Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần tinh dầu của cây riềng dài lông mép ( Alpinia blepharocalyx K.Schum.var.Blepharocalyx), Họ gừng ( Zingiberaceae)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ PHƯƠNG LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN TINH DẦU CỦA CÂY RIỀNG DÀI LÔNG MÉP (Alpinia blepharocalyx K Schum var blepharocalyx), HỌ GỪNG (Zingiberaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ PHƯƠNG LOAN 1401379 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN TINH DẦU CỦA CÂY RIỀNG DÀI LÔNG MÉP (Alpinia blepharocalyx K Schum var blepharocalyx), HỌ GỪNG (Zingiberaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Hồng Tuấn Nơi thực hiện: Bộ mơn Dược liệu HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ, bảo tận tình thầy cơ, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, với tất lòng biết ơn kính trọng, tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy tận tụy truyền cho nhiệt huyết trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Thanh Tùng, DS Nguyễn Văn Phương toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn chú, bác Bảo tàng tài nguyên rừng Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Xin cảm ơn toàn thể anh chị, bạn nghiên cứu Bộ môn Dược liệu động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Bộ môn Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn vơ sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè bên cạnh, động viên, giúp đỡ, ủng hộ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Phạm Thị Phương Loan MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan họ Gừng (Zingiberaceae) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng 1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng 1.2 Tổng quan chi Alpinia 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố chi Alpinia 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật chi Alpinia 1.2.1.2 Chi Alpinia Việt Nam 1.2.2 Phân loại chi Aipinia Việt Nam 10 1.2.3 Thành phần hóa học 12 1.2.4 Giá trị sử dụng chi Alpinia 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 15 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan 16 2.3.2 Phương pháp giám định tên khoa học 16 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi 17 2.3.4 Phương pháp hóa học 17 2.3.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng nước dược liệu 17 2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu dược liệu 18 2.3.8 Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 20 3.1 20 Nghiên cứu thực vật 3.1.1 Đặc điểm thực vật 20 3.1.2 So sánh đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu với Alpinia 23 blepharocalyx tài liệu 3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học vi phẫu dược liệu 27 3.2.1 Đặc điểm vi phẫu 27 3.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân rễ 29 3.3 31 Nghiên cứu đặc điểm vi học bột dược liệu 3.3.1 Đặc điểm bột 31 3.3.2 Đặc điểm bột thân rễ 31 3.4 Định tính hóa học 32 3.5 Xác định hàm lượng tinh dầu phận Riềng dài 34 lông mép 3.6 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu phận Riềng dài lơng mép 34 3.7 Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu 36 3.8 Bàn luận 40 3.8.1 Về thực vật 40 3.8.2 Về thành phần hóa học 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Alpinia dd Dung dịch DĐVN V Dược điển Việt Nam V GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Sắc ký khí kết hợp khối phổ) HNU Herbarium of National University HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) RDLM Riềng dài lông mép SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TT Thuốc thử UV Ultra Violet VFM Vietnam Forest Museum (Bảo tàng tài nguyên rừng Việt Nam) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng Việt Nam xếp theo hệ thống John Kress & cộng (2002) Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Alpinia Việt Nam Bảng 1.3 Hàm lượng thành phần tinh dầu số loài thuộc chi 13 Alpinia Việt Nam Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật mẫu nghiên cứu với Alpinia 23 blepharocalyx tài liệu Bảng 3.2 Kết định tính sơ nhóm chất dịch chiết mẫu 33 nghiên cứu Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu phận mẫu nghiên cứu 34 Bảng 3.4 Kết định tính thành phần tinh dầu phận 35 mẫu nghiên cứu SKLM Bảng 3.5 Thành phần cấu tử tinh dầu phận mẫu nghiên 36 cứu Bảng 3.6 So sánh thành phần tinh dầu phận mẫu nghiên cứu 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1 Ảnh chụp số phận Riềng dài lơng mép 22 Hình 3.2 Ảnh vi phẫu Riềng dài lơng mép 28 Hình 3.3 Ảnh vi phẫu thân rễ Riềng dài lơng mép 30 Hình 3.4 Một số đặc điểm bột Riềng dài lơng mép 31 Hình 3.5 Một số đặc điểm bột thân rễ Riềng dài lơng mép 32 Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu phận mẫu nghiên cứu 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Riềng (Alpinia Roxb.) chi lớn họ Gừng (Zingiberaceae) với khoảng 250 loài toàn giới, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới từ châu Á, châu Úc đến quần đảo Thái Bình Dương, có Việt Nam Phần lớn loài chi ưa bóng, ưa ẩm, mọc tán rừng, bóng khác, có số lồi phát triển tốt nơi bóng ven đường lớn hay trảng cỏ Nhiều lồi có giá trị tài ngun quan trọng [5] Tính đến nay, chi có 36 loài Việt Nam [14] Từ xưa đến nay, loài chi Riềng sử dụng để lấy tinh dầu, làm gia vị, thức ăn làm thuốc chữa bệnh Tinh dầu loài chi có giá trị cao nên sử dụng lĩnh vực mỹ phẩm, dược phẩm, y học… Nhiều loài dùng để bồi bổ sức khoẻ kết hợp với vị thuốc khác để chữa bệnh tiêu hóa, bệnh thời tiết, đau dày, hơ hấp, xương khớp…[10] Ngoài ra, người dân lấy hay nấu canh, làm rau ăn lấy hạt, củ, lá, thân để làm gia vị cho ăn hàng ngày [10] Nhiều loài thuộc chi Alpinia sử dụng làm thuốc Y học cổ truyền loài Thảo đậu khấu để chữa dày lạnh đau, nôn nước chua, tả lỵ Và thực tế, thị trường nay, dược liệu Thảo đậu khấu mua từ nhiều nguồn khác từ loài thuộc chi Alpinia Vì thế, cần có nghiên cứu giúp cho việc nhận biết, phân biệt chuẩn hóa dược liệu Thảo đậu khấu thị trường Do đó, việc nghiên cứu lồi chi Alpinia nói chung lồi Thảo đậu khấu nói riêng việc vô cần thiết Trong chuyến điều tra thực địa thị trấn Tam Đảo, huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, chúng tơi phát có lồi thuộc chi Alpinia, gọi Riềng dài lông mép Quả loài dùng làm thuốc với tên vị thảo khấu Mẫu nghiên cứu đem trồng Bảo tàng tài nguyên rừng Việt Nam (VFM) xã Vĩnh Quỳnh, huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội để theo dõi ổn định lồi Qua việc mơ tả đặc điểm hình thái đối chiếu với tài liệu [1], [5], [26]; tơi nhận thấy lồi mang đặc điểm loài Alpinia blepharocalyx K Schum var blepharocalyx Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần tinh dầu Riềng dài lông mép (Alpinia blepharocalyx K Schum var blepharocalyx), họ Gừng (Zingiberaceae)” thực với mục đích giám định tên khoa học xác định thành phần hóa học loài, làm sở cho nghiên cứu phát triển xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu sau Để thực mục đích trên, đề tài tiến hành với mục tiêu sau: - Xác định đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học, đặc điểm vi phẫu đặc điểm bột thân rễ mẫu nghiên cứu - Định tính sơ nhóm chất hữu mẫu nghiên cứu thơng qua phản ứng hóa học - Xác định hàm lượng tinh dầu lá, quả, thân rễ mẫu nghiên cứu phương pháp cất kéo nước - Xác định thành phần cấu tử tinh dầu cất sắc ký khí kết hợp khối phổ vật Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tập 33, số 1, tr.101-104 13 Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp hiển vi, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.13-17 14 Nghiêm Đức Trọng, Nguyễn Quốc Bình, Trần Văn Ơn, Nguyễn Phương Hạnh, Nguyễn Trung Thành (2018), “Bổ sung loài chi Riềng (Alpinia graminifolia D Fang & G.Y Lo) cho hệ thực vật Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tập 34, số 4, tr.54-58 Tài liệu tiếng Anh 15 Vu Xuan Duong, Nguyen Quoc Binh, Dang Trong Luong, Nghiem Duc Trong, Cao Phi Bang, Vu Tien Chinh, Ye Xing-er, Xia Nian-he (2019), “Alpinia coriandriodora D Fang, A New Record for Flora of Vietnam”, Journal of Tropical and Subtropical Botany, vol 27, no.1, pp.99-101 16 Jana Leong - Skornickova & Mark Newman (2015), Ginger of Cambodia, Laos & Vietnam, Singapore Botanic Gardens, National Parks Board in association with Royal Botanic Garden Edinburgh & Pha Tad Ke Botanical Garden, pp.110-122 17 Kai Larsen & Supee Saksuwan Larsen (2006), Ginger of Thailand, Queen Sirikit Botanic Garde, The Botanical Garden Organization Thailand, pp.106-113 18 Kress W J., Liu A Z., Newman M and Li Q J (2005), “The molecular phylogeny of Alpinia (Zingiberaceae): a complex and polyphyletic genus of ginger”, American Journal of Botany, pp.167-178 19 Ngọc-Sâm Lý (2017), “Alpinia newmanii sp Nov (Zingiberaceae) from central Vietnam”, Nordic Journal of Botany, pp.001-006 20 Pantilunglu Daimei & Yogendra Kumar (2013), “Alpinia blepharocalyx var glabrior (Handel-Mazzetti) T L Wu [Zingiberaceae]: a new record for Manipur, India”, Pleione, vol.7, no.2, pp.567-570 21 Archana P Raina & Z Abraham (2015), “Chemical composition of essential oils obtained from plant parts of Alpinia calcarata Rosc (lesser galangal) germplasm from south India”, Journal of Essential Oil Research, pp.238-243 22 V.S Rana, M Verdeguer & M Amparo Blazquez (2008), “GC and GC/MS Analysis of the Volatile Constituents of the Oils of Alpinia galanga (L.) Willd and Alpinia officinarum Hance Rhizomes”, Journal of Essential Oil Research, pp.521-524 23 Surapon Saensouk, Pranom Chantaranothai & Kai Larsen (2003), “Notes on the genus Alpinia (Zingiberaceae) in Thailand”, Thai Forest Bullentin (Botany), vol.31, pp.95-99 24 Takhtajan Armen (2009), Flowering Plants, Springer Science&Business Media, pp.707 25 L Tao, Z T Wang, E Y Zhu, Y H Lu, D Z Wei (2006), “HPLC analysis of bioactive flavonoids from rhizome of Alpinia officinarum”, South African Journal of Botany, pp.163-166 26 Wu, Z Y & P H Raven (2000), Flora of China (Flagellariaceae through Marantaceae) Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis, vol.24, pp.333-346 27 Zhang J, Guo H, Kong LY (2003), “Flavonoids from rhizome of Alpinia tonkinensis”, China Journal of Chinese materia medica, pp.28-41 Tài liệu tiếng Pháp 28 Lecomte M H (1908-1942), “Flore génerale de l’Indo-chine” VI, pp.26, 85-87 Tài liệu tiếng Latin 29 Tong Shao - quan (1981), “Revision and additional notes of Zingiberaceae of yunna, China”, Kunming Institute of Botany, Academia Sinica, Kunming 650204, pp.142 PHỤ LỤC PHỤ LỤC – CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC [2], [3] PHỤ LỤC – TIÊU BẢN THỰC VẬT CỦA MẪU NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC – BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC – SKĐ TINH DẦU CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY PHỤ LỤC – CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC [2], [3] Quy ước: ống nghiệm nhỏ dung tích ml, ống nghiệm lớn dung tích 20 ml Định tính flavonoid Lấy 20 g dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 40 ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi phút Lọc nóng, dịch lọc thu đem đun cách thủy nhiệt độ 80oC Gạn lấy phần dịch, bỏ phần tạp tách đáy bình, cách thủy đến cắn Hòa tan cắn ml ethanol 70%, dịch chiết cồn, thực phản ứng định tính sau: v Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): cho vào ống nghiệm nhỏ ml dịch chiết Thêm bột magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ giọt HCl đậm đặc (3 -5 giọt) Để yên vài phút, phản ứng dương tính dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ v Phản ứng với kiềm • Phản ứng với amoniac: Nhỏ giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, hơ miệng lọ amoniac đặc mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng vết đậm lên rõ rệt phản ứng dương tính • Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm v Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Phản ứng dương tính thấy dịch chiết chuyển sang màu xanh đen v Phản ứng diazo hóa: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, kiềm hóa dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc đun nóng nồi cách thủy vài phút, phản ứng dương tính xuất dung dịch màu đỏ Định tính coumarin Lấy khoảng g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 30 ml ethanol 90% Đun cách thủy phút, lọc nóng qua bơng Dịch lọc thu dùng làm phản ứng sau: v Phản ứng đóng mở vòng lacton: Cho vào ống nghiệm nhỏ ống ml dịch chiết - Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% - Ống 2: để nguyên Đun ống nghiệm đến sôi Để nguội quan sát - Ống 1: có màu vàng tủa đục màu vàng - Ống 2: suốt Thêm vào ống nghiệm ống ml nước cất Lắc quan sát - Ống 1: suốt - Ống 2: có tủa Acid hóa ống vài giọt HCl đặc, ống tủa đục lại ống v Phản ứng diazo hóa: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, kiềm hóa dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo pha, lắc đun nóng nồi cách thủy vài phút, phản ứng dương tính xuất dung dịch màu đỏ gạch v Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans tác dụng tia tử ngoại: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che phần diện tích dịch chiết giấy lọc đồng xu chiếu tia tử ngoại vài phút Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp đèn tử ngoại thấy phần khơng bị che có huỳnh quang sáng phần bị che v Vi thăng hoa: Cho bột dược liệu vào nắp chai nhôm Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay dược liệu Đặt miệng nắp nhơm phiến kính đặt bơng thấm nước lạnh Đun nhẹ nắp nhơm, sau phút lấy lam kính ra, để nguội, quan sát kính hiển vi thấy tinh thể hình kim Nhỏ thêm giọt dung dịch KI 10% lên phiến kính, quan sát kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu nâu sẫm tím Định tính saponin Quan sát tượng tạo bọt: cho vào ống nghiệm lớn g bột dược liệu, thêm ml nước cất Lắc mạnh phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Nếu bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có chứa saponin Định tính alcaloid Cân 15 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 40 ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml Kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac 6N (khoảng ml) đến pH = 9-10 (thử giấy quỳ) Chiết alcaloid base cloroform (chiết lần, lần ml) Gộp dịch chiết cloroform, loại nước Na2SO4 khan, sau dùng để làm phản ứng định tính Lấy phần dịch chiết cloroform chuẩn bị trên, đem chiết lỏng lỏng bình gạn acid sulfuric 1N hai lần, lần ml Gộp dịch chiết nước Chia vào ống nghiệm nhỏ, ống khoảng ml Nhỏ vào ống nghiệm - giọt thuốc thử sau: • Ống 1: TT Mayer, phản ứng dương tính xuất tủa màu từ trắng đến vàng • Ống 2: TT Bouchardat, phản ứng dương tính xuất tủa nâu đến đỏ nâu • Ống 3: TT Dragendorff, phản ứng dương tính xuất tủa màu vàng cam đến đỏ Định tính tanin Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi phút Để nguội, lọc Dịch lọc dùng để làm phản ứng định tính: • Ống 1: lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch FeCl3 5% (TT), phản ứng dương tính xuất màu tủa màu xanh đen xanh nâu nhạt • Ống 2: lấy ml dịch lọc, thêm giọt chì aceatat 10% (TT), phản ứng dương tính xuất tủa bơng • Ống 3: lấy ml dịch lọc, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, phản ứng dương tính xuất tủa bơng trắng Định tính anthranoid Lấy khoảng 15 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 30 ml nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt sôi Lọc dịch chiết nóng qua giấy lọc lớp bơng mỏng vào bình gạn dung tích 100 ml Làm nguội dịch lọc Thêm ml ether (hoặc cloroform) Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp ether (hoặc cloroform) để làm phản ứng v Phản ứng Borntraeger: định tính anthranoid tồn phần (dạng glycosid dạng tự do) • Lấy ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm ml dung dịch amoniac, lắc nhẹ Phản ứng dương tính có lớp nước màu đỏ sim • Lấy ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính có lớp nước màu đỏ sim v Vi thăng hoa: Trải lớp bột dược liệu nắp chai nhôm Đốt nhẹ đèn cồn cho bay dược liệu Đặt miệng nắp nhôm phiến kính bên đặt bơng thấm nước lạnh Tiếp tục đun nóng 5-10 phút Lấy lam kính ra, để nguội, quan sát kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng Sau nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính, phản ứng dương tính có dung dịch màu đỏ Định tính glycosid tim Cho vào bình nón 250 ml khoảng 20 g bột dược liệu, đun cách thủy với 80 ml ethanol 50% 30 phút, lọc lấy dịch lọc Dịch chiết thu đem loại tạp chì acetat 30%, khuấy Thêm dung dịch Na2SO4 15% để loại chì dư Lọc bỏ tủa, đun cách thủy tới cắn Hòa tan cắn vào cloroform, lọc lấy dịch đem cô bay thu cắn Cắn đem làm phản ứng sau: v Phản ứng khung steroid: Phản ứng Liebermann – Bouchardat Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ml anhydrat acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh v Phản ứng vòng lacton cạnh • Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt TT Baljet (gồm dung dịch acid picric 1% dung dịch NaOH 10% tỉ lệ 1:9) pha, phản ứng dương tính thấy xuất màu đỏ da cam • Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt TT Natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy xuất màu đỏ cam v Phản ứng phần đường 2,6 - deoxy: Phản ứng Keller – Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha acid acetic Lắc Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Phản ứng dương tính xuất vòng màu tím đỏ mặt tiếp xúc lớp chất lỏng Định tính acid hữu Cho khoảng g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10 ml nước cất đem đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội lọc qua giấy lọc gấp nếp thu dịch lọc Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng ml dịch lọc, thêm Na2CO3 tinh thể Phản ứng dương tính xuất bọt khí Định tính đường khử Cho khoảng g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm ml nước cất, đun sôi Lọc qua giấy lọc vào ống nghiệm khác Thêm ml dung dịch TT Felling A ml dung dịch TT Felling B Đun cách thủy sơi vài phút Phản ứng dương tính xuất màu đỏ gạch 10 Định tính acid amin, polysaccharid Cho khoảng g bột dược liệu vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước cất, đun sơi vài phút Lọc qua giấy lọc vào ống nghiệm nhỏ v Định tính acid amin: Thêm vài giọt TT Ninhydrin 3% vào ống nghiệm thứ nhất, đun cách thủy sôi 10 phút Phản ứng dương tính xuất màu tím v Định tính polysaccharid • Ống 2: ml dịch chiết + giọt TT Lugol • Ống 3: ml nước cất + giọt TT Lugol • Ống 4: ml dịch chiết Kết dương tính ống có màu xanh đen đậm ống ống 11 Định tính chất béo, caroten, sterol Cho khoảng g bột dược liệu vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 10 ml ether dầu hoả, bọc kín, ngâm Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu dịch lọc v Định tính chất béo: Nhỏ giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hết dung mơi Phản ứng dương tính giấy lọc vết mờ v Định tính caroten: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng ml dịch chiết ether dầu hỏa trên, cô cách thủy đến cắn, nhỏ vài giọt dung dịch H2SO4 đặc vào cắn Phản ứng dương tính thấy xuất màu xanh ve v Định tính sterol: Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng ml dịch chiết ether dầu hỏa trên, cô cách thủy đến cắn Thêm vào ống nghiệm khoảng ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Để nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống Phản ứng dương tính mặt phân cách lớp chất lỏng có màu PHỤ LỤC – TIÊU BẢN THỰC VẬT CỦA MẪU NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC – BIÊN BẢN GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC – SKĐ TINH DẦU CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY 4.1 SKĐ TINH DẦU LÁ 4.2 SKĐ TINH DẦU QUẢ 4.3 SKĐ TINH DẦU THÂN RỄ ... người thầy t n t y truyền cho nhi t huy t trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ su t trình thực khóa luận T i xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Thanh T ng, DS Nguyễn Văn Phương t n thể thầy cơ, anh chị kỹ thu t. .. nồi c t tinh dầu thể t ch l t, b t sứ, chày, cối, thuyền t n, khay tráng men… v Máy móc, thi t bị: • Máy xay • T sấy, bếp điện • Cân kĩ thu t Sartorius TE412 • Bộ dụng cụ c t tinh dầu theo Dược... dầu khơng t ng lên (thời gian c t khoảng 5-6 giờ) Đọc thể t ch tinh dầu sau c t • Xác định hàm lượng tinh dầu theo t lệ phần trăm thể t ch khối lượng dược liệu khô tuy t đối theo công thức: 18