Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài giảo cổ lam thu hái tại yên bái

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  PHẠM HẢI HOA CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM HẢI HOA CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Thân Thị Kiều My Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2015 Lời cảm ơn Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới ThS. Thân Thị Kiều My, người thầy đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược liệu đã hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng ban và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh em, bạn bè trong suốt thời gian qua đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc của tôi. Do thời gian và điều kiện có hạn, khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được sự góp ý của thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên PHẠM HẢI HOA MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma 2 1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma 2 1.2.2. Phân bố chi Gynostemma 3 1.2.3. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam 3 1.3. Thành phần hóa học 6 1.3.1. Nghiên cứu về saponin 6 1.3.2. Nghiên cứu về flavonoid 10 1.3.3. Một số thành phần hóa học khác. 10 1.4. Tác dụng dƣợc lý 10 1.5. Độc tính 12 1.6. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma tại Việt Nam. 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1. Nguyên liệu 16 2.1.2. Thuốc thử, dung môi, hóa chất 17 2.1.3. Dụng cụ 17 2.1.4. Phương tiện và máy móc 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam nghiên cứu 19 3.2. Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất 21 3.2.1. Định lượng cắn các phân đoạn 23 3.2.2. Định tính cắn các phân đoạn 23 3.3. Phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat 26 3.3.1. Phân lập lần 1 26 3.3.2. Phân lập lần 2 29 3.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được 32 3.3.4. Nhận dạng các chất phân lập được 34 3.4. Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết thƣờng AST Ánh sáng thường CHCl 3 Chloroform 13 C – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon Dc Dịch chiết DEPT Distortionless Enhancenment by Polarisation Tranfer EtOAC Ethylacetat EtOH Ethanol G. Gynostemma Glu Glucose Rham Rhamnose Xyl Xylose 1 H – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC High-performance liquid chromatography HPLC – MS Liquid chromatography–mass spectrometry MeOH Methanol MS Mass spectrometry n-BuOH n-butanol NXB Nhà xuất bản STT Số thứ tự TB Trung bình TT Thuốc thử Vanilin/ H 2 SO 4 Dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric 10% UV Ánh sáng tử ngoại UV 254 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm UV 366 Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Saponin thường gặp trong G.pentaphyllum (Thumb.) Makino 8 Bảng 1.2 Kết quả định lượng saponin và flavonoid toàn phần trong lá và thân G.pentaphyllum ở Cao Bằng và Hòa Bình 13 Bảng 1.3 Kết quả định lượng các phân đoạn trong lá và thân Giảo cổ lam ở Sapa, Hòa Bình 14 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái 19 Bảng 3.2 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết lá và thân cây Giảo cổ lam nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn các phân đoạn 24 Bảng 3.4 Giá trị Rf và màu sắc của các vết quan sát được trên sắc kí đồ cắn phân đoạn EtOAc . 25 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của V1 34 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của V2 và số liệu phổ của (22E)- Stigmasta-5,2-dien-3yl-hexopyranoside đã công bố 36 Bảng 3.7 So sánh thành phần hóa học mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu với các mẫu thuộc loài G.pentaphyllum tại Việt Nam 38 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc khung Dammaran 6 Hình 1.2 Cấu trúc saponin trong G.pentaphyllum 7 Hình 1.3 Các dạng cấu trúc của R 7 7 Hình 1.4 Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thumb.) Makino 9 Hình 2.1 Ảnh của GS. Phạm Thanh Kỳ về Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái 16 Hình 3.1 Quy trình chiết các phân đoạn trong lá, thân của cây Giảo cổ lam tại Yên Bái. 22 Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn phân đoạn EtOAc khai triển với hệ dung môi CHCl 3 -MeOH-HCOOH (3 : 0,4 : 0,2) 25 Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn P2 khi quan sát dưới UV 254 và sau khi hiện màu bằng TT vanillin/H 2 SO 4. 28 Hình 3.4 Sắc kí đồ cắn phân đoạn P3 sau khi hiện màu bằng TT vanillin/H 2 SO 4. 28 Hình 3.5 Sơ đồ phân lập V1,V2 31 Hình 3.6 Sắc kí đồ của chất V1 khai triển với các hệ dung môi II, VII, VIII. 32 Hình 3.7 Sắc kí đồ chất V2 khai triển với các hệ dung môi IX, X, XI. 33 Hình 3.8 Sắc kí đồ V1, V2 so với E khai triển với hệ CHCl 3 - MeOH-HCOOH (2 : 0,4 : 0,2) sau khi đã phun TT vanilin/H 2 SO 4 . 33 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của V1 35 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của V2 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là tên thường gọi của một số loài trong chi Gynostemma, họ bầu bí - Cucurbitaceae. Đây là một dược liệu quý có nhóm hoạt chất chính là saponin và flavonoid [44] với nhiều tác dụng nổi bật như làm hạ lipid máu [44], làm hạ đường huyết [40], chống oxy hóa, bảo vệ gan [20], ức chế một số dòng tế bào ung thư [33], [39], [51], Hiện nay, các sản phẩm từ Giảo cổ lam đang trở nên ngày càng phổ biến và được nhiều người sử dụng. Để có cơ sở cho việc sử dụng dược liệu Giảo cổ lam, năm 1997, Giảo cổ lam lần đầu được nghiên cứu tại Việt Nam bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ. Từ đó đến nay đã có thêm nhiều loài Giảo cổ lam được phát hiện. Song song với đó là các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học đã và đang được tiến hành để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm nghiệm dược liệu cũng như chứng minh các tác dụng sinh học của dược liệu trên lâm sàng . Năm 2014, GS.TS Phạm Thanh Kỳ đã thu mẫu Giảo cổ lam tại Yên Bái để tiếp tục nghiên cứu. Qua khảo sát sơ bộ, chúng tôi dự đoán đây là một thứ mới của Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài : “Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái” với 3 mục tiêu: 1. Xác định các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất, xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết từ lá và thân cây Giảo cổ lam nghiên cứu. 3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được. [...]... hái vào năm 2014 tại Yên Bái Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 50-60°C trong tủ sấy Shellab có quạt thông gió Dược liệu sau khi sấy khô được bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát Hình 2.1 Ảnh của GS Phạm Thanh Kỳ về Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái Vì chưa thu được mẫu mang hoa đực, nên chúng tôi chưa thể xác định chính xác tên khoa học của loài Giảo cổ lam nghiên cứu Tuy... thủy tinh các loại 2.2 Nội dung nghiên cứu - Đinh tính các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu - Chiết xuất, xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết từ lá và thân cây Giảo cổ lam nghiên cứu - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu - Định tính sơ bộ các nhóm chất chính theo phương pháp ghi trong tài liệu Phương pháp nghiên... pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang và ứng dụng phương pháp này xác định được hàm lượng saponin toàn phần của 10 mẫu thu c loài G.pentaphyllum thu hái tại các vùng trồng khác nhau ở Việt Nam [16] 1.6.3 Chiết xuất, tinh chế - Chiết xuất: Theo nghiên cứu về phương pháp chiết xuất dược liệu Giảo cổ lam bằng các dung môi hữu cơ, chiết xuất bằng EtOH 70% cho khối lượng... ghi nhận được 14 loài (với 9 loài đặc hữu) [24] Tại Việt Nam đã công bố 4 loài thu c chi Gynostemma là G pentaphyllum (Thumb.) Makino, G laxum (Wall.) Cogn [4], [5], G longipes C.Y.WU [12], [17], G.pedeta Blume [6] 1.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam 1.2.3.1 Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino Tên gọi khác: Cổ yếm, giảo cổ lam, thất diệp đởm [5] Đặc điểm... Pb, Ag Trong đó nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0,0001%) [7] Đặc biệt, đối với nhóm hợp chất chính saponin, đã xây dựng được phương pháp cho phép định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp dấu vân tay trong HPLC [15], định tính được saponin toàn phần của một số loài Giảo cổ lam phương pháp sắc kí lớp mỏng [11] 1.6.2 Định lƣợng - Một số kết quả định lượng... chiết, thêm dung môi EtOH 70% chiết tiếp Chiết liên tục 3 lần, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn Hòa cắn vào nước nóng thu được dịch chiết nước, đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc và n-BuOH, thu được 4 phân đoạn dịch chiết Đem cất thu hồi dung môi được cắn ký hiệu là H, E, B, N Cắn các phân đoạn được đem sấy ở 60°C... chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ hình 3.1 22 Dược liệu EtOH 70% Dc EtOH EtOH thu hồi Cắn Nước nóng Dc nước Cắn H n-hexan Dc n-hexan Dc nước Cắn E Dc EtOAc EtOAc Dc nước Cắn B DC n-BuOH n-BuOH Dc nước Cắn N Hình 3.1 Quy trình chiết các phân đoạn trong lá, thân của cây Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái 23 3.2.1 Định lƣợng cắn các phân đoạn Cân chính xác khoảng 100g bột dược liệu đã xác định độ ẩm Chiết. .. và lá Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái có flavonoid, saponin, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid Trong đó flavonoid và saponin là 2 nhóm chính 3.2 Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất Cân chính xác khoảng 100g dược liệu đã xác định độ ẩm Thấm ẩm dược liệu bằng EtOH 70%, sau đó cho vào bình cầu, đặt lên bếp, lắp sinh hàn, chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% Sau khi sôi 1 giờ, lấy dịch chiết, ... rất rõ Phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat Sử dụng cắn E để tiến hành phân lập 3.3.1 Phân lập lần 1: Phân lập cắn E trên cột sắc ký theo cơ chế hấp phụ, sử dụng chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 63-200µm  Dụng cụ và hóa chất: 27 - Cột sử dụng là ống hình trụ, bằng thủy tinh, chiều dài 75cm, đường kính 4,8cm, đầu dưới có một khóa thủy tinh dùng để điều chỉnh tốc độ dòng chảy - Chất hấp phụ... loại tạp bằng dung môi không phân cực trước khi chiết xuất gần như không ảnh hưởng đến hiệu quả và khả năng chiết xuất của dung môi [13], [14] - Tinh chế saponin từ dịch chiết: Saponin là nhóm chất được quan tâm nhiều nhất trong Giảo cổ lam, đã có một số phương pháp nghiên cứu về việc loại tạp, tinh chế saponin như sau: Phương pháp 1: Loại tạp bằng EtOH tuyệt đối, saponin từ dịch lọc được tinh chế bằng . tài : Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái với 3 mục tiêu: 1. Xác định các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất, xác. Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM HẢI HOA CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn:. TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  PHẠM HẢI HOA CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ