3.2.4.1. Chiết xuất
Bước 1: Ủ men trong môi trường lỏng
Lấy khoảng 30 g bột dược liệu ngâm vào nước trong cốc thủy tinh 1 lít với 300ml nước ở 40ºC. Trong quá trình trộn dược liệu với nước nhiệt độ sẽ hạ xuống 36 - 37ºC, cho vào thiết bị ủ men giữ nhiệt độ ổn định 38ºC ± 0,5ºC trong thời gian 72 giờ. Thỉnh thoảng khuấy để trộn đều và làm đồng đều nhiệt trong khối phản ứng sinh học
Bước 2: Thủy phân bằng acid vô cơ
Bột dược liệu sau khi đã ủ men, chuyển sang bình cầu dung tích 500ml, cho thêm dung dịch acid H2SO4 2N. Đun cách thủy sôi trong 15 giờ.
Bước 3: Rửa sản phẩm thủy phân
Lọc trên giấy lọc, rửa bằng nước cất đến trung tính, thử bằng quỳ. Tãi mỏng bột dược liệu ra khay, sấy khô ở nhiệt độ 60ºC đến khi đạt độ ẩm 5% (5 giờ)
Bước 4: Chiết xuất bằng dung môi
Sản phẩm thủy phân đã sấy khô ở trên cho vào chiết kiệt bằng chloroform trong soxhlet trên nồi cách thủy trong 15 giờ. Tập trung dịch chiết, thu hồi dung môi.
3.2.4.2. Phân lập chất D2.
Tiến hành sắc ký cột.
+ Sử dụng pha tĩnh là Silicagel 60 Merck, cỡ hạt 0,040 – 0,063mm: m = 150g + Hệ dung môi khai triển: chloroform : methanol (99 : 1)
+ Tốc độ chảy 10 giọt/phút.
+ Hứng vào 105 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống khoảng 1ml.
+ Chấm sắc ký so sánh dung dịch trong các ống nghiệm hứng được với diosgenin đối chiếu trên bản mỏng silicagel 60 F254 với hệ dung môi khai triển chloroform : aceton (95:5). Sau đó phun thuốc thử hiện màu vanillin/H2SO4 đặc. Kết quả thu được là:
Ống 1 – 8: không có vết nào. Ống 9 – 23 : có 2 vết. Ống 24 – 33 : có 4 vết, có vết diosgenin mờ. Ống 34 – 49: có 6 vết, có diosgenin vết rất rõ. Ống 50 – 75: có 7 vết, có diosgenin vết rõ. Ống 76 – 95: có 5 vết, không có vết diosgenin. Ống 96 – 105: có 4 vết, không có diosgenin.
+ Gộp dịch chiết từ các ống 24 - 75 lại, tráng mỗi ống bằng một lượng nhỏ dung môi chloroform : methanol (99:1) để đảm bảo thu được toàn bộ chất
Sắc ký điều chế.
+ Chuẩn bị các tấm thủy tinh kích thước 10 x 20 cm.
+ Silicagel G kích thước hạt 5 – 40µm dùng cho sắc ký lớp mỏng. + Hệ dung môi khai triển: chloroform : aceton (95:5).
+ Hòa tan dịch trên vào chloroform thu được dịch chấm sắc ký, chấm dịch trên thành dải trên bản sắc ký tự tráng bên cạnh vết diosgenin đối chiếu. Sau khi khai triển, sấy khô cho bay hết dung môi, phun thuốc hiện màu vanillin/H2SO4 đặc ở hai bên bản sắc ký (do diosgenin không phát huỳnh quang). Từ vết diosgenin đối chiếu dóng sang cạo lấy lớp silicagel có chứa diosgenin. Tập trung silicagel cạo ra lại sau đó phản hấp phụ bằng methanol. Dịch phản hấp phụ thu được để bay hơi tự nhiên thu được tinh thể màu trắng hình kim, gọi là chất D2
3.2.4.3. Xác minh chất D2
Tiến hành
+ Sắc ký lớp mỏng với diosgenin đối chiếu: hòa tan chất D2 trong chloroform. Chấm sắc ký trên bản mỏng silicagel 60 F254 tráng sẵn cỡ 5 x 10 cm, đã hoạt hóa ở 110ºC trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển: chloroform : aceton (95:5). Thứ tự các vết chấm sắc ký từ trái qua phải lần lượt là: Diosgenin đối chiếu, mẫu D2, vết chấm chồng diosgenin đối chiếu và mẫu D2.
Quan sát bản mỏng dưới đèn UV bước sóng 254nm và 366nm. Hiện màu bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc.
+ Đo quang phổ hấp thụ UV của mẫu D2 và diosgenin đối chiếu đều được = 205nm, còn của diosgenin đối chiếu có λmax = 206nm
+ Triển khai HPLC mẫu diosgenin đối chiếu và D2 hòa tan trong chloroform. So sánh hình dạng phổ UV và λmax của diosgenin đối chiếu và D2 trong methanol Merck trong điều kiện như phần định lượng. So sánh hình dạng phổ UV, sắc ký đồ, thời gian lưu của 2 mẫu diosgenin đối chiếu và D2
Nhận xét
+ Sắc ký lớp mỏng của mẫu D2 có 1 vết màu vàng tương ứng với vết diosgenin đối chiếu.
+ Phổ UV của diosgenin đối chiếu và D2 có hình dạng và các cực đại, cực tiểu hấp thụ tương tự nhau, λmax diosgenin đối chiếu = 206nm, λmax D2 = 205nm
+ Mẫu diosgenin đối chiếu và D2 đều có pic của diosgenin chuẩn tại thời gian
lưu tR ≈ 7 phút
+ Dựa vào sắc ký đồ đo được của mẫu D2, ta thấy chất D2 sau khi tinh chế đã được tinh khiết, và D2 là diosgenin.
Trong đó C : chất diosgenin đối chiếu T : chất D2
B_Sau khi phun
vanilin/H2SO4
C_ UV 366nm sau khi phun
vanilin/H2SO4
Hình 3.14 : Sắc ký lớp mỏng chất D2 với diosgenin đối chiếu
Hình 3.15 : Sắc ký đồ của diosgenin đối chiếu
Hình 3.17 : Phổ UV diosgenin đối chiếu
Như vậy: trong mẫu Nần trắng có diosgenin (hàm lượng diosgenin trong dịch chiết toàn phần thân rễ Nần trắng định lượng được khoảng 0,3%).
3.3. Bàn luận
Qua việc tra cứu các tài liệu trên thế giới và Việt Nam chỉ có các báo cáo về đặc điểm hình thái và phân bố [2],[8], [11], [28], [30], [17], chưa thấy tài liệu nào có nghiên cứu về đặc điểm vi phẫu, và đặc điểm bột của cây Nần trắng. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và mô tả các đặc điểm của bột và vi phẫu của thân, lá, thân rễ Nần trắng. Kết quả của chúng tôi có thể làm cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn đặc điểm thực vật của dược liệu này.
Diosgenin là thành phần hóa học điển hình trong các cây thuộc chi Dioscorea
nói chung và cây Nần trắng nói riêng, tuy nhiên chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu nào cho biết về việc định tính và định lượng nhóm chất này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về định tính các thành phần hóa học trong Nần trắng bằng các phản ứng trong ống nghiệm, giúp phát hiện nhanh, đặc trưng cho dược liệu này. Đề tài cũng đã xác định được trong cây có diosgenin thông qua so sánh với SKLM và phổ UV của diosgenin đối chiếu. Vì vậy có thể sử dụng kết quả về nghiên cứu thành phần hóa học của cây Nần trắng để làm cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn Dược liệu Nần trắng.
Đề tài áp dụng phương pháp ủ men chiết xuất diosgenin từ D. floribunda, đây là phương pháp được đánh giá có hiệu quả cao nhất trong chiết xuất diosgenin [15]. Tham khảo quy trình định lượng diosgenin trong Dioscorea zingiberensis bằng HPLC [21], đề tài đã điều chỉnh một số điều kiện tiến hành nhằm đạt hiệu quả phân tích tối ưu nhất trong điều kiên thực tế phòng thí nghiệm: thay đổi nồng độ acid thủy phân, thay đổi dung môi chiết xuất từ xăng công nghiệp sang chloroform.
Từ trước đến nay diosgenin thường được định lượng bằng phương pháp cân, đo quang [8], sắc ký khí [7]. Nghiên cứu tiến hành định lượng diosgenin trong Nần trắng bằng HPLC. Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm hiện nay do :
+ Điều kiện phân tích khá dễ dàng, chuẩn bị mẫu đơn giản. Không cần bay hơi mẫu như sắc ký khí nên phân tích được những chất kém bền với nhiệt.
+ Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao nếu gắn với bộ phận thu hồi phân đoạn.
+ Độ lặp lại cao.
+ Thường không phân hủy mẫu.
Vì thế định lượng bằng HPLC thể hiện nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp đo quang và sắc ký khí được sử dụng trước đây [5], [4]
Đề tài đã ứng dụng phương pháp HPLC một cách có hiệu quả trong việc xác minh và định lượng diosgenin của thân rễ cây Nần trắng. Đây là công trình đầu tiên áp dụng phương pháp HPLC vào định lượng diosgenin trong Dược liệu Nần trắng. Kết quả hàm lượng diosgenin trong cây Nần trắng là 0,3%. Có thể sử dụng kết quả nghiên cứu này cho công tác tiêu chuẩn hóa Dược liệu Nần trắng về sau, và định hướng được cho những nghiên cứu tiếp theo về loài này nhằm tối ưu hóa phương pháp chiết xuất, phân lập đạt hiệu suất cao.
KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu đề tài đã thu được một số kết quả sau:
1. Về mặt thực vật
-Đã mô tả được đặc điểm hình thái của thân, lá, thân rễ của mẫu Nần trắng và xác định tên khoa học của mẫu thu hái là Dioscoreachingii Prain & Burkill.
-Đã mô tả được đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột thân, lá, thân rễ của mẫu
Nần trắng mà trước đó chưa thấy tài liệu nào trong nước công bố, góp phần tiêu
chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu.
2. Về thành phần hóa học
-Dịch chiết toàn phần của thân rễ Nần trắng có: saponin, coumarin, chất béo, sterol, đường khử, polysaccharid.
-Quan sát sắc ký lớp mỏng dưới đèn UV 254nm thấy xuất hiện 6 vết, dưới đèn UV 365nm thấy xuất hiện 13 vết, sau khi nhúng thuốc thử vanilin/H2SO4 hiện màu quan sát thấy có 6 vết trong đó có 1 vết diosgenin.
-Saponin trong Nần trắng có tính phá huyết (CSPH là 80).
-Đã chiết xuất, phân lập và xác minh được diosgenin trong Nần trắng.
-Hàm lượng diosgenin định lượng được trong Nần trắng bằng phương pháp HPLC là 0,3%.
ĐỀ XUẤT
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài mới chỉ xác minh được tên loài, định tính các thành phần hóa học, và định lượng hàm lượng diosgenin trong dược liệu. Đề tài đã tinh chế được diosgenin nhưng khối lượng còn ít và hiệu suất chiết xuất chưa cao. Vì vậy cần nghiên cứu cải tiến quy trình chiết xuất, phân lập diosgenin từ Nần trắng nói riêng và các loài trong chi Dioscorea nói chung để thu được hàm lượng diosgenin cao hơn và ổn định hơn, là nguyên liệu tốt để bán tổng hợp 16 – DPA trong công nghiệp.
Ngoài ra, để góp phần bổ sung nguồn Dược liệu quý, cần phải tăng cường việc lựa chọn và ươm mầm các giống cây có tiềm năng để mang lại hiệu quả kinh tế và đảm bảo tính cân bằng khai thác Dược liệu trong tương lai.
PHỤ LỤC
Sắc ký đồ Dịch chiết 2.0109g
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN THỰC VẬT
PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
SỐ : 8/2013
Người thu mẫu: TS. Nguyễn Hoàng Tuấn
Ngày thu mẫu: Tháng 8 Năm 2012
Nơi thu mẫu: Mộc Châu, Sơn La.
Tên địa phương: Sơn cát thự, Từ ching.
Yêu cầu:Giám định tên khoa học. Mô tả mẫu: 1 mẫu
Kết quả giám định: Căn cứ vào các tài liệu thực vật có tại trường Đại học Dược Hà Nội (bao gồm: Thực vật chí Việt Nam, tập 8, tr.353. Cây cỏ Việt Nam, tr.752. Từ điển cây thuốc Việt Nam tập 2, tr.1113. Thực vật chí Trung Quốc. Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám, tập 5, tr.561, và mẫu tiêu bản thực vật P00275628, N0146 lưu tại phòng tiêu bản Her.Mus.Paris với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, đã xác định mẫu trên có
- Tên khoa học: Dioscorea chingii Prain & Burkill - Họ: Dioscoreaceae
- Tên thường gọi: Sơn cát thự, Từ ching.
Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2013
Bộ môn Dược Liệu
Người giám định
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN THỰC VẬT PHÒNG TIÊU BẢN CÂY THUỐC
GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN
1. Tên mẫu cây:
- Tên khoa học: Dioscorea chingii Prain & Burkill. - Tên thường dùng: Sơn cát thự, Từ ching.
- Tên địa phương: Củ mài núi.
2. Nguồn gốc: Mộc Châu, Sơn La.
3. Ngày thu mẫu: tháng 8 năm 2012.
4. Người thu mẫu: Nông Thị Thanh Hiền. CQ: A3K63 ĐH Dược Hà Nội
5.Người nộp mẫu: Nông Thị Thanh Hiền. CQ: A3K63 ĐH Dược Hà Nội
6. Số hiệu phòng tiêu bản: HNIP/
7. Người giám định tên khoa học: DS. Lê Đình Bích. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn
8. Số lượng mẫu đã nộp: 1 mẫu.
Người nộp mẫu Người nhận mẫu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp.
2. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp. 390 – 403.
3. Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu 1, Bộ môn dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp. 141.
4. Ngô Văn Thu (1990), Hóa học Saponin, Trường Đại học Y Dược TPHCM, pp. 91 – 121, 189.
5. Nguyễn Bá Hoạt (1987), "Nguồn nguyên liệu cung cấp Diosgenin ở Việt Nam", Tạp chí dược học, pp. 17 – 19.
6. Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích (1987), Diosgenin trong một số loài Dioscorea ở Việt Nam, Công trình nghiên cứu khoa học Y dược 1986, pp.
7. Nguyễn Minh Khởi, Lê Đình Bích, Xchikhin V.A (1999), "Nghiên cứu định lượng diosgenin trong một số loài thuộc chi Dioscorea L. bằng sắc ký khí", Tạp chí Dược học, pp. 21 – 22.
8. Nguyễn Thị Đỏ (2007), Thực vật chí Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, pp. 353.
9. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, TP. Hồ Chí Minh, pp. 335.
10. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, pp.
11. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam quyển III, Nhà xuất bản trẻ, pp. 752. 12. Trần Tử An (2006), Hóa phân tích, tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp. 214-222.
13. Viện Dược liệu (2001), Công trình nghiên cứu khoa học 1987 – 2000, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, pp. 166 – 203.
14. Viện dược liệu (1986), Công trình nghiên cứu khoa học 1972 – 1986, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp. 91 – 111.
15. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật Hà Nội, pp. 969 – 974.
16. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp. 1113.
Tài liệu tiếng Trung
17. 中药辞海（第五卷) (1996), 国医药科技出版社出 , pp. 561.
Tài liệu tiếng Anh
18. Anthony. Huxley (2005), Green Inheritance: Saving the plant of the World, University oF Califonia Press, USA, pp. 121.
19. Chiang C. T., Way T. D., Tsai S. J., Lin J. K. (2007), "Diosgenin, a naturally occurring steroid, suppresses fatty acid synthase expression in HER2- overexpressing breast cancer cells through modulating Akt, mTOR and JNK phosphorylation", FEBS Lett, 581(30), pp. 5735-42.
20. Derek Walker. (2008), The Management of Chemical Process Development in the Pharmaceutical Industry, John Wiley & Sons Inc., USA, pp. 231 – 265. 21. Gong G., Qin Y., Huang W. (2011), "Anti-thrombosis effect of diosgenin extract from Dioscorea zingiberensis C.H. Wright in vitro and in vivo",
Phytomedicine, 18(6), pp. 458-63.
22. Li J., Liu X., Guo M., Liu Y., Liu S., Yao S. (2005), "Electrochemical study of breast cancer cells MCF-7 and its application in evaluating the effect of diosgenin", Anal Sci, 21(5), pp. 561-4.
23. Luigi M, Alastair C. Lewis, Keith D. Bartle (2002), Multidimensional chromatography, pp. 171 - 193.
24. Melinda B (2001), It’s Not in Your Head, It’s in Your hormones, Fair Winds Press, pp. 75 – 91.
25. Palaniswami M.S, Peter K.V (2008), Horticulture Science Series, Vol.9: Tuber and Root Crops, New India Publishing Agency, pp. 88 – 90.
26. Paul M. Dewick (2009), Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approachk, John Wiley and Sons Inc, pp. 247 – 265.
27. State Pharmcopoeia Commission of the People’s Republic of China (2005),
Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Vol 1 (English Edition), People’s Medical Publishing House, China, pp.
28. Wu Zhengyi , Peter H. Raven Flora of China, Vol. 24: Flagellariaceae through Marantaceae, Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, pp. 276, 283.
29. Yen M. L , Su J. L, Chien C. L, Tseng K. W, Yang C. Y , Chen W. F, Chang C. C , Kuo M. L (2005), "Diosgenin induces hypoxia-inducible factor-1 activation and angiogenesis through estrogen receptor-related phosphatidylinositol 3- kinase/Akt and p38 mitogen-activated protein kinase pathways in osteoblasts", Mol
