ở Trung Quốc năm 1931 ngời ta đã nghiên cứu rễ, thân rễ, cành của cây lá ngón Trung Quốc Gelsemium elegans đã chiết xuất đợc 4 loại alcaloid có tính chất và đặt tên là: + Kumin C20H22ON2
Trang 1Mục lục
Trang
Đặt vấn đề - 1
Phần I.Tổng quan - 2
1.1 Đặc điểm thực vật - 2
1.2 Thành phần hoá học - 2
1.3 Độc tính và tác dụng sinh học - 4
Phần II Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu - 5
2.1 Nguyên liệu - 5
2.2 Phơng pháp nghiên cứu - 5
Phần III Thực nghiệm và kết quả - 7
3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật - 7
3.1.1 Đặc điểm hình thái cây lá ngón
-3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của rễ, thân,
lá -3.1.3 Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây Lá
ngón -3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học
-3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học
-3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp
mỏng3.2.3 Định lợng Alcaloid toàn phần
-3.2.4 Chiết xuất và phân lập Alcaloid
-Phần IV Kết luận và đề
nghị -Tài liệu tham khảo
Phụ lục
Trang 2Đặt vấn đề
Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) là một loài cây độc mọc hoang ở
nhiều vùng núi Việt Nam Lá, thân, rễ đều có chất độc có thể gây chết ngời.Gần đây có nhiều trờng hợp tử vong do sử dụng nhầm các bộ phận của cây lángón [10]
Để góp phần kiểm định dợc liệu và tiến tới giám định các vụ ngộ độc do
cây lá ngón, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và
thành phần hoá học của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth.,
Loganiaceae ” với các nội dung sau:
Về mặt thực vật:
- Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu
- Xác định đặ điểm vi phẫu: rễ, thân, lá
- Xác định đặc điểm bột rễ, bột thân, bột lá
Về thành phần hoá học
- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ, thân, lá
- Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng
- Định lợng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá
- Chiết xuất và phân lập alcaloid chính
- Nhận dạng alcaloid phân lập đợc
PHầN I Tổng quan
1.1 Đặc điểm thực vật
Cây lá ngón có tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), họ Mã
tiền (Loganiaceae) ở một số vùng của Việt Nam nó còn có tên là Co ngón(Lạng Sơn), thuốc dút ruột, Hồ mạn đằng, Câu vẫn, Đoạn trờng thảo
Trang 3Cây lá ngón là một loại cây mọc leo, thân và cành không có lông, gỗ cómàu vàng Thân cây có khía dọc, lá mọc đối hình trứng thân dài hay hơi hìnhmác, đầu nhọn, phía cuối nhọn hay hơi tù, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 7 -12cm, rộng 2,5 - 5,5 cm Hoa mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá Cánhhoa mầu vàng, đài 5, lá đài rời Tràng gồm 5 cánh hoa nhẵn, dính thành ốnghình phễu, nhị 5 đính ở phía dới ống tràng, bầu chẵn, vòi dạng sợi Đầu nhụy
4 thùy hình sợi Quả nang có vỏ cứng dai, mầu nâu hình thon dài 1cm rộng0,5cm hạt nhỏ quanh mép có rìa mỏng màu nâu nhạt, hình thận.[1],[3],[5],[9],[12]
Cây lá ngón phân bố khá phổ biến ở nhiều miền rừng núi Việt Nam Từ
Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, QuảngNinh, Hoà Bình, đến các tỉnh Tây Nguyên Ngoài ra, cây lá ngón còn mọc ởmột số nớc nhiệt đới ở Trung Quốc, lá ngón có mặt ở các tỉnh Phúc Kiến,Quảng Đông, Quảng Tây ở Bắc Châu Mỹ có loài Gelsemium Sempervirens.Art.[4],[9],[12]
1.2 Thành phần hoá học
Theo các tài liệu của Đỗ Tất Lợi [12],Võ Văn Chi [4], Vũ Văn Chuyên[5], Trần Công Khánh [9], thì cây lá ngón có chứa nhiều alcaloid khác nhau,
cụ thể là: Từ loài cây ngón mọc ở Bắc châu Mỹ, G Sempervirens đã chiết ra
đợc nhiều loại alcaloid nh: gelsemin (C20H22O2N2), gelmixin
(C19H24O3N7), chất sempervirin và sempervin… tất cả đều có độc tính rất tất cả đều có độc tính rấtmạnh
ở Trung Quốc năm 1931 ngời ta đã nghiên cứu rễ, thân rễ, cành của cây lá
ngón Trung Quốc (Gelsemium elegans) đã chiết xuất đợc 4 loại alcaloid có
tính chất và đặt tên là:
+ Kumin (C20H22ON2 ): dễ tan trong cồn, khó tan trong ether, không tantrong nớc Tan trong nớc acid Đây là thành phần chủ yếu của cây chấtnày không độc lắm
+ Kuminin: vô định hình không màu, dễ tan trong ether và nhiều dungmôi hữu cơ, khó tan trong nớc, tan trong nớc acid
+ Kuminixin: là chất vô định hình
+ Kuminidin: có tinh thể hình trụ, không màu, tan nhiều trong các dungmôi hữu cơ và nớc
Tỷ lệ cả 4 loại alcaloid trên là 0,3%
Trang 4Vào năm 1936 F.Guichard nghiên cứu từ cây lá ngón mọc ở Việt Nam đãchiết từ lá, vỏ thân và rễ đợc những chất giống nh lá ngón Trung Quốc Tácgiả đã thấy chất kumin có cả trong quả và hạt, ngoài ra còn tìm thấy một chất
có huỳnh quang dới đèn tử ngoại, không tan trong acid và ghi là chất thuộcnhóm esculetin [12]
Năm 1953 M.M Janot xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin ởlá, kumin ở thân, rễ và sempervinrin ở các bộ phận của cây Năm 1971 PhanQuốc Kinh, Phạm Gia Khôi và Lơng Văn Thịnh chiết đợc kumin từ rễ cây lángón mọc ở Hoà Bình.[1]
Hoàng Nh Tố đã phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 15 vếtAlcaloid ở cây lá ngón trong đó đã tách đợc gelsemin và kumin.[1]
Theo Võ Văn Chi, [4], thì cây lá ngón có thể dùng làm thuốc, bộ phậndùng là rễ, thân, lá Nó có vị cay, đắng, tính nóng, rất độc có tác dụng thanhnhiệt, tiêu thũng, hạt có độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa Có công dụnglà: điều trị eczema, nấm ở chân, ở thân, đòn ngã tổn thơng, đụng giập, trĩ,tràng nhạc, đinh nhọt và viêm mủ da, điều trị phong hủi Giã cây tơi đắpngoài hoặc nấu nớc rửa ngoài mà không đợc dùng uống trong.[4]
Trong cây lá ngón mọc ở Bắc Mỹ: thành phần chủ yếu là chất gelmixin,
có độc tính rất mạnh Với liều thấp trên động vật có vú, trớc khi thấy hiện ợng ức chế hô hấp thờng thấy một thời kỳ hng phấn ngắn.[12]
t-Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác nhng sovới tác dụng của những alcaloid của cây lá ngón Bắc Mỹ thì nhiều phần giống
Trang 5nhau Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin.Chất kuminixin rất độc, nhng chất gelsemixin lại độc hơn nữa Nhỏ dung dịchgelsemin và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tợng giãn đồng tử còn kumin vàkuminin không làm giãn đồng tử.[12]
Ngoài thành phần hoá học, Hoàng Nh Tố còn kiểm tra truyền thuyếtdân gian nói: “chỉ ăn 3 lá là đủ chết ngời" đồng thời tìm cơ chế tác dụng củalá ngón để tìm cách chống độc có hiệu quả đã đi tới một số kết luận sau:
- Liều độc: LD50 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thểtrọng (chiết bằng cồn 900), của lá là 600mg/kg (dợc liệu tơi chiết bằng nớc),200mg/kg (lá khô chiết bằng nớc), 150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 700),89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 900),của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là200mg/kg, trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc
Nh vậy, lá ngón có độc nhng không đến mức 3 lá đủ chết ngời nh dân gian ờng nói
th Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh,gây nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt
- Nghiêu cứu về mặt chống độc, cho phép kết luận cơ chế tác dụngcủa các hoạt chất cây lá ngón chủ yếu đánh vào các men hô hấp, gây sự rốiloạn trong tế bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên tình trạng co giậtcơ và liệt cơ Phơng hớng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợmen đã dẫn tác giả tìm ra đợc tính chống độc của ATP Khi dùng ATP đểngăn ngừa cũng nh để điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lệ chết củachuột nhắt trắng từ 58% xuống còn 25%, đã cứu đợc tất cả các thỏ làm thínghiệm khi đã bị ngộ độc bằng liều chết của lá ngón.[12]
Dù đã nghiên cứu nh vậy nhng việc phát hiện các chất độc trong cơ thểkhi bị ngộ độc lá ngón còn rất khó khăn, vì phản ứng đợc tiến hành trên nhữngchất lấy đợc ở cơ thể ngời bị ngộ độc là một việc không phải dễ dàng.[12]
Chất độc chính trong cây lá ngón là các alcaloid nh gelsemin, kumidin
và kumin có trong toàn cây, độc nhất là ở rễ và lá non Ngộ độc với triệuchứng nh khát nớc, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt răng cắnchặt, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi chết Cách giải
Trang 6độc: Phải nhanh chóng loại chất độc ra khỏi cơ thể bằng cách gây nôn và rửaruột (nôn ra sớm thì sống, chậm thì chết).[9]
Theo kinh nghiệm truyền thống thì cho uống thật nhiều nớc sắc camthảo Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm Nếu hạ huyết ápthì dùng ephedrine, khó thở thì dùng niketamid cho thở oxy hoặc hô hấp nhântạo, đau bụng thì dùng thuốc giảm đau.[9]
Phần II Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
Trang 72.2.1 Nghiên cứu về mặt thực vật học
- Quan sát hình thái bên ngoài bằng cảm quan theo tài liệu [1],[2],[12]
- Cắt và quan sát vi phẫu: Rễ, thân, lá trên kính hiển vi quang học tại
bộ môn dợc liệu theo tài liệu thực tập [2],[8]
- Soi bột và mô tả các đặc điểm của bột rễ, thân, lá theo tài liệu [2],[8],[13]
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây lá ngón
- Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá cây [1],[2]
- Định lợng alcaloid trong cây theo phơng pháp acid base.[2]
- Xác định độ ẩm trên máy Sartorius ( Germany) tại bộ môn dợc liệu
- Đo phổ UV trên máy tại Viện kiểm nghiệm Bộ y tế
- Đo phổ IR trên máy tại Phòng Hoá, Viện khoa học hình sự
- Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại Phòng cấu trúc Viện hoá học
- Đo phổ cộng hởng từ hạt nhân trên máy tại
- Đo độ chảy trên máy GALLENKAMP tại bộ môn hoá hữu cơ
PHầN iii Thực nghiệm và kết quả
3.1 Đặc điểm thực vật
3.1.1 Đặc điểm hình thái cây lá ngón
Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối,hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mépnguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dớimầu nhạt hơn, gân lá hình lông chim, có từ 4-7 cặp gân phụ, cuống lá dài1cm Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím,cánh hoa mầu vàng
Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã đợc GS Vũ Văn Chuyên định tên khoahọc là:
Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae.
Trang 83.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ
Cấu tạo giải phẫu lá:
Hình 2
Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá đợc chia làm hai phầnchính, phiến lá và gân lá
- Gân lá: Mặt dới lồi, mặt trên phẳng hơi lõm.
Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình trứng kích thớc tơng đối lớn xếp đứng,biểu bì dới tế bào có dạng hình tròn và nhỏ hơn
Mô dày gồm những lớp tế bào tròn, thành dày xếp sát biểu bì trên và biểu bìdới
Mô mềm cấu tạo từ những tế bào tròn hình mỏng xếp lộn xộn
Cung libe gỗ ở giữa gân lá Có libe bao quanh cung gỗ
Trang 9- Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dới cấu tạo bởi những tế bào tròn xếp
đều đặn thành hàng, tế bào ở phía trên to hơn ở phần biểu bì dới Hầu nhkhông quan sát thấy mô dậu Ngay dới lớp biểu bì là mô khuyết, các tế bàoxếp lộn xộn có nhiều khuyết nhỏ
Cấu tạo giải phẫu thân:
Hình 3
Mặt cắt ngang thân hình tròn, từ ngoài vào trong có:
- Lớp bần: Gồm một đến hai hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành dãy
- Mô mềm vỏ: Gồm nhiều tế bào thành mỏng, phía ngoài dẹt, phía tronghình trứng Trong mô mềm vỏ có các tế bào hoá gỗ và các sợi gỗ xếp riêng lẻ,hoặc thành từng đám
- Libe: xếp thành từng bó, phía ngoài libe có các sợi thành dầy, xếp thànhtừng đám
- Gỗ: Mô gỗ khá dầy có các mạch gỗ lớn xếp trong mô gỗ, bị các tia ruộtthành dầy hoá gỗ chia ra tầng bó Mô gỗ liên tục càng vào phía trong cácmạch gỗ nhỏ dần, phần ngoài tia ruột có nhiều tinh thể canxi oxalat hình khối
- Libe quanh tuỷ tạo thành một cung liên tục nằm ở giữa gỗ và mô mềmruột
- Mô nềm ruột: Gồm các tế bào thành mỏng xếp lộn xộn tạo nhiều chỗkhuyết
* Cấu tạo giải phẫu rễ:
Trang 10Hình 4 Mặt cắt rễ tròn từ ngoài vào trong có:
- Lớp bần: Gồm ba đến bốn hàng tế bào xếp thành dẫy đồng tâm vàxuyên tâm, có nhiều chỗ đã bị bong ra
- Mô mềm vỏ: Phần này của rễ mỏng hơn so với ở thân, đợc cấu tạo bởinhững tế bào có thành mỏng Không có các bó sợi và tế bào hoá gỗ trong mômềm vỏ
- Libe: Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầyhoá gỗ nh ở phần thân cây
- Gỗ: Có các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia ruột thành dầyhoá gỗ chia ra tầng bó vào gần đến tâm Mô gỗ phía trong liên tục và không
Trang 11 Bột thân cây: mầu vàng nhạt Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc
Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trng:
- Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng,xếp đứng, kích thớc lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó
gỗ Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạothành khối giống tinh thể canxi oxalat
- Giải phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành dầy,khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu nh không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ Các tia ruộtmàng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinhthể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân.Bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thớc lớn và các sợi gỗ
3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học
3.2.1 Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá của cây lá ngón
Định tính alcaloid
Cân khoảng 10 gam bột dợc liệu đã đợc sấy khô cho vào bình nóndung tích 250ml Thấm ẩm đều bằng dung dịch NH4OH 10% Để yên 60 phút.Thêm vào 50ml CHCl3,lắc 5 10 phút rồi để yên qua đêm, lọc Lấy 30mldịch lọc cho vào bình gạn, thêm 10ml HCl 5%, lắc 2 3 phút, gạn lấy phầnacid để làm phản ứng Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết
ống 1 : Thêm 2 3 giọt TT Mayer Có tủa trắng
Trang 12ống 2 : Thêm 2 3 giọt TT Dragendorff Có tủa đỏ gạch.
ống 3: Thêm 2 3 giọt TT Bouchardat Có tủa đỏ nâu
Nhận xét: Qua kết quả định tính trên ta có thể sơ bộ kết luận trong rễ, thân,
lá của cây lá ngón đều có alcaloid
Định tính flavonoid:
Lấy khoảng 10 gam dợc liệu cho vào bình nón dung tích 100ml thêm50ml ethanol 900 đun cách thuỷ cho sôi vài phút, lọc nóng Dịch lọc dùng vàocác phản ứng sau:
+ Phản ứng cyanidin:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít bột Mg kim loại sau đócho từng giọt HCl đặc (3 5 giọt), để yên một vài phút không thấy dung dịchchuyển màu Phản ứng âm tính
+ Phản ứng với kiềm:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac
đặc đã mở nút, màu vàng của dịch chiết không tăng lên Phản ứng âm tính
+ Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%:
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết thêm 3 giọt dung dịch FeCl3 5%không có hiện tợng tạo tủa Phản ứng âm tính
Nhận xét: Từ kết quả trên sơ bộ kết luận trong rễ, thân, lá của cây lá
ngón không có Flavonoid
Định tính coumarin:
Cho 5 gam bột dợc liệu vào cốc, thêm 50ml cồn 900, đun cách thuỷ chosôi vài phút, lọc qua giấy lọc Dịch chiết thu đợc tiến hành làm các phản ứngsau:
Quan sát: - ống 1: đục hơn ống số 2
- ống 2: vẫn trong suốt
Trang 13Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì thấy ống 1 vẫn đục nh ban
đầu Phản ứng âm tính
+ Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, kiềm hoá bằng NaOH 10%,
đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội Nhỏ vài giọt TT Diazo mới pha Dungdịch trong ống nghiệm không chuyển sang màu hồng hay tím đỏ Phản ứng
+ Phản ứng với dung dịch gelatin 1%:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vào vài giọt dung dịchgelatin 1% thấy xuất hiện tủa bông Phản ứng dơng tính
Nhận xét: Sơ bộ nhận thấy trong rễ, thân, lá của cây có chứa tanin.
Cho 3 gam bột dợc liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 15ml
H2SO4 10% Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc vớiether etylic trong 1 2 phút, để yên cho tách thành 2 lớp Loại phần nớc, chovào phần ether 5ml dung dịch NaOH 10% Lắc thấy lớp ether có mầu vàng