Nghiên cứu đặc điểm thực vật và chiết xuất, phân lập một số hợp chất trong lá và cành nhỏ cây muồng truổng ( Zanthoxylym avicennae, Họ cam (Rutaceae))

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ VÀ CÀNH NHỎ CÂY MUỒNG TRUỔNG Zanthoxylum avicennae, HỌ C

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ NỮ

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ VÀ CÀNH NHỎ

CÂY MUỒNG TRUỔNG

(Zanthoxylum avicennae, HỌ CAM

(Rutaceae)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ NỮ

1401461 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ VÀ CÀNH NHỎ

CÂY MUỒNG TRUỔNG

(Zanthoxylum avicennae, HỌ CAM

(Rutaceae)) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

2 Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Viện Dược liệu

và Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được nhiều sự hướng

dẫn, quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành đến:

TS Hà Vân Oanh, người đã tạo điều kiện, dẫn dắt tôi đến với những ngày đầu

tham gia nghiên cứu, người đã hỗ trợ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

PGS TS Đỗ Thị Hà, người đã tin tưởng giao đề tài, tạo các điều kiện nghiên cứu

thuận lợi, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận

Các chị đang công tác tại Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược Liệu đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, luôn góp ý, động viên, giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Toàn thể các thầy cô, anh chị, bạn bè làm việc, nghiên cứu tại bộ môn Dược học

Cổ truyển và bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện nghiên cứu thuận lợi trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn

ở bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong những lúc khó khăn nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Trần Thị Nữ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Zanthoxylum L .2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum L .2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.2 Tổng quan về loài Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC .5

1.2.1 Đặc điểm thực vật 5

1.2.2 Sinh thái và phân bố 6

1.2.3 Thành phần hóa học 6

1.2.4 Tác dụng dược lý 13

1.2.5 Tính vị, công năng 15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Nguyên liệu nghiên c ứu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đ ặc điểm thực vật 17

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học 17

2.3 Phương pháp nghiên c ứu 17

2.3.1 Phương pháp nghiên c ứu đặc điểm thực vật 17

2.3.2 Phương pháp nghiên c ứu hóa học 18

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Nghiên cứu về thực vật 19

3.1.1 Đặc điểm thực vật 19

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của cành và lá 22

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 24

3.2 Nghiên cứu về hóa học 26

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu 26

3.2.2 Chiết xuất 34

3.3 Bàn luận 43

3.3.1 Về thực vật 43

3.3.2 Về hóa học 43

CHƯƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Z Zanthoxylum

ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang

Bảng 1.2 Một số chất phân lâp được từ các loài thuộc chi Zanthoxylum

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong cành

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang

Hình 1.5 Lignan và dẫn chất phân lập từ Zanthoxylum avicennae 12 Hình 1.6 Một số hợp chất khác phân lập từ Zanthoxylum avicennae 13 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh dưỡng cây Muồng truổng tại

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh sản cây Muồng truổng tại Ba

Hình 3.8 Sắc ký đồ của cao H khai triển với hệ dung môi I và II 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trên thế giới, việc nghiên cứu phân lập, chiết tách các hoạt chất từ thảo

dược để tìm ra thuốc mới ngày càng được quan tâm phát triển Không ít các sản phẩm

thuốc hiện nay có nguồn gốc từ thảo dược, nhiều hợp chất thiên nhiên đã được chứng

minh có tác dụng đột phá trong chữa các bệnh ung thư, tiểu đường, tim mạch…Sử dụng

các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thảo dược để phòng và trị bệnh cũng đang là xu

hướng ở Việt Nam

Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) là cây mọc hoang ở khắp rừng núi ở các

tỉnh thành trên cả nước Nhân dân thường lấy lá cây về nấu ăn, còn dùng chữa đòn ngã,

tổn thương, viêm tuyến vú, nhọt, viêm mủ da; lấy rễ về sao vàng uống để chữa mẩn

ngứa, lở loét, viêm gan vàng da, viêm thận; quả được dùng để chữa đau dạ dày, đau

bụng…[5], [10] Đây là vị thuốc có mặt trong nhiều bài thuốc dân gian Việt Nam, là

một loài cây có nhiều tiềm năng để nghiên cứu và phát triển Ở Ba Vì, người dân địa

phương sử dụng quả của cây làm gia vị

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý

của cây, phát hiện trong cây có nhiều hoạt chất với những hoạt tính sinh học nổi bật như

chống viêm, chống ung thư… [21], [27] Ở Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về

thành phần hóa học đã công bố về loài này như [6], [7], tuy nhiên chưa có nhiều nghiên

cứu chi tiết về đặc điểm thực vật của cây, cũng như chưa có nghiên cứu nào về cây

Muồng truổng tại Ba Vì, mà thành phần hóa học cũng như đặc điểm hình thái của mỗi

loài thực vật không chỉ qui định bởi giống, loài mà còn bởi điều kiện khí hậu, thổ

nhưỡng

Xuất phát từ lý do trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và chiết xuất, phân

lập một số hợp chất trong lá và cành nhỏ cây Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae,

họ Cam (Rutaceae))” được thực hiện với mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi phẫu cành, lá, đặc điểm vi học bột

cành, bột lá và giám định tên khoa học của cây Muồng truổng thu hái tại Ba Vì

2 Định tính các nhóm chất trong lá và cành nhỏ của cây bằng phản ứng hóa học

3 Chiết xuất, phân lập và xác định một số hợp chất từ lá và cành nhỏ của cây

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Zanthoxylum L

1.1.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum L

Zanthoxylum L có vị trí phân loại [45]:

Chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum L.)

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây thường xanh hoặc rụng lá hàng năm, dạng bụi hoặc gỗ nhỏ, thường cao 5-15

m, cá biệt có loài là cây gỗ lớn, cao tới 35 m, mọc thẳng hoặc trườn, leo Vỏ ngoài có nhiều gai nhọn hoặc sần sùi, màu xám hoặc nâu nhạt, vỏ trong có nhiều xơ và thơm Lá kép lông chim lẻ hoặc chẵn, có cuống, không có lá kèm, có 5-21 đôi lá chét, mọc đối hoặc mọc cách, lá chét có mép nguyên hoặc có khía răng cưa Cụm hoa có dạng hình chùm, hình xim hoặc hình chùy (rất ít khi mọc đơn độc) mọc ở nách lá hoặc ở đầu cành Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, bao hoa 6-8 mảnh hoặc 4-5 lá đài, 4-5 cánh tràng Nhị 4-

6, thường thoái hóa ở hoa cái, bầu thượng, 1-5 lá noãn, ở hoa đực bầu và nhụy thoái hóa Quả nang, gồm 1-5 ô rời hoặc dính nhau phía dưới Hạt hình trứng hoặc gần hình cầu, màu đen hoặc đỏ, bóng [13]

Chi Zanthoxylum L gồm khoảng 200 loài, phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt

đới trên thế giới Hầu hết số loài đều phân bố tập trung ở Nam Mỹ Chúng còn phân bố rải rác tại một số khu vực ở miền Bắc Australia và vùng Thái Bình Dương Một số ít có thể phân bố tới các khu vực ôn đới thuộc Đông Á và Bắc Mỹ Trong vùng Đông Nam

Á có khoảng trên 20 loài Ở Trung Quốc có khoảng 41 loài (25 loài đặc hữu) [13], [24]

Tại Việt Nam, có 13 loài thuộc chi Zanthoxylum L được thống kê và mô tả

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Zanthoxylum L tại Việt Nam

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố TLTK

1 Z acanthopodium

Ngọc Linh, Bù Đăng, Langbian

[5], [11]

2 Z armatum DC Sẻn gai Lào Cai [11]

3 Z evodiaefolium

Guillaum

Hoàng mộc phi, Đắng cay ba lá

Khánh Hòa, Lâm Đồng, Nha Trang

[5], [11]

Hòa Bình, Lạng Sơn, Thừa Thiên- Huế và Quảng Nam- Đà Nẵng

[5], [11], [12]

6 Z laetum Drake Hoàng mộc sai Lạng Sơn [11]

7 Z myriacanthum

Wall Ex Hook.f

Hoàng mộc nhiều gai, Sẻn lá to Sa Pa, Ba Vì, Bảo Lộc [11]

8 Z nitidum (Roxb.)

DC

Sang, Sáng láng, Xuyên tiêu, Hoàng lực, Hoa tiêu

Vĩnh Phú, Lào Cai, Bắc Giang, Lạng Sơn, Hà Tĩnh, Hòa Bình, Nghệ

An, Đắc Lắc

[5], [11]

9 Z rhetsa (Roxb.)

DC

Hoàng mộc hôi, Cóc hôi, Vàng me, Sẻn hôi

Biên Hòa, Vĩnh Phú,

10 Z scabrum

11 Z scandens Blume Hoàng mộc leo,

Đắng cay leo

Lạng Sơn, Hà Nội, Cao Bằng, Lào Cai, Ninh Bình, Lâm Đồng

[5], [11]

1.1.3 Thành phần hóa học

Nghiên cứu về mặt hóa học của chi Zanthoxylum L rất nhiều ở cả Việt Nam và

trên thế giới, cho thấy sự đa dạng về mặt hóa học của chi Các nhóm chất chủ yếu trong chi là tinh dầu, alcaloid, coumarin, lignan…

Bảng 1.2 Một số chất phân lâp được từ các loài thuộc chi Zanthoxylum L

STT Nhóm chất Loài Chất phân lập được TLTK

8-methoxychelerythrin, 8‐

hydroxydihydrochelerythrin

[33], [34]

Z rhetsa (Roxb.)

DC

2-(2,4,6-trimethyl 4-quinozolon, rutaecarpin, evodiamin,

heptenyl)-dehydroevodiamin, hydroevodiamin

[14], [29]

Z laetum Drake N-Desmethylchelerythrin,

oxynitidin, nitidin chlorid [35]

Z myriacanthum

Wall Ex Hook.f

Thành phần chính của tinh dầu: limonen (27,2%), ρ-cymen (15,3%) và β-phellandren (11,9%)

[49]

Z armatum DC

Thành phần chính của tinh dầu: α-pinen (4,5%), sabinen (4,6%), limonen (5,6%) và β-phellandren (12,7%)

STT Nhóm chất Loài Chất phân lập được TLTK

Z avicennae

(Lam.) DC

Scoparon, scopoletin, luvangetin, avicennin, avicennol

[16], [28]

Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC., tên gọi khác là Fagara avicennae Lam., tên

thường gọi là Muồng truổng, Sen lai, Màn tàn, Hoàng mộc dài, Buồn chuồn [5]

Cây chủ yếu là cây gỗ nhỏ, cũng có những cây gỗ to cao đến 8 m, thân có mang nhiều gai lởm chởm, vỏ màu vàng sáng Cành cũng mang nhiều gai thẳng đứng và ngắn [5], [12] Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, có 3-11 đôi lá chét hình mác Lá chét dài 3,5-

5 cm, rộng 1,3-2,5 cm, gốc và đầu lá thuôn, gốc hơi lệch, mép nguyên hay hơi có răng, phiến lá có nhiều túi tinh dầu nhỏ [10] Lá có 8-13 đôi gân bên rất nhỏ, lồi ở mặt dưới [8] Cuống lá hình trụ, có khi kèm theo đôi cánh nhỏ [12] Cụm hoa hình tán kép mọc ở ngọn cành, dài hơn lá Hoa màu trắng nhạt, đơn tính khác gốc Đài 5 răng rất nhỏ, tràng

5 cánh mỏng, hoa đực có 5 nhị, bầu lép, hoa cái không có nhị, bầu 2-3 lá noãn [10] Cuống quả 3–6 mm, quả nang màu đỏ tía nhạt, đường kính 4-5 mm, tuyến dầu nhiều, lớn và hơi nhô ra, đỉnh không nhọn Quả có 1-3 mảnh vỏ, lớp trong không tách rời khỏi lớp ngoài, mỗi ngăn chứa một hạt màu đen Hạt đường kính 3,4-4,5 mm [8], [24] Cây ra hoa vào mùa xuân hè (tháng 6-7), có quả vào mùa hè thu (tháng 9-11) [10], [13]

1.2.2 Sinh thái và phân bố

Muồng truổng là cây ưa sáng, thích nghi với khí hậu nóng ẩm, thường mọc lẫn trong quần thể cây bụi ở đồi, đất sau nương rẫy, ven rừng Cây sống trên nhiều loại đất,

kể cả đất nghèo kiệt Ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt [10] Trên thế giới, Muồng truổng phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Việt Nam, Lào và Campuchia [5], [10] Ở nước ta, cây mọc ở vùng trung du và núi thấp, độ cao 300-1000

m ở nhiều tỉnh trong cả nước [10] Cây mọc hoang ở vùng rừng núi các tỉnh miền Bắc nước ta, có mọc cả ở miển Nam; từ Hòa Bình, Lạng Sơn tới Thừa Thiên- Huế và Quảng Nam- Đà Nẵng [5], [12]

1.2.3 Thành phần hóa học

Cây Z avicennae có thành phần hóa học rất đa dạng Dựa theo các tài liệu đã được

công bố, trong cây có các thành phần: coumarin, alcaloid, flavonoid, tinh dầu, lignan và một số hợp chất khác

1.2.3.1 Coumarin

Coumarin là một trong những hợp chất phổ biến được phân lập từ loài Zanthoxylum

avicennae

Năm 1959, avicennin (1) đã được phân lập từ vỏ rễ của cây [16], và năm 1960 đã

phân lập được từ vỏ cây [17] Năm 1975, Gray và cộng sự đã phân lập được

pyranocoumarin mới là avicennol (2) từ vỏ rễ của cây [30]

Năm 2008, Chen Jih-Jung và cộng sự đã phân lập từ gỗ của thân cây Zanthoxylum

avicennae các coumarin là: aesculetin dimethyl ether (3), scopoletin (4),

6,7,8-trimethoxycoumarin (5), luvangetin (6), avicennol (2) [19] Năm 2015, ông và cộng sự

tiếp tục phân lập từ vỏ thân của Z avicennae được ba coumarin mới, gồm:

8-formylalloxanthoxyletin (7); (E)-avicennon (8); (Z)-avicennon (9), cùng với alloxanthoxyletin (10) là coumarin lần đầu tiên được phân lập từ cây này [20]

Ngoài các coumarin đã được công bố trước đó như: 50-Hydroxyaurapten (11);

schinilenol (13); methylschinilenol (14), năm coumarin mới bao gồm methoxyaurapten (15); 6,50-dimethoxyaurapten (16); 50-methoxycollinin (17); 7- ((20E, 50E) -70 methoxy-30,70-dimethylocta- 20,50-dien) coumarin (18) và 6-

50-methoxy-7-((20E, 50E)-70-methoxy-30,70-dimethylocta-20,50 dienyloxy) coumarin

(19), đã được Cho Jui-Ying và cộng sự phân lập từ lá của Z avicennae [21]

Năm 2014, xanthoxyletin (20) lần đầu được chiết xuất từ vỏ và rễ của cây bởi Guo

Tao và cộng sự [31] và năm 2015 cũng đã được phân lập được từ vỏ thân của cây bởi Chen Jih-Jung và cộng sự [20]

Ở Việt Nam, năm 2005, braylin (21) lần đầu được tìm thấy trong cây Z avicennae,

được phân lập từ rễ cây ở Nghệ An bởi Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự [6] Năm 2008,

nhóm của họ tiếp tục phân lập được các coumarin khác là scoparon (22), scopoletin (4), luvangetin (6), avicennin (1), avicennol (2) Các hợp chất này lần đầu tìm thấy trong cây

Muồng truổng ở Việt Nam [7]

Z avicennae bởi Cho Jui-Ying và cộng sự năm 2012 [21]

Năm 2014, Guo Tao phân lập được các alcaloid norchelerythrin (36), chelerythrin (24), dictamin (30), γ-fagarin (29) và skimmianin (31) từ dịch chiết EtOAc của rễ và

thân Z avicennae, trong đó norchelerythrin (36) là chất lần đầu được phân lập từ cây này [31] Norchelerythrin (36) cũng được phân lập từ vỏ thân Z avicennae năm 2015

bởi Chen Jih-Jung và cộng sự, cùng với arnottianamid (37) là alcaloid lần đầu được phân

lập từ cây [20]

Ở Việt Nam, năm 1999, Trịnh Thị Thủy và cộng sự đã phân lập từ lá cây Z

avicennae được bảy hợp chất thuộc khung bishordeninyl terpenenalcaloids, ngoài

(-)-culantraramin (38) và (-)-(-)-culantraraminol (39) là hai chất đã đươc phân lập trước đó, còn có thêm 5 chất mới là: (-)-culantraramin N-oxid (40) (41), (-)-culantraraminol N- oxid (42) (43) và avicennamin (44) [47]

38-44:

Hình 1.2 Một số alcaloid phân lập từ Zanthoxylum avicennae

1.2.3.3 Flavonoid

Các flavonoid đã được phân lập từ lá cây Z avicennae là hesperidin (45) [16],

diosmetin (46), apigenin (47) [28] Hỗn hợp gồm hesperidin (45), diosmin (48) được

phân lập từ vỏ rễ cây [16]

Hình 1.3 Một số flavonoid phân lập từ Zanthoxylum avicennae

1.2.3.4 Tinh dầu

Trong vỏ thân, lá và quả của Z avicennae đều chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu

trong lá chỉ khoảng 0,3 %, còn trong quả thường đạt tới 2-4 % [13]

Liu Xin Chao và cộng sự đã xác định tổng cộng có 31 thành phần trong tinh dầu

lá và thân của Z avicennae ở vùng Vân Nam, Trung Quốc Tinh dầu có hàm lượng

monoterpenoid cao hơn (65,70 %) so với sesquiterpenoid (33,45 %) Các hợp chất chính

của tinh dầu là 1,8-cineol (49), β-elemen (50), α-caryophyllen (51), β-caryophyllen (52)

và caryophyllen oxid (53) [41]

Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu trong lá Z avicennae ở Việt Nam, hơn

80 hợp chất được phát hiện, trong đó có 53 thành phần (tổng cộng khoảng 87%) có thể được xác định Monoterpen chiếm tới 44,3% tổng lượng tinh dầu Trong đó,

hydrocarbon pinen (54), β-phellandren (55), γ- terpinen (56), (E)-β-ocimen (57) và terpinen (58) được xác định là các thành phần chính Mười lăm sesquiterpen

α-hydrocarbon và alcol đã được xác định, chiếm tới 40,75 % tổng lượng dầu, với thành

phần chính là β-caryophyllen (52) và α-humulen (51) [22]

Một nghiên cứu khác năm 2016 phân tích thành phần tinh dầu của lá, hoa và quả

của Z avicennae ở Việt Nam cho thấy các hợp chất chính trong tất cả các mẫu tinh dầu

là α-pinen (54), limonen (59), (E)- β-ocimen (57) và β-caryophyllen (52) Trong đó

sesquiterpen hydrocarbon là thành phần chính trong tinh dầu lá, với các chất đại diện là

(E)-β-farnesen (60), β-elemen (50), β-caryophyllen (52) và α-humulen (51) [48]

Năm 2008, Chen Jih-Jung và cộng sự đã phân lập từ gỗ của thân cây Z avicennae

tám hợp chất mới, bao gồm bốn neolignan mới: (7′S, 8′S)-bilagrewin (61), demethoxybilagrewin (62), (7′S,8′S)-5-O-demethyl-4′-O-methylbilagrewin (63) và (7′S,8′S)-nocomtal (64), một coumarinolignan mới: (7′S,8′S)-4′-O-methylcleomiscosin

(7′S,8′S)-5-D (65), hai dẫn xuất lignan mới: (+)-9′-O-(Z)-feruloyl-5,5′-dimethoxylariciresinol (66)

Ngoài các nhóm chất trên, một số nhóm chất khác cũng được phân lập từ Z

avicennae là các acid hữu cơ, ester, chromen, triterpenoid…bao gồm methyl

(E)-p-hydroxycinnamat (70), p-hydroxybenzoic acid (71), benzoic acid (72), pentylquinolin-4(1H)-on (73), indol-3-carboxylic acid (74), loliolid (75), methyl 4-

1-methyl-2-hydroxybenzoat (76) [21], (E)-3-(2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl) prop-2-enal (77) [19], β-amyrin (78) [20]

Hình 1.6 Một số hợp chất khác phân lập từ Zanthoxylum avicennae

1.2.4 Tác dụng dược lý

Sự đa dạng các nhóm chất có họat tính sinh học khiến cho Z avicennae có nhiều

tác dụng dược lý quan trọng, có tính ứng dụng cao

1.2.4.1 Tác dụng kháng nấm

Kết quả thí nghiệm trong tài liệu [40] cho thấy tinh dầu trong Z avicennae có tác dụng ức chế rõ ràng đối với tám loại nấm gây bệnh thực vật: Botrytis cinereal,

Exerohilum turcicum, Rhizoctonia solani AG1 ‐IA, Fusarium graminearum, Sclerotinia

sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium graminearum

Schwabe Trong đó, hoạt tính kháng nấm đối với Rhizoctonia solani AGI-IA là mạnh nhất, với giá trị MIC 0,195 µL/mL; hoạt tính kháng nấm đối với Botrytis cinerea tương

đối yếu, với giá trị MIC 100 µL/mL

Một tài liệu năm 2015 do Zheng N.N và cộng sự công bố cho thấy scoparon phân

lập từ dịch chiết EtOAc và n-BuOH của Z avicennae có hoạt tính kháng nấm mạnh đối

với Exserohilum turcicum Pass và Fusarium graminearum Schwabe, với giá trị MIC là

15,63 μg/mL [52]

1.2.4.2 Tác dụng chống viêm

Các loại gốc tự do (ROS) [ví dụ, superoxid anion (O2.-), hydro peroxid] và protease dạng hạt (ví dụ, elastase, cathepsin G) được tạo ra bởi bạch cầu trung tính ở người là một trong những tác nhân gây viêm trong các bệnh viêm nhiễm Kết quả của các thí nghiệm chống viêm chỉ ra có 9 hợp chất ức chế đáng kể việc tạo ra O2.- và/hoặc giải phóng elastase do fMLP của bạch cầu trung tính gây ra Trong đó, diosmetin và methyl 4-hydroxybenzoat có hiệu quả chống lại việc tạo ra O2.- và giải phóng elastase cao nhất, với các giá trị IC50 lần lượt là 2,79 ± 0,30 và 4,22 ± 1,04 µg/ml [21]

Dựa trên kết quả xét nghiệm sinh học trong tài liệu [20], các chất xanthoxyletin, alloxanthoxyletin và 8-formylalloxanthoxyletin phân lập từ vỏ thân chống lại sự tạo ra anion superoxid do fMLP gây ra hiệu quả nhất, với các giá trị IC50 tương ứng là 1,47 ± 0,41; 1,47 ± 0,53; và 4,60 ± 0,83 µg/mL 8-formylalloxanthoxyletin, alloxanthoxyletin

và xanthoxyletin cũng thể hiện tác dụng ức chế giải phóng elastase do fMLP gây ra hiệu quả nhất trong số các chất phân lập, với các giá trị IC50 là 2,59 ± 0,52, 3,43 ± 0,63 và 4,18 ± 0,73 g/mL

Hai nghiên cứu trên đều cho thấy Z avicennae và các chất phân lập có tiềm năng

để điều trị và phòng ngừa các bệnh viêm khác nhau

1.2.4.3 Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu của Li Xi Feng và cộng sự về hoạt động chống oxy hóa của

Zanthoxylum avicennae trong ống nghiệm, sử dụng ba phương pháp DPPH, ABTS và

FRAP chỉ ra rằng các dịch chiết Zanthoxylum avicennae đều có tính khử, trong đó dịch

chiết M40 có tính khử mạnh nhất chống lại các gốc tự do DPPH và ABTS và giảm độ mạnh của Fe3+, trong khi dịch chiết ethanol khử yếu nhất [38]

1.2.4.4 Tác dụng chống ung thư

Năm 2011, các thử nghiệm in vivo và in vitro của Trần Đức Dũng và cộng sự đã

cho thấy chiết xuất từ vỏ rễ cây trong cồn 95o thúc đẩy đáng kể quá trình apoptosis HA22T và giảm kích thước khối u ở chuột nude xenograft thông qua hoạt hóa protein phosphatase 2A theo cách phụ thuộc vào liều [26] Nghiên cứu tiếp theo của họ vào năm

2012 chứng minh rằng chiết xuất Z avicennae ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua hoạt hóa protein phosphatase 2A trong tế bào ung thư gan người HA22T [25] Z avicennae

cũng thể hiện tác dụng chống ung thư bằng cách điều chỉnh con đường truyền tín hiệu Wnt/ β-catenin thông qua thúc đẩy sự thoái hóa của β-catenin và hoạt hóa phosphatase 2A, cho thấy đây là một loại thuốc tiềm năng chống ung thư gan di căn [27]

Tinh dầu của Z avicennae cũng thể hiện hoạt động chống ung thư mạnh mẽ, chống

lại các khối u ở dòng tế bào ung thư K-562 với IC50 là 1,76 µg/mL [51]

1.2.5 Tính vị, công năng

Muồng truổng có vị đắng, cay, tính hơi ấm, có tác dụng khử phong lợi thấp, hoạt huyết chỉ thống, hành khí, lợi thủy [5], [8] Đây là vị thuốc được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian Việt Nam Các bài thuốc phổ biến là:

1 Viêm gạn mạn tính: Rễ Muồng truổng, Cỏ ban, Nhân trần hao, Bòi ngòi bò, mỗi vị 15

mg, sắc nước uống [5], [10]

2 Đau nhức xương khớp, đòn ngã: Rễ Muồng truổng 30-60 g, sắc uống [5] hoặc: Muồng

truổng, Hy thiêm, Phòng kỷ hay Hoàng kỷ, Mộc thông hoa, Thổ phục linh, mỗi vị 20 g sắc uống [8], [10]

3 Chữa mẩn ngứa, lở loét, chảy nước, dị ứng: vỏ Muồng truổng, Ké đầu ngựa, Kim

ngân rừng mỗi vị 15-20 g, sắc uống Ngoài dùng vỏ cây Muồng truổng, nấu nước tắm [8]

4 Đau dạ dày: quả khô 8 g sắc uống [8]

5 Đau nhức răng: Vỏ rễ Muồng truổng, rửa sạch, nhai ngậm rồi nhổ bỏ Hoặc băm nhỏ,

ngâm với rượu từ ba ngày trở lên, khi đau răng thì ngậm rồi nhổ bỏ [10]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

+ Nơi thu hái: Ba Vì

+ Thời điểm thu hái: Từ tháng 7/2018 đến tháng 11/2018

− Nguyên liệu gồm:

+ Các mẫu gồm cành mang lá, hoa và quả tươi làm nguyên liệu nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học

+ Cành và lá tươi được ngâm trong cồn 70% để cắt vi phẫu

+ Cành nhỏ (đường kính ≤ 3 cm) và lá cây là phần nguyên liệu dễ dàng thu hái với khối lượng lớn, được lựa chọn làm nguyên liệu nghiên cứu về mặt hóa học: được làm nhỏ, sấy khô ở 55oC, bảo quản trong túi nilong kín

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Dụng cụ, thiết bị

− Tủ sấy Binder-FD115

− Máy cắt vi phẫu cầm tay, dao, bộ dụng cụ nhuộm tiêu bản

− Các dụng cụ thí nghiệm: cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm, đũa thủy tinh, pipet, bình gạn, phiến kính, lam kính…

− Kính hiển vi quang học Leica DM 1000

− Kính hiển vi Nikon Esclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

− Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

− Máy cô quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi)

− Đèn tử ngoại CAMAG

− Bản mỏng DC-Alufolien 60G F254 (Merck)

− Cột sắc ký dùng chất hấp phụ là silicagel F254 cỡ hạt 0,04-0,063mm (Merck)

− Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C

− Máy ảnh Canon 400D

− Máy đo nhiệt độ nóng chảy Melting Point M-560 (Buchi)

− Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz (Viện Hóa học)

2.1.2.2 Hóa chất, dung môi:

− Dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: javel, cloralhydrat, acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn

− Dùng trong định tính các thành phần hóa học: TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT Diazo mới pha, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 5%, TT Lugol, dung dịch natri nitroprussiat, TT ninhydrin 3%, ethanol 90%, acid acetic, acid formic…

− Dùng trong phân lập các hợp chất: n- hexan, ethyl acetat (EtOAc), aceton, methanol,

ethanol, diclomethan

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

− Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Muồng truổng thu hái ở Ba Vì

− Giám định tên khoa học của mẫu

− Mô tả đặc điểm vi học của mẫu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu hóa học

− Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong lá và cành nhỏ cây Muồng truổng bằng các phản ứng hóa học

− Phân lập một số hợp chất hóa học từ phân đoạn n-hexan của lá và cành nhỏ bằng

phương pháp sắc ký cột

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Mô tả hình thái thực vật và xác định tên khoa học

Quan sát, chụp hình, mô tả đặc điểm hình thái cây Muồng truổng bằng phương pháp mô tả phân tích dựa theo tài liệu Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc [4] Các mẫu cây sau khi thu thập được xử lý và làm tiêu bản Đối chiếu đặc điểm hình thái của mẫu cây với các tài liệu phân loại thực vật:

− Từ điển cây thuốc Việt Nam [5]

− Thực vật chí Trung Quốc [24]

Kết hợp với chuyên gia giám định tên khoa học của cây Tiêu bản mẫu sau khi giám định tên khoa học được đưa vào lưu trữ tại Viện dược liệu

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học:

− Cắt vi phẫu bằng dao và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [4]

− Cành và lá khô xay nhỏ, rây qua rây 180

− Quan sát cấu tạo vi phẫu cành, lá và đặc điểm bột cành, bột lá bằng kính hiển vi, chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu ở cành và lá Muồng truổng

Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [2], [3]

2.3.2.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các chất phân lập được

Phương pháp chiết xuất

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngâm, sử dụng dung môi ethanol 90% ba lần, mỗi lần 3 ngày, tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1/5 (m/v) Dịch chiết ethanol được gộp lại, cất thu hồi dung môi thu được cao tổng

Cao tổng được hòa lại với 1 lít nước nóng, chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung

môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc Dịch chiết các phân đoạn được cất thu

hồi dung môi, dịch chiết nước còn lại cô cách thủy ở nhiệt độ 80oC, thu được các cao

phân đoạn tương ứng: cao n-hexan (cao H), cao EtOAc (cao E), cao nước (cao W)

Phương pháp phân lập

− Khảo sát hệ dung môi thích hợp để triển khai sắc ký cột cho phân đoạn n-hexan bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng

− Tiến hành phân lập một số chất có trong phân đoạn n-hexan bằng phương pháp sắc

ký cột, tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường, theo dõi các phân đoạn sắc ký bằng sắc ký lớp mỏng

− Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60G F254 (Merck) Theo dõi sắc ký đồ bằng đèn tử ngoại ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol 96%, to

Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, nhiệt

độ nóng chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và so sánh các

dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây gỗ nhỏ cao 2-4 m, thân mang nhiều gai thẳng đứng, dài 0,3-1,0 cm, có ụ gai, vỏ thân xù xì, màu vàng xám Cành nhẵn, cũng mang gai nhưng thưa hơn Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, có 5-25 lá chét mọc đối Lá chét hình mác, dài 1,8-6,7 cm, rộng 1,1-2,2 cm, mặt trên xanh sẫm, nhẵn bóng, mặt dưới xanh nhạt Chóp lá từ nhọn đến tù, mép

lá hơi khía tai bèo, gốc lá thuôn, gốc lá chét tận cùng cân, gốc các lá chét bên hơi lệch, phiến lá có nhiều túi tinh dầu có thể quan sát rõ ở mặt dưới Gân lá hình lông chim, có 5-10 cặp gân phụ nghiêng một góc 60-65o so với gân chính, lồi ở mặt dưới Trục lá hình trụ, có cánh ngắn, cuống lá kép dài 2,7-3,5 cm, hơi phình ở phần dưới

Cụm hoa dạng tán kép mọc ở ngọn cành, dài 13-17 cm Cuống hoa hình trụ, cuống hoa cái dài 4mm, cuống hoa đực dài 1,5 mm Hoa nhỏ, đều, đơn tính khác gốc, mẫu 5, bao hoa phân hóa đài tràng Đài 5 mảnh nhỏ màu xanh hình tam giác cân, rộng 1 mm, cao 0,25 mm Tràng 5 cánh rời hình trứng, khum như vỏ sò, sắp xếp xen kẽ với lá đài Hoa cái gồm năm cánh màu trắng dài 2,5 mm Bộ nhị gồm năm nhị lép dạng vảy nhỏ màu trắng Bộ nhụy do 2-3 lá noãn tạo thành bầu trên, mỗi lá noãn tạo thành một ô, đính nhau ở gốc và rời nhau ở trên, mỗi ô có hai noãn, đính noãn trung trụ Bầu màu xanh bóng, cao 2 mm, đường kính một ô bầu là 1,0-1,5 mm, trên bầu nhiều túi tiết tinh dầu dạng đốm tròn nhỏ Vòi và núm nhụy rời, vòi nhụy ngắn, núm nhụy dạng đầu, có gai thịt tiết chất dính

Hoa đực gồm năm cánh màu trắng xanh, dài 2,0 mm Bộ nhị gồm năm nhị thò sắp xếp xen kẽ với cánh hoa, chỉ nhị hình sợi màu trắng trong dài 2,5-2,7 mm, bao phấn hai

ô hình thận xếp song song, dài 0,7-1,0 mm, nứt dọc, hướng trong, đính lưng Bộ nhụy thoái hóa, gồm bầu trên lép, màu trắng, hình mác xẻ hai thùy, bên trong không có noãn Quả vẫn còn dấu tích tràng hoa còn sót lại, có 1-3 ô hình trứng dính nhau ở phía dưới, dài 6,5 mm, rộng 5 mm, mỗi ô chứa một hạt, bên cạnh có thể có ô lép nhỏ hơn và không mang hạt do noãn không được thụ tinh Vỏ quả ngoài có tuyến tinh dầu nhiều, hình tròn và hơi nhô ra, khi quả chín vỏ chuyển sang màu đỏ tía Vỏ quả trong màu trắng, dính liền với vỏ quả ngoài Quả nang cắt vách, tự mở theo đường hàn liền của mép lá noãn ở phía trên đỉnh quả Hạt sau khi ra khỏi các ô vẫn gắn ở mép vỏ quả và nằm trên đỉnh quả

Hạt hình trứng, hơi nhọn hai đầu, dài 4,5-5,0 mm, rộng 3,0-3,5 mm, vỏ hạt nhẵn bóng, màu đỏ sẫm hoặc đen

Ảnh chụp mẫu nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.1 và Hình 3.2

Đối chiếu với đặc điểm mô tả trong các tài liệu phân loại thực vật [5], [24], đồng thời được giám định bởi Ths Nguyễn Văn Hiếu ở Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện

Dược liệu, mẫu nghiên cứu nói trên được xác định tên khoa học là Zanthoxylum

avicennae (Lam.) DC., thuộc họ Cam (Rutaceae) Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản của

Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu với số hiệu: DL-300718 (Phụ lục I)

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh dưỡng cây Muồng truổng tại Ba Vì

1 Cây ở thực địa; 2 Thân cây; 3 Cành non; 4 Lá; 5 Trục lá, 6 Lá chét

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái cơ quan sinh sản cây Muồng truổng tại Ba Vì

1 Cành mang hoa cái; 2, 3, 4 Một phần của tán hoa cái; 5, 8 Hoa cái; 6 Hoa cái

cắt dọc; 7 Đài, bầu và nhị lép trên đế hoa; 9 Bầu cắt ngang; 10 Cành mang hoa

đực; 11,12 Một phần của tán hoa đực; 13 Hoa đực; 14 Hoa đực cắt dọc; 15 Đài

và bầu lép trên đế hoa; 16 Nhị hoa; 17 Cánh hoa cái; 18 Đài và cuống hoa cái; 19 Cánh hoa đực; 20 Đài và cuống hoa đực; 21 Sự phát triển của quả; 22 Hạt; 23 Một ô quả cắt ngang; 24 Một ô quả cắt dọc; 25 Vỏ quả ngoài, vỏ quả trong và hạt;

26 Các dạng quả

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của cành và lá

3.1.2.1 Đặc điểm giải phẫu cành

Mặt cắt cành non có thiết diện tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì (1) gồm một hàng tế bào nhỏ hình chữ nhật, thành ngoài phủ lớp cutin mỏng Mô mềm vỏ (4) cấu tạo

từ những tế bào hình tròn hoặc bầu dục, kích thước không đều nhau, những tế bào ở ngoài gần biểu bì kích thước nhỏ hơn, các tế bào gần trụ bì kích thước lớn hơn Túi tiết

tinh dầu (2) kích thước lớn nằm rải rác trong mô mềm vỏ, thường nằm sát dưới biểu bì Libe cấp 2 (5) gồm những tế bào nhỏ, xếp thành từng cụm không liên tục Gỗ cấp 2 (6)

có nhiều mạch gỗ hình tròn, xếp thành dãy 2-4 mạch Tầng phát sinh libe-gỗ nằm giữa libe và gỗ, gồm 3-4 lớp tế bào hình chữ nhật dẹt Mô mềm ruột cấu tạo từ các tế bào

kích thước rất lớn, hình đa giác, thành mỏng (7) Tinh thể calci oxalat (3) nằm rải rác

trong mô mềm vỏ và mô mềm ruột

Hình ảnh vi phẫu cành cây Muồng truổng được trình bày ở Hình 3.3

3.1.2.2 Đặc điểm giải phẫu lá

Quan sát mặt cắt ngang vuông góc qua phần gân chính của lá cây Muồng truổng qua kính hiển vi

Phần gân chính : Mặt trên lõm ít, mặt dưới lồi Biểu bì trên (2) và biểu bì dưới (10)

gồm 1 lớp tế bào nhỏ hình đa giác kích thước không đều nhau, thành ngoài phủ lớp cutin

dày Mô dày góc trên và dưới (3) gồm nhiều tế bào hình đa giác, xếp thành 1-2 lớp tế bào xếp sát biểu bì Mô mềm (4) gồm các tế bào vách khá dày, hình tròn hay đa giác, kích thước không đều, rải rác trong mô mềm có túi tiết tinh dầu (9) và các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (8) Trụ bì gồm 3-5 lớp tế bào hóa mô cứng (6) tạo thành vòng không

liên tục bao ngoài bó libe-gỗ Bó libe-gỗ của gân chính là một cung libe-gỗ lớn, mặt lõm

hướng lên trên, lần lượt gồm vòng libe (5) phía trên, vòng gỗ (10), vòng libe (5) phía

dưới Vòng gỗ lớn gồm các mạch gỗ hình tròn, xếp thành dãy 3-6 mạch, sợi gỗ nhiều, chính giữa vòng gỗ là bó mạch gồm nhiều mạch gỗ kích thước lớn

Phần phiến lá : Tế bào biểu bì trên (12) to, hình bầu dục dẹt, tế bào biểu bì dưới (17) nhỏ hơn, hình chữ nhật Kích thước tế bào biểu bì ở phần phiến lá lơn hơn nhiều so với biểu bì phần gân lá Biểu bì dưới rải rác có lỗ khí (15) Mô giậu (14) gồm 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với biểu bì trên Mô khuyết (16) nằm ngay dưới mô

giậu, gồm những tế bào kích thước không đều, sắp xếp lỏng lẻo tạo các gian bào lớn,

bên trong rải rác các bó sợi (11) và mảnh mạch Tinh thể calci oxalat (13) nằm rải rác

trong mô giậu và mô khuyết

Ảnh chụp vi phẫu lá cây Muồng truổng được trình bày ở Hình 3.4

Hình 3.3 Vi phẫu cành Muồng truổng

1 Biểu bì; 2 Túi tiết tinh dầu; 3 Tinh thể calci oxalat; 4 Mô mềm vỏ; 5 Libe; 6

Gỗ; 7 Mô mềm ruột

Hình 3.4 Vi phẫu lá Muồng truổng

A Vi phẫu gân lá : 1 Bó gỗ gân phụ; 2 Biểu bì trên; 3 Mô dày; 4 Mô mềm, 5

Libe; 6 Trụ bì hóa mô cứng; 7 Gỗ; 8 Tinh thể calci oxalat; 9 Túi tiết tinh

dầu; 10 Biểu bì dưới

B Vi phẫu phiến lá : 11 Bó sợi; 12 Biểu bì trên; 13 Tinh thể calci oxalat; 14 Mô

giậu; 15 Lỗ khí; 16 Mô khuyết; 17 Biểu bì dưới

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu

những tế bào dài, thành dày, có khoang hẹp hoặc rộng Mảnh mang màu (6) Các mảnh mạch gồm có mảnh mạch mạng, mạch vạch (8), mạch điểm (9) và mạch xoắn (10) Tinh thể calci oxalat (7) hình khối hoặc hình cầu gai Hạt tinh bột (11) hình tròn hoặc hình đa

giác, có rốn hạt hình sao

3.1.3.2 Đặc điểm bột lá

Bột lá màu xanh lục, mùi thơm, vị hơi đắng, quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.6) thấy có các đặc điểm: Mảnh biểu bì phiến lá (1) có các tế bào vách uốn lượn, có lỗ khí kiểu hỗn bào Mảnh biểu bì gân lá (2) có các tế bào đa giác dài Mảnh mô giậu (3) với các tế bào hình trụ nằm ngay dưới biểu bì trên của phiến lá Mảnh mô mềm (4, 8) mang tinh thể calci oxalat hình khối, lục lạp và mảnh mạch xoắn Mảnh mạch vạch (5) và mạch điểm (6) Bó sợi (7) Các tinh thể calci oxalat (9) hình cầu gai hoặc hình khối Hạt tinh bột (10) hình tròn, hình đa giác hoặc hình giọt nước, có rốn hạt hình sao

Hình 3.5 Đặc điểm bột cành

1 Mảnh biểu bì; 2 Mảnh bần; 3 Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat; 4, 5 Sợi;

6 Mảnh mang màu; 7 Tinh thể calci oxalat; 8, 9, 10 Mảnh mạch; 11 Hạt tinh bột

Hình 3.6 Đặc điểm bột lá

1 Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2 Mảnh biểu bì gân lá; 3 Mảnh mô giậu; 4,8 Mảnh mô

mềm; 5,6 Mảnh mạch; 7 Bó sợi; 9 Tinh thể calci oxalat; 10 Hạt tinh bột

3.2 Nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong dược liệu

Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, phytosterol

Kết quả: Phản ứng dương tính

Từ kết quả trên, kết luận sơ bộ: Dược liệu chứa phytosterol

3.2.1.4 Định tính alcaloid

Cho khoảng 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml để làm các phản ứng sau:

− Ống 1: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng hoặc vàng nhạt

− Ống 2: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa nâu

− Ống 3: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa vàng cam đến đỏ

Kết quả: Phản ứng dương tính ở cả ba ống nghiệm

Từ các kết quả trên, kết luận sơ bộ: Dược liệu chứa alcaloid

3.2.1.5 Định tính saponin

− Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm 5

ml nước cất Bịt miệng ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

Kết quả: Phản ứng dương tính

− Phản ứng Salkowski:

Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml ethanol 90o, đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa tan một ít cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml cloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách

Kết quả: Phản ứng dương tính

Từ các kết quả trên, kết luận sơ bộ: Dược liệu chứa saponin

3.2.1.6 Định tính anthranoid

Lấy 3 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml dung dịch

H2SO4 10% Đun cách thủy sôi trong vòng 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5 ml cloroform Gạn lớp cloroform để làm phản ứng (các hợp chất anthranoid khi tác dụng với kiềm sẽ tạo ra các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước) Cho vào hai ống nghiệm:

− Ống 1: 1 ml dịch chiết cloroform + 1 ml dung dịch NH4OH 10%

− Ống 2: 1 ml cloroform + 1 ml dung dịch NaOH 10%

Lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ sim tan trong nước

Từ các kết quả trên, sơ bộ kết luận: dược liệu không chứa tanin

3.2.1.8 Định tính glycosid tim

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24h Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1 ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với cloroform (3 lần, mỗi lần 5 ml), gạn lấy lớp cloroform vào cốc có mỏ khô sạch Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:

− Phản ứng Liebermann-Burchardt: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1 ml

anhydrid acetic, lắc đều Nghiêng ống 45o cho từ từ theo thành ống 1 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá thì phản ứng dương tính

Kết quả: Phản ứng dương tính

− Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1 ml ethanol 90%,

lắc đều, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và

9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

Kết quả: Phản ứng âm tính

− Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong 0,5 ml ethanol 90%, lắc kỹ Nhỏ 1 giọt thuốc

thử Natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính

Kết quả: Phản ứng âm tính

− Phản ứng Keller-Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol

90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vào giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ

Kết quả: Phản ứng dương tính

Từ các kết quả trên, kết luận sơ bộ: Dược liệu không chứa glycosid tim

3.2.1.9 Định tính flavonoid

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml ethanol 90o, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dung dich lọc để làm phản ứng

− Phản ứng với kiềm:

+ Phản ứng với NH3: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, quan sát dưới ánh sáng thường thấy có màu vàng, sau đó hơ trên miệng lọ ammoniac đặc màu vàng

tăng thêm thì dương tính

Kết quả: Phản ứng âm tính

+ Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 5 giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm

Kết quả: Phản ứng dương tính

− Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi

kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc Phản ứng dương tính khi dung

dịch chuyển màu đỏ cam

Kết quả: Phản ứng âm tính

− Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa màu xanh

đen

Kết quả: Phản ứng âm tính

− Phản ứng diazo hóa: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng NaOH

10% Thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút Phản ứng

dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch