Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây nần trắng

ĐẶT VẤN ĐỀ Đến ngày nay việc ứng dụng của Y học cổ truyền vẫn chiếm vị trí quan trọng trong giữ gìn sức khoẻ của con người. Sử dụng dược liệu làm thuốc và kinh nghiệm thực tiễn của các đồng bào dân tộc đã phản ánh đặc điểm của văn hoá Việt Nam. Mặc dù công nghệ tổng hợp hóa dược đã phát triển mạnh mẽ, nhưng không vì thế mà Dược liệu mất đi chỗ đứng của mình, nó không chỉ trực tiếp được chiết xuất tạo thành thuốc mà nó còn gián tiếp cung cấp những tiền chất cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới, vì vậy việc tìm kiếm và tinh chế các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Diosgenin là một trong những chất như vậy. Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin. Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song “chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea L.) thì mới có giá trị thực tế” trong việc khai thác chiết xuất diosgenin 4. Hằng năm, ước tính ngành Dược cần 10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin 24, 12. Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn, trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng giảm do sự khai thác quá mức 18, 24, 26. Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Nần trắng – Dioscorea chingii Prain Burkill, họ Củ nâu – Dioscoreaceae” với mục tiêu:

NÔNG THỊ THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

CÂY NẦN TRẮNG

(Dioscorea chingii Prain & Burkill)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

NÔNG THỊ THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

CÂY NẦN TRẮNG

(Dioscorea chingii Prain & Burkill)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Hoàng Tuấn ThS Hoàng Thị Tuyết Nhung Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược liệu

2 Viện Kiểm Nghiệm

HÀ NỘI – 2013

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Nguyễn Hoàng Tuấn, giảng viên bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà

Nội, người thầy tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận

Thầy đã truyền cho em những kiến thức quý báu cùng tác phong làm việc khoa học,

kiên trì Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Hoàng Thị Tuyết Nhung bộ môn

Hóa vô cơ trường Đại học Dược Hà Nội, cô đã luôn quan tâm sát sao và tận tình

hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên tại bộ

môn Dược liệu và phòng Đông Dược – Dược liệu Viện Kiểm Nghiệm đã giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận

Em xin trân trọng cảm ơn ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, các thầy cô giáo

giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền cho em kiến thức cùng nhiệt

huyết của thầy cô trong suốt những năm học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân đã ở bên động viên,

giúp đỡ em thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Nông Thị Thanh Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chi Dioscorea L 2

1.1.1.Vị trí của chi Dioscorea trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 1987 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Dioscorea L 2

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Ứng dụng của chi Dioscorea L 3

1.1.4.1 Ứng dụng trong đời sống 3

1.1.4.2 Ứng dụng trong y học 3

1.2 Diosgenin 4

1.2.1 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin 4

1.2.2 Ứng dụng của diosgenin 7

1.2.3 Các phương pháp định lượng diosgenin 8

1.3 Nần trắng 9

1.3.1 Đặc điểm thực vật cây Nần trắng (Dioscorea chingii) 9

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố cây Nần Trắng 11

1.3.3 Ứng dụng của cây Nần Trắng 11

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ 12

2.1.3 Thiết bị 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

3.1.1 Đặc điểm hình thái 15

3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 16

3.1.2.1 Đặc điểm bột lá 16

3.1.2.2 Đặc điểm bột thân 17

3.1.2.3 Đặc điểm bột thân rễ 17

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu 18

3.1.3.1 Đặc điểm vi phẫu lá 18

3.1.3.2 Vi phẫu thân 19

3.1.3.3 Vi phẫu thân rễ 20

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 21

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 21

3.2.1.1 Định tính alcaloid 21

3.2.1.2 Định tính glycosid tim 22

3.2.1.3 Định tính coumarin 23

3.2.1.4 Định tính tanin 24

3.2.1.5 Định tính flavonoid 24

3.2.1.6 Định tính anthranoid 25

3.2.1.7 Định tính chất béo, caroten, sterol 25

3.2.1.8 Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin 26

3.2.1.9 Định tính polysaccharid 27

3.2.1.10 Định tính saponin 27

3.2.2 Sắc ký lớp mỏng 31

3.2.3 Định lượng diosgenin 33

3.2.4 Chiết xuất, phân lập và xác minh mẫu thử 35

3.2.4.1 Chiết xuất 35

3.2.4.2 Phân lập chất D2 36

ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16 – DPA: 16-dehydro pregnenolon acetat

APTT : Thời gian thromboplastin

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatography

(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) SKLM : Sắc ký lớp mỏng

STT : Số thứ tự

TT : Thuốc thử

RSD : Relative standard devition (Độ lệch chuẩn tương đối)

UV : Ultra violet (Phổ tử ngoại)

Trang

Bảng 1.1 : Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp

6

Bảng 3.1 : Tiến hành xác định chỉ số phá huyết 29

Bảng 3.2 : Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong Nần trắng 30

Bảng 3.3 : Kết quả đo diện tích pic của mẫu diosgenin đối chiếu 34

Bảng 3.4 : Kết quả định lượng HPLC của 6 mẫu nần trắng 35

Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 35

Hình 3.14 : Sắc ký lớp mỏng chất D2 với diosgenin đối chiếu 39

Hình 3.15 : Sắc ký đồ của diosgenin đối chiếu 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đến ngày nay việc ứng dụng của Y học cổ truyền vẫn chiếm vị trí quan trọng trong giữ gìn sức khoẻ của con người Sử dụng dược liệu làm thuốc và kinh nghiệm thực tiễn của các đồng bào dân tộc đã phản ánh đặc điểm của văn hoá Việt Nam Mặc dù công nghệ tổng hợp hóa dược đã phát triển mạnh mẽ, nhưng không vì thế mà Dược liệu mất đi chỗ đứng của mình, nó không chỉ trực tiếp được chiết xuất tạo thành thuốc mà nó còn gián tiếp cung cấp những tiền chất cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới, vì vậy việc tìm kiếm và tinh chế các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm

Diosgenin là một trong những chất như vậy Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Tuy chất này có

mặt trong nhiều họ thực vật, song “chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea L.) thì

mới có giá trị thực tế” trong việc khai thác chiết xuất diosgenin [4] Hằng năm, ước tính ngành Dược cần 10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [24], [12]

Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn,

trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [18], [24], [26] Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành

phần hóa học của cây Nần trắng – Dioscorea chingii Prain & Burkill, họ Củ nâu

– Dioscoreaceae” với mục tiêu:

- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Nần trắng

- Góp phần khảo sát nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin

Để phục vụ mục tiêu trên đề tài bao gồm các nội dung nghiên cứu sau:

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học của mẫu Nần trắng

- Định tính sơ bộ các nhóm chất trong mẫu Nần trắng

- Chiết xuất, phân lập và định lượng diosgenin trong mẫu Nần trắng

Bộ Củ nâu (Dioscoreales)

Họ Củ nâu (Dioscoreaceae)

Chi Dioscorea L

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Dioscorea L

 Thực vật chí Trung Quốc [28] mô tả:

Cây thảo có thân quấn Thân rễ hay rễ củ, đa dạng về màu sắc, hình dạng, thành phần hóa học và khả năng cắm sâu dưới mặt đất Có hành con ở nách lá hoặc không có hành con Lá có cuống, mọc so le hay mọc đối, đơn hay kép chân vịt, có 3 – 9 gân chính Hoa đơn tính (cây khác gốc, hiếm khi lưỡng tính), sắp xếp theo hình xoắn ốc ở nách lá, cụm hoa bông thon dài hay chùm, hay theo cụm hoa xim, thường kết hợp đồng thời nhiều kiểu, đôi lúc tập hợp lại thành chùm kép ở ngọn hay nách lá bằng cách giảm bớt những lá mọc đối diện Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có Hoa cái mọc thành cụm bông dài 3,5 – 10cm, hoa thưa, bộ nhụy gồm 3 lá noãn, bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn Quả nang 3 cánh, mở từ đỉnh khi chín Hạt nhỏ thường có cánh chạy dọc quả

 Từ điển thực vật thông dụng [16] mô tả:

Cây có củ hay thân rễ, thuộc dạng thảo, mọc leo, có khi mọc đứng hay tỏa ra

Lá thường mọc so le, hay mọc đối, thường là lá đơn, có hình dạng thay đổi, dạng tim hay có góc

Cụm hoa thành chùm hay bông ở nách lá Hoa nhỏ màu lục, trắng trắng hay vàng vàng, đều, đơn tính, hoa đực hình chuông, hình bánh xe hay hình ống, hoa cái

có bao hoa tồn tại Quả nang, có 3 cạnh, 3 cánh, hạt có cánh nhiều hay ít Một số loài tạo ra hành con

 Thực vật chí Đông Dương [30] mô tả:

Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ (tinh bột) Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn sang trái Lá nguyên, một số ít trường hợp là lá kép, lá mọc xen kẽ hoặc mọc đối Kiểu hoa: đa phần là hoa đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác Hoa thường không có cuống hoặc

có cuống rất ngắn, mọc thành chùm hay bông rủ xuống Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3 Hoa đực : nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có và nhị rất ngắn Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa đực Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp Quả nang chẻ ô có 3 cánh Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả Hạt 6, có cánh ở tất cả các loài

1.1.3 Phân bố

Chi Dioscorea L có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới

châu Á, Australia, châu Mỹ Ở Việt Nam có hơn 40 loài [16], [8], [28] Ở châu Á có khoảng 140 loài [30]

1.1.4 Ứng dụng của chi Dioscorea L

1.1.4.1 Ứng dụng trong đời sống

 Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài Dioscorea được sử

dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp hạt như: khoai

mỡ (D alata), củ từ (D esculenta), khoai rạng (D glabra), củ mài (D persimilis)…

[2], [16] [8]

 Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu (D

cirrhosa), từ ngược mùa (D intempestiva) …[15],[8]

 Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên

như: củ mài gừng (D zingiberensis), từ poilane (D poilanei), từ tam giác (D

deltoidea), củ nần (D hispida)… [15],[8]

1.1.4.2 Ứng dụng trong y học

 Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ Ngoài ra, nhiều loài

trong chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc Dưới đây là một số tác dụng của các loài Dioscorea:

 Bổ dưỡng, nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D alata, D esculenta, D

 Các loài Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều tác dụng

kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường sức khỏe

toàn diện nhất là ở phụ nữ Gần đây, thân rễ Dioscorea được xác định có tác dụng

điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng xương Thêm nữa, tác

dụng chống oxy hóa của dioscorin, một protein dự trữ trong thân rễ Dioscorea cũng

được nghiên cứu rộng rãi Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng sử dụng thân

rễ Dioscorea có thể cải thiện một số bất thường về chuyển hóa, bao gồm tăng

đường huyết, bất thường chức năng ruột và chuyển hóa lipid (Jeon và cộng sự, 2006) [25]

1.2 Diosgenin

1.2.1 Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin

Trong thực tế, để tổng hợp các hormon steroid, người ta dùng chủ yếu diosgenin vì khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi

từ nguyên liệu là diosgenin Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi

Trillium), họ Zygophyllaceae (chi Tribulus), họ Solanaceae (chi Solanum), họ

Leguminosaceae (chi Trigoella), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi

Tacca) nhưng chỉ có họ Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [4]

Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài Dioscorea chứa diosgenin [25] Những loài Dioscorea như D deltoidea Wall, D composita Hemsl, D floribunda Mart.et Gal chứa hàm lượng saponin steroid đáng kể thường

có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [4] Phần lớn diosgenin được sản xuất trên

thế giới xuất xứ từ các loài Trung Mỹ, chủ yếu là D floribunda và D composita, cả hai loài đều mọc hoang ở bản địa [25] Trong thân rễ của D floribunda và D

composita thành phần diosgenin và yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần,

cả hai đều là những tiền chất steroid có giá trị, D.deltoidea chứa diosgenin ở trạng

thái tinh khiết nhất, nên có giá cao trên thị trường steroid [20] Tuy nhiên đáng buồn

là các công ty đã khai thác một lượng lớn thân rễ loài này từ các khu rừng, bất chấp những quy định nghiêm ngặt về khai thác, những vùng ở Kashmir và Himachal

Prades bị khai thác cạn kiệt hoàn toàn Nghiêm trọng hơn là ở những nơi D

deltoidea còn sót lại, thành phần diosgenin giảm mạnh so với trước [18] Ngày nay,

đa phần thuốc tránh thai đường uống ở phương Tây được tổng hợp toàn phần, song

ở Ấn Độ và Trung Quốc thuốc tránh thai đường uống và một số thuốc có khung steroid khác lại được bán tổng hợp từ diosgenin, một chất được chiết xuất từ các

loài Dioscorea

D nipponica và D zingigerensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở Trung

Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [18]

Bảng 1.1 là bảng tóm tắt các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản

xuất diosgenin trong công nghiệp trên thế giới [26]

Bảng 1.1 Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất diosgenin trong

công nghiệp trên thế giới

Tại Việt Nam, vào những năm 1980 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Nguyễn

Bá Hoạt và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ bản nguồn nguyên liệu cung cấp

diosgenin ở Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea), Costaceae (chi

Costus), Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi Tacca) Qua đó phát hiện 4

loài có triển vọng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin [6], [5]

+ D dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)

+ D membranaceae (hàm lượng diosgenin 2 – 2,3%)

+ D collettii (hàm lượng diosgenin 2,5 – 4,4%)

+ D zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1,4 – 2,4%)

Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành phần hóa học, các loài

Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh đặc điểm

thân rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở gốc cuống lá [6]

Cũng trong thời gian này, Viện Dược liệu [15], [13] di thực 3 loài Dioscorea vào Việt Nam: D composita, D floribunda và D deltoidea Đã xác định điều kiện trồng, chăm sóc phù hợp với 3 loài trên Tuy nhiên, sapogenin thu được từ D

composita và D floribunda đều có tạp chất pennogenin (hàm lượng pennogenin

D composita Hemsl

D floribunda M Martens &

Galeotti

D deltoidea Wall ex Griseb Ấn Độ

D collettii Hook F

D pathaica Prain & Burk.ill Trung Quốc

D nippomica Makino

trong sản phẩm từ vết đến 35% đối với D composita, và từ 1 – 5% đối với D

floribunda) Các nhà khoa học đã nghiên cứu xử lý tạp chất pennogenin song không

thành công Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn hơp diosgenin – pennogenin

chưa biết tỷ lệ thành phần, chiết xuất từ D composita và D floribunda cho thấy

hiệu suất chỉ bằng ½ so với điều chế từ diosgenin có hàm lượng trên 90%

Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất

diosgenin từ dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D floribunda trên quy mô

phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16-DPA và các dẫn xuất steroid [15], [13]

1.2.2 Ứng dụng của diosgenin

- Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức cholesterol máu và là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản phẩm nội tiết như: dehydroepiandrosteron, progesteron Diosgenin có tác dụng ngăn ngừa sự mất xương ở mức độ tương tự estrogen Do vậy diosgenin được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến triển loãng xương [29]

- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT)

Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim mạch như bệnh mạch vành

- Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra 16-dehydro pregnenolon acetat (16 – DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn xuất steroid Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được

sản xuất từ diosgenin Hàng năm, ước tính ngành dược cần 10.000 tấn thân rễ

Dioscorea để sản xuất diosgenin [24], [26]

Sơ đồ thoái biến diosgenin thành 16-dehydro pregnenolon acetat [12]

Trong số hàng trăm sapogenin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ

có khoảng mười chất có giá trị kinh tế lớn vì 2 lí do:

- Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ, có năng suất cao

- Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất trung gian là dehidropregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroid

Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [9]

1.2.3 Các phương pháp định lượng diosgenin

* Phương pháp cân

Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [3]

* Phương pháp đo quang

16 - DPA

16 - DPA

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác minh diosgenin Diosgenin được chiết bằng chloroform, lên màu bằng FeCl3 và H3PO4 – H2SO4 (10:1) (tt/tt), đo ở bước sóng 485 nm [3]

* Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong chloroform Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin chuẩn Sau đó đo mật độ vết sắc ký bằng Densitometer [12], [23]

Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp sai số lớn trong quá trình tách chiết mẫu Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử Phương pháp sắc ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer dễ thực hiện và kết quả khá chính xác

1.3 Nần trắng

1.3.1 Đặc điểm thực vật cây Nần trắng (Dioscorea chingii Prain & Burk.)

Thực vật chí Việt Nam mô tả [8]:

Dây leo nhiều năm, dài 5 – 10m, quấn trái Thân rễ nằm ngang, thô, to, vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu trắng hoặc màu vàng trắng, thân trên mặt đất màu lục

có khi có màu đỏ tím Lá đơn, mọc cách, phiến lá hình trứng, hình mũi giáo dạng tam giác, kích thước 7,5 - 20 x 4,5 – 10cm, chất giấy, mép nguyên, 2 mặt không có lông, 7 gân, chóp nhọn dần hoặc nhọn dài, gốc hình tim Hoa đều, đơn tính, khác gốc, mẫu 3 Cụm hoa bông đực dài 10cm, mọc ở nách lá, nhiều hoa, 2 - 6 chiếc tập trung ở nách lá bắc Cụm hoa bông cái gồm 1 - 3 cụm hoa, dài 6 – 10cm Hoa đực,

bao hoa 6 mảnh, hình chuông, dài 0,2cm dính nhau ở gốc, trên có 6 thùy, rời nhau, xếp 2 vòng, 3 thùy vòng ngoài hình trứng rộng, dài 0,15cm, 3 thùy vòng trong hình thuôn Nhị 6, tất cả hữu thụ; chỉ nhị rời nhau, đính ở gốc bao hoa hoặc trên đế hoa, uốn cong ra ngoài; bao phấn hướng trong đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc Hoa cái: bao hoa 6 mảnh, hình trứng hoặc hình trứng rộng Bầu hạ, 3 ô, mỗi ô 2 - nhiều noãn, đính noãn trung trụ, vòi nhụy 3, rời nhau, đầu nhụy hình đầu, 6 nhị thoái hóa đính đối diện với mảnh bao hoa Quả nang, không cong gập lại, 3 cạnh dạng cánh, dài 1,5 – 2cm, rộng 1 – 1,5cm, mở theo khe dọc từ đỉnh Hạt hình tròn, có cạnh dạng màng, bao xung quanh

Từ điển cây thuốc Việt Nam mô tả [2]:

Dây leo, thân rễ ở đất, nằm ngang, thân quấn qua bên trái, lá có nhiều phiến hình tim tam giác, dài tới 7cm, rộng 4 – 5cm, gốc lõm, gân từ gốc 7, mỏng, không

lông, cuống dài 2 – 3cm Cụm hoa đực là bông, thưa, dài 10 - 15cm, quả có 3 cánh, cánh dài 1,5 - 2cm, rộng 1 - 1,5cm, hạt có màng dạng cánh

Cây cỏ Việt Nam mô tả [11]:

Dây leo, thân nằm ở đất, ngang, thân quấn qua trái Lá có phiến hình tim tam giác, to 7 x 4,5cm, đáy lõm, gân từ đáy 7, mỏng, không lông, cuống dài 2 – 3cm

Phát hoa đực là gié không nhánh, thưa, dài 10 – 15cm, hoa có cọng dài 1mm Thực vật chí Trung Quốc mô tả [28]:

Thân rễ nằm ngang, phân nhánh không đều, hình trụ, dày đến 5cm, vỏ ngoài màu nâu đen Thân quấn qua trái, không có lông, mịn Lá đơn, mọc so le, phiến lá khô đen, hình trứng, kích thước 7,5 - 20 x 4,5 - 11,5cm, chất giấy, mép nguyên, 2 mặt không có lông, 7 gân Cụm hoa đực mọc đơn độc, hiếm khi 2 – 3 cụm hoa, dài đến 17 cm Hoa đực ít khi đơn độc, bao hoa màu vàng sáng, thùy hình trứng Nhị 6, đính ở gốc bao hoa, chỉ nhị rời nhau, Cụm hoa cái dài đến 20cm, cuống hoa thanh mảnh Hoa cái có bao hoa 6 mảnh, hình chữ nhật hoặc oval dẹt Quả nang, màu nâu đến màu nâu đậm, dài 1,5 - 2cm, rộng 1- 1,7cm Hạt nằm ở gần giữa quả, có cánh bao xung quanh

Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám mô tả [17]:

Cây dây leo quấn; thân rễ mọc ngang, dạng thô, phân nhánh không quy tắc, bên ngoài màu nâu đen Thân vặn theo hướng bên trái, nhẵn, không có lông Phiến

lá hình trứng, đầu lá nhọn hình mũi giáo tam giác, nhẵn, không có lông Hoa đơn tính, hoa đực và hoa cái khác gốc Hoa đực thường có 2 - 6 bông mọc liền với nhau, rất ít khi có hoa đơn, mỗi bông cách nhau 3 - 10mm Đài hoa đực hình dạng cái tẩu, dài dưới 2mm; Nhụy hoa dài 6mm, nằm trên đài hoa, sợi hoa dài 1,25mm, mọc vươn hướng ra ngoài Quả có 3 cánh, mỗi cánh dài 1,5 - 2cm, rộng 1 – 1,5cm Hạt nằm trong trung tâm quả, bên ngoài có 1 lớp cánh mỏng bao bọc 4 phía

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố cây Nần trắng

Dioscorea chingii ra hoa vào tháng 4 – 7, có mùa quả tháng 8 – 10, mọc trong

rừng lá rộng thường xanh hoặc rừng trên núi đá vôi [8]

Loài Dioscorea chingii phân bố ở bìa rừng, sườn núi, có độ cao từ 1200 –

1800m ở Quảng Tây, Vân Nam (Trung Quốc) [2],[17], hoặc mọc trên đồi dốc với

độ cao dưới 600m cách mực nước biển, dưới bóng râm của các bụi cây tại tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc)

Ngoài ra, Dioscorea chingii còn phân bố ở ít nơi trên độ cao 600m trong rừng

bắc Việt Nam [2], như Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu, Hang Kia), Ninh Bình ( Cúc Phương)[8]

1.3.3 Ứng dụng của cây Nần trắng

Dioscorea chingii có tác dụng tiêu thũng chỉ thống, thân rễ của cây được dùng

để trị đòn ngã tổn thương ở Trung Quốc [2], dân gian Trung Quốc còn thường hay dùng rễ và thân cây giã nát, uống hoặc bôi ngoài vết thương do bị ngã [17]

Ngoài ra, Dioscorea chingii còn được dùng để chữa vết thương phần mềm

(thân rễ giã nát đắp ngoài hoặc nước sắc để rửa)[8]

Cho đến nay, chưa thấy tài liệu nào nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Nần trắng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Thân rễ Nần trắng thu hái ở Mộc Châu, Sơn La vào tháng 8 năm 2012

Mẫu thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 60ºC

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ

Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

- Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck, Germany)

- Silicagel G kích thước hạt 5 – 40µm dùng cho sắc ký điều chế lớp mỏng (Merck, Germany)

- Hóa chất:

+ Acid sulfuric, methanol, natri hydroxyd…

+ Các thuốc thử dùng trong trong các phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Diazo…

+ Cloramin B, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

+ Thuốc thử vanillin trong acid sulfuric đặc

+ Dung dịch đệm phosphat – natri clorid

- Dung môi: Chloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol, aceton, nước cất

- Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, pipet paster, bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, ống đong

2.1.3 Thiết bị

+ Bếp cách thủy Memmert, sinh hàn hồi lưu, soxhlet

+ Máy HPLC khoa Đông Dược _ Dược liệu – Viện Kiểm Nghiệm

+ Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

+ Tủ sấy (Memmert, Đức)

+ Kính hiển vi Kruss + Đèn tử ngoại (UV)

+ Dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

2.2 Nội dung nghiên cứu

* Nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo khóa phân loại theo đơn

vị thứ để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

 Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:

+ Vi phẫu: thân, thân rễ, lá

+ Bột Dược liệu: thân, thân rễ, lá

* Nghiên cứu thành phần hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu Nần trắng

 Chiết xuất, phân lập, định lượng Diosgenin trong mẫu Nần trắng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp vi học

 Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo

phương pháp mô tả phân tích [1]

 Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô

 Xác định tên khoa học của cây bằng phương pháp đối chiếu các đặc điểm

hình thái của mẫu thu được với các tài liệu thực vật chí Trung Quốc [14], Từ điển

cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi) [2], Thực vật chí Đông Dương [30], Thực vật chí

Việt Nam [4], Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám [17]

 Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt bằng dụng cụ cắt cầm tay, tẩy và

nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm

vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi [1]

 Đặc điểm bột: lá, thân, thân rễ được sấy khô ở 60ºC, nghiền nhỏ thành bột

bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc

điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [10]

* Phương pháp hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành các phản ứng định tính đặc trưng cho từng nhóm chất [1]

 Chiết xuất diosgenin tham khảo phương pháp chiết xuất diosgenin từ D

floribunda [13], phân lập diosgenin bằng sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh là Silicagel 60

Merck, rửa giải bằng các dung môi thích hợp và sắc ký điều chế Xác minh diogenin bằng phổ UV, HPLC

 Định lượng diosgenin bằng phương pháp HPLC [27]

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Dây leo, thân quấn bên trái, thân rễ có vỏ ngoài màu nâu đen, ruột màu trắng, hoặc vàng trắng Lá đơn, mọc cách, hình mũi giáo dạng tam giác, kích thước 8 x 5cm, chất giấy, mép nguyên, hai mặt không lông, 7 gân, chóp nhọn dần hoặc nhọn dài, gốc hình tim Hoa đều, đơn tính, khác gốc, mẫu 3 Cụm hoa bông đực dài 9cm, mọc ở nách lá, nhiều hoa Cụm hoa bông cái dài 7cm Hoa đực, bao hoa 6 mảnh, hình chuông, dính nhau ở gốc, trên có 6 thùy, rời nhau, 3 thùy vòng ngoài hình trứng rộng, 3 thùy vòng trong hình thuôn Nhị 6, chỉ nhị rời nhau, đính trên đế hoa, uốn cong ra ngoài, bao phấn hướng trong đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc Hoa cái, bao hoa 6 mảnh, hình trứng Bầu hạ, 3 ô, mỗi ô nhiều noãn, đính noãn trung trụ, vòi nhụy 3, rời nhau, đính nhụy hình đầu Quả nang, không cong, gập lại, 3 cạnh dạng cánh, dài 1,5cm, rộng 1cm, mở theo khe dọc từ đỉnh Hạt hình tròn, có cánh dạng màng, bao xung quanh

 Xác định tên khoa học

Sau khi quan sát cây tại thực địa, chúng tôi tiến hành thu hái mẫu cây làm tiêu bản cây khô (Phụ lục), so sánh đối chiếu các đặc điểm thực vật của mẫu thu được với khóa phân loại trong các tài liệu: Thực vật chí Trung Quốc [28], Từ điển cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi) [2], Cây cỏ Việt Nam [11] Thực vật chí Đông Dương [30],Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám [17], Thực vật chí Việt Nam [8], so sánh mẫu tiêu bản thực vật với mẫu tiêu bản thực vật số P00275638, N0146 của phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris cùng sự giúp đỡ của người giám định thực vật là DS Lê Đình Bích, chúng tôi xác định mẫu Nần trắng mà chúng tôi nghiên

cứu có tên khoa học là Dioscorea chingii Prain & Burkill, họ Củ nâu –

Dioscoreaceae

3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu

3.1.2.1 Đặc điểm bột lá :

Bột lá: Bột màu vàng đậm, không mùi, không vị Quan sát dưới kính hiển vi

thấy: có nhiều mảnh biểu bì (1), tinh thể calci oxalat hình kim (2) kết lại thành từng

bó Tinh thể calci oxalat hình khối nằm riêng lẻ hoặc tập trung xếp thành hàng (3),

bó sợi (4), và mảnh mạch xoắn (5)

Hình 3.1: Cây Nần trắng Hình 3.2: Quả Nần trắng

Hình 3.3: Thân rễ Nần trắng

3.1.2.2 Đặc điểm bột thân

Bột thân: Bột thân có màu vàng nhạt, không mùi, không vị Quan sát dưới

kính hiển vi thấy: các sợi tập trung thành bó sợi (1), có nhiều mảnh mạch vạch (2),

và tinh thể calci oxalat xếp thành hàng trong mảnh mạch vạch (3)

3.1.2.3 Đặc điểm bột thân rễ

Bột thân rễ: Bột màu vàng nhạt, lốm đốm nâu Quan sát dưới kính hiển vi

thấy: rất nhiều hạt tinh bột đơn (1) hình trứng, rốn hạt phân thành 2 nhánh chạy dọc

Hình 3.4: Một số đặc điểm bột lá Nần trắng

Hình 3.5: Một số đặc điểm bột thân Nần trắng

hạt, vân đồng tâm Tế bào cứng (2) và tinh thể calci oxalat hình kim kết lại với nhau thành từng bó (3) Mảnh mạch điểm (4)

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu

3.1.3.1 Đặc điểm vi phẫu lá

Vi phẫu lá có gân trên hơi lõm, gân dưới lồi nhẹ Đi từ ngoài vào trong, đầu tiên là lớp biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn (1) Bó libe cấp I (2) và bó gỗ cấp I (3) xếp đồng tâm với nhau Mô mềm (4) gồm những tế bào

khá tròn, xếp lộn xộn với nhau Biểu bì dưới (5) Bó gỗ (6) (Hình 3.7)

Vi phẫu phiến lá Nần trắng có lớp biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn (1), bó gỗ nằm rải rác trên mô mềm (2), mô mềm gồm những tế bào khá tròn, xếp lộn xộn với nhau (3), biểu bì dưới (4) (Hình 3.8)

Hình 3.6: Một số đặc điểm bột thân rễ Nần trắng

3.1.3.2 Vi phẫu thân

Thân Nần trắng có thiết diện tròn Đi từ ngoài vào trong đầu tiên là lớp biểu bì gồm một hàng tế bào hình gần tròn xếp đều đặn (1) Nội bì (2) Trụ bì (3) Bó libe cấp I (4) xếp xen kẽ với gỗ cấp I (5), bó libe – gỗ tạo thành hình chữ V, với nhiều

vòng libe – gỗ từ trong ra ngoài Phía trong cùng là mô mềm ruột (6) gồm những tế

bào tròn, kích thước lớn, khá đều nhau (Hình 3.9)

3.1.3.3 Vi phẫu thân rễ

Đi từ ngoài vào trong, đầu tiên là lớp bần, gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật, xếp thành hàng đều đặn (1) Mô mềm (2) gồm các tế bào hình đa giác, kích thước lớn, xếp lộn xộn Bó gỗ (3) nằm rải rác trong mô mềm (Hình 3.10)

 Phản ứng với thuốc thử Mayer (K 2 HgI 4 )

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer

Kết quả: dung dịch không có kết tủa màu trắng, (-)

 Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI 4 )

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendorff

Kết quả: Dung dịch không có kết tủa màu da cam, (-)

Hình 3.10 : Vi phẫu thân rễ Nần trắng

3

2

1