisotrigona furva Engel thu tại Bình Định

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Trang thiết bị

- Dụng cụ thủy tinh: bình chiết, bình nón, cốc thủy tinh các loại, phễu, ống nghiệm, pipet định mức, pipet Pasteur, ống đong, bình cầu, cột sắc ký, ống mao quản, bình chạy sắc ký bản mỏng chuyên dụng

- Bản mỏng silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn

- Bột silica gel pha thường cỡ hạt 40 - 63μm

- Gel Sephadex LH-20

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

- Bơm hút chân không DIVAC1.21 (Mỹ)

- Máy cất quay Buchi R – 210 (Thụy Sỹ)

- Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt

- Micropipet, pipet đa kênh, đầu tip pipet (Isolab, Đức)

- Buồng đếm hemocytometer, máy đếm tế bào (improved Neubauer)

- Tủ ủ CO2 (MMM Group, Germany)

- Máy đọc ELISA (ELISA Bio-Rad machine, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng, tủ sấy

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Dung môi, hóa chất sử dụng trong thực nghiệm đạt tiêu chuẩn phân tích:

- Các dung môi chiết xuất: EtOH, MeOH, n-hexan, EtOAc, CH2Cl2

- Các dung môi chạy sắc ký: Aceton, MeOH, n-hexan, EtOAc, CH2Cl2

- Dung môi đo phổ: CDCl3, MeOD

- Thuốc thử: Cerisulfat

- DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium) (Gibco, Mỹ)

- RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Gibco, Mỹ)

- PBS (phosphate bufferred saline, g/L) (Gibco, Mỹ)

- FBS (Fetal bovine serum) (Gibco, Mỹ)

- MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (DUCHEFA biochemie, Hà Lan)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

2.3.1.1 Chiết xuất

Keo ong được ngâm chiết với EtOH 90% ở nhiệt độ thường Quá trình chiết được lặp lại 4 lần Gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn chiết tổng tương ứng Tiếp đó, hòa cắn chiết tổng bằng nước và chiết lần lượt với dung môi n-hexan, EtOAc Dịch chiết n-hexan, EtOAc được cô cất chân không thu được cắn chiết n-hexan và EtOAc tương ứng Các cắn chiết sẽ được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học

Pha tĩnh: silica gel pha thường cỡ hạt 40 – 63 µm

Pha động: là các dung môi thông dụng như n-hexan, CH2Cl2, MeOH, aceton, EtOAc, và các hỗn hợp của chúng

Cột sắc ký: Cột sắc ký là một cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ

dòng chảy, kích thước tùy lượng cắn phân lập Cột được rửa sạch, sấy khô, gắn trên một giá vững chắc

Phương pháp nhồi cột ướt:

- Cột sắc ký được rửa sạch, sấy khô, lắp trên một giá đỡ cố định Lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột để ngăn cho chất hấp phụ chảy xuống khi mở khóa cột

- Cân một lượng thích hợp silica gel cần dùng vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải

rồi khuấy đều Cho hỗn dịch trên vào cột, mở khóa van tối đa, rót tiếp dung môi vào và

để cho silica gel lắng xuống đáy cột

Ổn định cột:

- Nén cột bằng quả bóp cao su gõ nhẹ đều quanh cột đến khi không còn bọt khí trong

cột, mặt trên của lớp silica gel phẳng ổn định

- Cho tiếp dung môi rửa giải chảy qua cột khoảng 2 giờ, rồi khóa cột lại

Nạp mẫu lên cột:

- Cắn đƣợc hòa tan trong một lƣợng dung môi tối thiểu đến tan hoàn toàn sau đó trộn

đều với một lƣợng tối thiểu silica gel, để dung môi bay hơi hết, đƣợc khối bột mịn, tơi

(mẫu sắc ký)

- Cột sắc ký đã ổn định đƣợc mở khóa cho dung môi trên cột chảy xuống cách bề mặt

silica gel khoảng 2 cm sau đó khóa cột lại

- Rắc đều toàn bộ mẫu sắc ký đã chuẩn bị ở trên lên cột sao cho không làm xáo trộn

lớp silica gel bề mặt, gõ nhẹ xung quanh thành cột cho bột mẫu lắng xuống từ từ, khi

đã ổn định thì mở khóa cột

Rửa giải:

- Sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Kiểm soát tốc độ dòng chảy dung môi theo thời gian

- Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm (hoặc bình nón) thích hợp Sử dụng SKLM

để kiểm tra thành phần dịch hứng, dồn các phân đoạn có cùng thành phần, thu hồi dung môi

2.3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

Xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), 1 chiều: 1H NMR, 13C NMR, DEPT và 2 chiều (HSQC, HMBC) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

2.3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào bằng phương pháp MTT

Phép đánh giá tác dụng gây độc tế bào được tiến hành tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học theo các phương pháp MTT [50]

2.3.2.1 Nguyên lý

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể Dùng DMSO để hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở ʎmax = 540 nm

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu các hợp chất tinh khiết được pha thành dung dịch gốc với nồng độ 100 mM trong DMSO, pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml

2.3.2.3 Chuẩn bị các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: Lu (Human lung carcinoma) – ung thư phổi, MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú Các dòng tế bào nuôi cấy trong môi trường phù hợp, có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO , 37°C, độ

ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối) Tùy vào từng đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

2.3.2.4 Các bước tiến hành

- Pha 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa

96 giếng) trong môi trường DMEM hoặc RPMI cho các dòng tế bào Lu, MCF-7 Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml Ủ 37°C, 5% CO2 trong 3 ngày

- Chứng trắng là 200 µl dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml

- Chứng âm là dung dịch DMSO 0,1%

- Chứng dương là Ellipticin (Sigma)

- Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml ở 37°C trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót

2.3.2.5 Tính kết quả

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính dựa trên số liệu đo mật

độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve