Chuẩn bị mẫu thử
Cân 6 mẫu bột dược liệu lần lượt là 2,0070g, 2,0079g, 2,0109g, 2,0126g, 2,0090g, 2,0070g vào 6 bình cầu nhỏ nối với sinh hàn hồi lưu, thủy phân bằng 50ml dung dịch acid H2SO4 2N trong 15 giờ trên nồi cách thủy 100ºC. Lọc qua giấy lọc, rửa bằng nước cất tới trung tính, lấy phần chất rắn bên trên giấy lọc đem sấy khô ở 60ºC trong 5 giờ. Chiết bằng chloroform trong soxhlet trên nồi cách thủy trong 15 giờ. Gộp dịch chiết, cô thành cắn. Sau đó hòa tan lại mỗi cắn trong chính xác 10ml methanol.
Phân tích mẫu
-Điều kiện khai triển sắc ký:
Cột: Hypersil ODS (150mm x 4,6mm DD); cỡ hạt : 5μm. Pha động: 100% methanol
Thời gian: 20 phút Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Thể tích mẫu tiêm: 10 µl.
-Xây dựng đường chuẩn của diosgenin:
Pha dãy dung dịch diosgenin đối chiếu có nồng độ lần lượt là: 0,0706 mg/ml, 0,1521 mg/ml, 0,190125 mg/ml, 0,38025 mg/ml, 0,7605mg/ml.
Phân tích các dung dịch diosgenin đối chiếu bằng HPLC.
Lập đồ thị tuyến tính của diện tích pic và nồng độ dung dịch diosgenin đối chiếu. Từ đồ thị rút ra phương trình đường chuẩn của mối liên quan giữa diện tích pic và nồng độ diosgenin.
Dựa trên phương trình đường chuẩn tính được nồng độ diosgenin trong dịch chiết đem phân tích, từ đó tính ra được hàm lượng diosgenin trong mẫu.
Kết quả
+ Ký hiệu C1, C2, C3, C4, C5 thứ tự là các dung dịch diosgenin đối chiếu có nồng độ 0,0706mg/ml, 0,1521mg/ml, 0,190125mg/ml, 0,38025mg/ml, 0,7605mg/ml.
Bảng 3.3 : Kết quả đo diện tích pic của mẫu diosgenin đối chiếu. Mẫu Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic C1 0,07605 305459 C2 0,1521 619885 C3 0,190125 764637 C4 0,38025 1434519 C5 0,7605 2656800
* Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
y = 3E+06x + 96380 R2 = 0.9984 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Nong do Diosgenin (mg/ml) D ie n t ic h p ic ( m A u )
Kết quả: Với khoảng nồng độ của diosgenin từ 0,07605 đến 0,7605g/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic với phương trình hồi quy:
y = 3399176,91 x + 96379,6427 R2 = 0,998
Trong đó : y : diện tích pic diosgenin (mAu.s) x : nồng độ chất diosgenin (mg/ml).
Bảng 3.4 : Kết quả định lượng HPLC của 6 mẫu nần trắng
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 tR
(phút) 7,315 7,316 7,333 7,339 7,351 7,313 Spic 1125310 1164740 1119871 1132448 1154883 1123610
* Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 06 thí nghiệm riêng biệt để định lượng mẫu dược liệu Nần trắng.
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 mdược liệu (g) 2,0077 2,0079 2,0109 2,0126 2,0090 2,0070 Hàm lượng
Diosgenin (%)
0,3027 0,3143 0,3011 0,3048 0,3114 0,3022 Hàm lượng trung bình tìm thấy chất diosgenin là 0,3061% (phương sai RSD = 1,78 %).
Kết luận: Kết quả thu được cho thấy có thể áp dụng chương trình đã lựa chọn để định lượng chất diosgenin trong mẫu thân rễ Nần trắng.
Hàm lượng diosgenin thu được là 0,3016 ± 0,0051, độ tin cậy là 95%