Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Bồ kết quả nhỏ (Gleditsia australis F.B.Forbes Hemsl.) ở Thạch Thất

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ------ BÙI ĐỨC THẮNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ KẾT QUẢ NHỎ Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl... NGHI

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

BÙI ĐỨC THẮNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ KẾT QUẢ

NHỎ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.)

Ở THẠCH THẤT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ KẾT QUẢ

NHỎ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.)

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển – Trưởng bộ môn Dược học cổ truyền – người thầy

đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

ThS Phạm Thị Anh, DS Trần Văn Thành đã luôn bên cạnh chỉ bảo, hướng dẫn

giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

ThS Nghiêm Đức Trọng – bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, đã

tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu và thực hiện khóa luận này

Các thầy, các cô Trường Đại học Dược Hà Nội, đã trang bị đầy đủ kiến thức và động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các bạn, các anh chị em cùng làm

đề tài chuyên đề Dược liệu – Dược học cổ truyền, đã luôn đồng hành, chia sẻ, động viên, khích lệ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Bùi Đức Thắng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Gleditsia 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Thành phần hóa học 5

1.2 Tổng quan về loài Gleditsia australis 7

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 7

1.2.2 Thành phần hóa học 8

1.2.3 Công dụng và tác dụng sinh học 8

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 10

2.1.1 Nguyên liệu 10

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 10

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 11

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11

CHƯƠNG III KẾT QUẢ 22

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 22

3.1.1 Đặc điểm hình thái 22

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu quả 25

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 26

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 27

3.2.1 Định tính 28

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất 33

3.2.3 Xác định cấu trúc FG1 36

BÀN LUẬN 39

Về thực vật 39

Về hóa học 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Ethanol

High Performance Liquid Chromatography High Performance Thin Layer Chromatography Methanol

Nuclear magnetic resonance Tương đương

Thin Layer Chromatography Thành phần hóa học

Thuốc thử Ultra Violet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong Bồ kết (Fructus gleditsiae

australis) bằng các phản ứng hóa học thường quy 27

Bảng 3 2 Kết quả phân tích sắc kí đồ 29

Bảng 3 3 Dữ liệu phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR của chất FG1 35

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 1 Gleditsia australis F B Forbes & Hemsley 8

Hình 2 1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và cao toàn phần 19

Hình 3 1 Thân và cành mang hoa lá của cây Bồ kết tại thực địa 22

Hình 3 2 Một số đặc điểm hình thái lá Bồ kết 23

Hình 3 3 Một số đặc điểm hình thái hoa Bồ kết 23

Hình 3 4 Fructus Gleditsiae australis 24

Hình 3 5 Vi Phẫu quả cây Bồ kết (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) 25

Hình 3 6 Đặc điểm bột Bồ kết (Fructus Gleditsiae australis) 26

Hình 3 7 Bản mỏng sắc kí ở các bước sóng 30

Hình 3 8 Phân tích sắc kí đồ 31

Hình 3 9 Số lượng pic trên săc kí đồ chuẩn Vitexin (A) và cao Bồ kết (B) 31

Hình 3 10 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethyl acetat trong quả Bồ kết bỏ hạt 34

Hình 3 11 Công thức cấu tạo acid oleanolic 37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thư Chủ tịch Hồ Chí Minh gửi Hội nghị cán bộ Y tế ngày 27 tháng 02 năm

1955 có viết “Ông cha ta ngày trước có nhiều kinh nghiệm quý báu về cách chữa bệnh bằng thuốc ta, thuốc bắc Để mở rộng phạm vi y học, các cô chú cũng nên chú trọng nghiên cứu và phối hợp thuốc “đông” và “tây”,…” Sau đó gần 65 năm, xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là không độc hoặc rất ít khi có độc tính, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể

Việc sử dụng chi Gleditsia làm thuốc đã có từ hơn 2000 năm trước Bên cạnh việc

kết hợp với kinh nghiệm trong những tác phẩm kinh điển được viết bởi các danh y ở Trung Quốc như Thần Nông bản thảo kinh, Thang Dịch Bản Thảo, Đường Bản Thảo, , các nhà khoa học ngày nay cũng tập trung nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất, tác

dụng dược lý mới của chi Gleditsia giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của con người

Mặc dù có nhiều nghiên cứu khoa học về chi Gleditsia, song các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các loài như Gleditsia sinensis, Gleditsia japonica, Gleditsia tricanthos trong khi đó có rất ít nghiên cứu về loài Gleditsia australis – một loài Bồ kết được tìm

thấy nhiều tại Việt Nam

Cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) là cây mọc hoang ở cả miền Bắc và miền

Nam nước ta với trữ lượng lớn Trong y học hiện đại, một số bệnh viện đã dùng bồ kết chữa bí đại, trung tiện sau khi mổ, tắc ruột, dùng cho cả trẻ em và người lớn Quả bồ kết còn được dùng trong các trường hợp trúng phong, hôn mê bất tỉnh, cấm khẩu, hen suyễn, mụn nhọt, viêm tuyến vú, đau nhức răng Những nghiên cứu về tác dụng dược lý cho thấy

bồ kết có tác dụng kháng khuẩn mạnh như kháng tràng cầu khuẩn, trực khuẩn lỵ shigella, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn mủ xanh và phẩy khuẩn tả

Chính vì những lý do đó, nhằm mục đích tìm hiểu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của quả Bồ kết, để có thêm tri thức và nâng cao giá trị sử dụng cây thuốc,

2

tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây

Bồ kết quả nhỏ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) ở Thạch Thất" với mục

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Gleditsia

1.1.1 Thực vật học

1.1.1.1 Vị trí phân loài

Chi Gleditsia được phân loại như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Phylum) Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class) Ngọc lan (Magnoliophyta)

Phân lớp (Subclass) Hoa hồng (Rosidae)

Bộ (Order) Đậu (Fabales)

Họ (Family) Đậu (Fabaceae)

Phân họ (Sub-family) Vang (Caesalpinioideae)

Chi (Genus) Bồ kết (Gleditsia) [1-3]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Theo thực vật chí Trung Quốc, chi Gleditsia được miêu tả như sau: cây rụng lá hoặc

cây bụi, thân và cành thường có gai nhọn, cuống lá có rãnh; lá, thường là lá chét, có mép hình răng cưa nhọn hoặc tròn; lá kèm nhỏ, rụng sớm; hoa đơn tính hoặc lưỡng tính, xanh lục hoặc trắng xanh, thường mọc ở kẽ lá, cụm hoa chùm hoặc chùy; bẹ lá hình sợi, mặt ngoài có lông, mặt trong nhẵn; cánh hoa 3 – 5, dài hơn đài thùy; nhị hoa 6 – 10, nhô ra ngoài; bầu trên, không cuống hoặc cuống ngắn, vòi nhụy ngắn, đầu nhụy nằm ở đỉnh; một hay nhiều noãn; quả có vỏ dẹt, thẳng, uống cong hoặc hình xoắn, một hay nhiều hạt hình

trứng hoặc hình elip, dẹt hoặc gần hình trụ [17]

1.1.1.3 Phân bố

Phần lớn các loài thuộc chi Gleditsia được tìm thấy ở vùng Đông Nam Á, Bắc Mỹ,

Đông – Nam Mỹ và phía Nam Caucasus [14], [17], [20]

biển Caspian, (Gleditsia caspica) và một loài ở vùng Đông Bắc Ấn Độ (Gleditsia

assamica) [18]

Theo Huxley và cộng sự, 1992 và theo Thực vật chí Trung Quốc 2007 có 14 loài

thuộc chi Gleditsia [17], [20]

Theo The plan list, chi Gleditsia có tất cả 15 loài bao gồm: Gleditsia australis,

Gleditsia delavayi, Gleditsia fera, Gleditsia japonica, Gleditsia macracantha, Gleditsia microphylla, Gleditsia rolfei, and Gleditsia sinensis, Gleditsia aquatica, Gleditsia triacanthos, Gleditsia amorphoides, Gleditsia caspica, Gleditsia assamica và Gleditsia texana [19]

Ở Việt Nam có 3 loài: Gleditsia rolfei Vidal y Soler (tạo giác), Gleditsia pachycarpa

Bal ex Gagn (bồ kết quả dày) và Gleditsia australis Hemsl ex Forb & Hemsl (chùm

kết, bồ kết, tạo giác, bồ kết quả nhỏ) [9] Cây bồ kết được trồng ở nhiều nơi, thường thấy

ở một số tỉnh Hải Phòng, Quảng Ninh, Hà Nam, Thanh Hóa, Nghệ An,… Ở Tây Nguyên,

bồ kết được trồng để tạo bóng và chắn gió cho cà phê [11], [12]

Bồ kết là loại cây gỗ lớn, mọc nhanh, ưa sang, thường mọc ở rừng thứ sinh, đôi khi thấy cả ở vùng rừng núi đá vôi Cây ra hoa và quả hàng năm, nhưng tỷ lệ quả phụ thuộc thời tiết Bồ kết rụng lá vào mùa đông Lá non lại vào cuối mùa xuân năm sau, cây trồng bằng hạt, sau 4 năm ra hoa và quả đầu tiên, các năm sau sẽ ra nhiều hơn Bồ kết có khả năng tái sinh chồi sau khi chặt [11], [12]

1.1.1.4 Đặc điểm một số loài thuộc chi Gleditsia

- Gleditsia rolfeiVidal y Soler.: Tạo giác Đại mộc nhỏ, nhánh có bì khẩu tròn trắng;

gai chẻ hai, ngay, dài Lá dài 20cm, 10 cặp, bầu dục, bất xứng, dài 3 – 7cm, gân phụ 9 – 11 cặp, bìa có rang tròn, đầu tà Chùm ngoài nách lá, dài 12 cm; lá đài mặt trong có long; cánh hoa 5, cao 4mm; tiều nhụy Hoa cái có tiểu nhụy lép Quả dẹp,

5

đen, dài 20cm, rộng 1.5cm; hạt 15 – 20 [9]

- Gleditsia pachycarpa Bal ex Gagn.: Đại mộc; nhánh có gai Lá dài 20 – 25cm; thứ

diệp mọc xen, dài 3.5 – 5.5cm, bất xứng, hơi cong, đầu tà tròn, bìa có răng tà, gân phụ 11 – 15 cặp, có lông mịn Quả dẹt, đen, dài đến 30cm, rộng 4.5cm Hạt đến 40,

nâu [12]

- Gleditsia australis Hemsl ex Forb & Hemsl.: Chùm kết, Bồ kết, Tạo giác;

Honeylocust Đại mộc 8m, có gai to, cứng, chia nhánh Lá kép 2 lần, mang 3 – 4 cặp thứ diệp; tam diệp 6 – 8 cặp, có lông ở mặt trên, đầu tròn hay lõm Cánh hoa đầy lông mặt trong; tiểu nhụy rời, 10 ở hoa đực, 5 ở hoa lưỡng tính Quả dẹt,

mỏng, cứng, nâu đen; hột 10 – 12 [9]

- Gleditsia sinensis Lam.: Cây gỗ to, cao tới 12m, thân thẳng có vỏ nhẵn và rất nhiều

gai to, cứng, phân nhánh, dải 10 – 25cm Lá kép, mọc so le, một lần lông chim, lá chét có 6 – 8 đôi mọc so le, hình mác, bó vầ hơi có lông ở mặt trên, nhạt hơn và nhăn ở mặt dưới, đầu lá chét nhọn, gốc lệch Cụm hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, nhiều cụm dài 10 – 15cm, hoa màu vàng, tràng 5 cánh, hoa đực có 10 nhị và không

có bầu, hoa lưỡng tính có 5 nhị, bầu trên có nhiều lông, đựng nhiều noãn Quả dẹt, cong, dài 15 – 20cm, phồng ở chỗ có hạt Có từ 15 – 20 hạt, khi chính có màu mâu

đen [33]

1.1.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, hơn 60 hợp chất đã được phân lập từ chi Gleditsia bao gồm các nhóm chất triterpen, sterol, flavonoid, phenolics và alkaloids Trong đó, saponin triterpenoid là thành phần đặc trưng nhất trong quả Gleditsia, chiếm một lượng lớn tỷ lệ trong các hợp chất phân lập [34]

1.1.2.1 Triterpene và Sterol

Đặc điểm cấu trúc của triterpen được liệt kê như sau: (1) những triterpen này có thể được chia thành hai loại chính dựa trên bộ khung cơ bản của chúng, và các hợp chất loại oleanane và lupane được tìm thấy trong chi Gleditsia; (2) 32 triterpen thường được glycosyl hóa ở vị trí C-3 hoặc C-3, -28 với một hoặc nhiều phân tử đường; (3) trong số 32

6

saponin triterpenoid, 17 glucoside triterpenoid gắn một, hai hoặc ba acid monoterpenic với các phân tử đường [21]

Năm 1995, từ dịch chiết phân đoạn của quả loài Gleditsia japonica M., hai nhà

khoa học Nhật Bản Takao Konoshima và Tokunosuke Tawada phân lập thành công hai hợp chất triterpene saponin là gleditsia saponin B và gleditsia saponin C [31]

Năm 1999, Zhang Z và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết quả Gleditsia sinensis các

hợp chất triterpene saponin: các hợp chất gleditsioside A, B, C và D [36], gleditsioside E,

F và G cùng với hai hợp chất đã biết là gleditsia saponin B và C đã được phân lập và xác

định cấu trúc [34], gleditsioside N, O, P và Q [35] và H, I, J, K và hai chất lần đầu tiên thu

được trong thiên nhiên là gleditsia saponin C’ và E’cũng được tìm ra và phân lập vào năm này [37]

Năm 2005, Lim JC và cộng sự đã phân lập được 1 triterpenoid và 4 steroids từ gai

của Gleditsia sinensis LAM trong đó triterpenoid C-friedours-7-en-3-on lần đầu tiên được

tìm thấy trong nguồn gốc tự nhiên [26] và những chất này cũng được Li WH và cộng sự phân lập sau đó 2 năm [25]

Gần đây, lần lượt các năm 2010 và năm 2014, Miyase và cộng sự (2010); Melek và cộng sự (2014) đã phân lập và mô tả đặc tính của 11 bisdesmosidic triterpenoid saponin: Caspicaoside (A-K) [26], [28]

Sterol thu được từ chi Gleditsia được phân thành hai loại: lanostane và lupine [25]

Li WH và cộng sự đã phân lập được 4-lupane sterol: betulic acid, alphitolic acid, trans-p-coumaroyl alphitolic acid và 2-hydroxypyracrenic acid Ngoài ra, vào năm 2005, khi tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, Lim và cộng sự đã tìm thấy một vài hợp

3-O-chất lanostane từ gai của Gleditsia sinensis [26]

epicatechin [38] Cũng trong năm đó, hai ellagic acid glycoside từ gai của Gleditsia

sinensis LAM cũng được các nhà khoa học này phân lập: 3-O-methylellagic

acid-4'-O-alpha-L-rhamnopyranoside Cả hai hợp chất đều lần đầu tiên được phân lập từ loài này và là một

hợp chất mới [39]

1.1.2.4 Alkaloid

Các alcaloid tương đối hiếm gặp ở các loài Gleditsia và chỉ có bốn hợp chất được

tìm thấy trong chi này Năm 1965, Morimoto và Oshio đã phân lập được một triacanthine kiềm từ G horrida Willd [40] Năm 2010, Kajimoto và cộng sự đã phân lập được

isoguanine glucoside từ hạt của Gleditsia japonica và xác định là saikachinoside A [22]

Trong một nghiên cứu khác, các nhà khoa học này cũng đã chiết hoạt chất từ hạt của

Gleditsia japonica và tìm thấy một glucoside purine kiềm mới được xác định là

locustoside A [23] Đến năm 2014, Lee và cộng sự cũng đã phân lập thành công

cytochalasin H [24] Các cuộc nghiên cứu cho thấy khả năng xuất hiện của các alkaloid

trong chi này

1.2 Tổng quan về loài Gleditsia australis

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Đại mộc 8m, có gai to, cứng, chia nhánh Lá 2 lần kép, mang 3 – 4 cặp thứ diệp; tam diệp 6 – 8 cặp, có lông ở mặt trên, đầu tròn hay lõm Cánh hoa đầy lông mặt trong; tiểu nhụy rời, 10 ở hoa đực, 5 ở hoa lưỡng tính [9]

Gai phân nhánh, các gai chính to hom và thường mang 1 đến 2 nhảnh gai nhỏ Gai chính hình nón thuôn dài, chiều dài từ 3 cm đến 15 cm, đường kính từ 0,3 cm đên 1 cm; gai nhảnh dài từ 1 cm đến 6 cm, đinh nhọn Mặt ngoài màu nâu đến nâu tía Chất cứng,

Hình 1 1Gleditsia australis F B Forbes & Hemsley

1.2.2 Thành phần hóa học

Saponin là thành phần chủ yếu trong quả Bồ kết (tinh khiết 10%), có cấu trúc triterpenic có tên là gleditsaponin, thủy phân cho gleditsapogenin và glucose Các flavonoid là: Vitexin, saponaretin, homoorientin, orientin, luteolin Phần aglycol của các triterpenic là: acid oleanolic, acid echinoxystic [11], [15]

1.2.3 Công dụng và tác dụng sinh học

Loài Gleditsia australis chứa có các chất có hoạt tính kháng khuẩn, nấm và virus

[8], [11], [30] Cùng với đó, từ xưa, người dân đã sử dụng loài này chữa các bệnh trúng phong, cấm khẩu, khó tiêu, táo bón, tích đờm suyễn, làm sáng mắt, ích tinh

Quả Gleditsia australis khai khiếu, tiêu đờm, tán kết, tiêu thũng Chủ trị: Trúng

phong cấn răng, đàm thịnh, quan khiếu không thông, họng đau tê đờm trướng ngại, ho suyễn khó khạc đờm, đại tiện táo kết Dùng ngoài trị nhọt độc sưng tấy [4] Khói của quả

Các gai đƣợc có tác dụng tiêu thũng, trừ độc, trừ mủ, sát trùng Chủ trị: Nhọt độc sơ khởi hoặc làm mủ không vỡ Dùng ngoài điêu trị ngửa, lở, hủi [4]

10

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu cây Bồ kết được thu hái tại xã Kim Quan, huyện Thạch Thất, Hà Nội Cành mang hoa lá thu hái vào tháng 8 Quả được thu hái vào tháng 12, khi quả chín và sấy khô

ở 50 – 600C, đóng gói bảo quản nơi khô ráo để làm thực nghiệm

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất và dung môi

- Các chất tẩy – nhuộm tiêu bản: Nước Javen, Cloral hydrat, acid acetic, đỏ son phèn, xanh methylen,

- Chất đối chiếu là Vitexin của công ty TNHH Công nghệ sinh học Nam Kinh – Trung quốc (Phụ lục 3)

- Các dung môi hữu cơ là các dung môi tinh khiết: EtOH 96%, MeOH (TT); Chloroform (TT); Ethyl acetate (TT) ; Acid acetic ; Dicloromethane; nước cất,

2.1.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ

- Kính hiển vi quang học Labomed

- Hệ thống cắt tiêu bản, vi phẫu thực vật

- Thuyền tán, rây 0.18mm

- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Precisa

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng Shimazu Nhật Bản

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 5,0 L

- Máy cất quay thu hồi dung môi của hãng IKA

- Máy chiết siêu âm WiseClean

11

2.2.1 Nghiên cứu thực vật học

2.2.1.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái

Quan sát tại thực địa, thu hái và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về: dạng sống; thân; gai; lá (hình dạng phiến, chóp, gân, gốc, cuống, kích thước…); hoa (dạng cụm hoa,

vị trí cụm hoa, kích thước, lá bắc, bộ nhị, bộ nhụy…); quả và hạt (hình dạng, màu sắc, kích thước…) Thu hái, làm tiêu bản và lưu giữ tiêu bản theo phương pháp ghi trong tài liệu [2],[3]

Dụng cụ sử dụng gồm: kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số, thước kẻ

- Lấy mẫu quả, ép tiêu bản và lưu giữ tiêu bản

- Phân tích đặc điểm của quả căn cứ vào các khóa phân loại trong thực vật chí, xác định tên khoa học dưới sự hướng dẫn của các chuyên gia phân loại thực vật

2.2.1.2 Nghiên cứu về đặc điểm vi học

- Vi phẫu: tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn thân thứ 3 tính từ đầu cành Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/2-1/3 dưới gần gốc của lá trưởng thành Tiêu bản gai được cắt ngang ở vị trí 1/2 - 1/3 gai chính Sau

đó, các mảnh cắt được tẩy, nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi

- Soi bột: Quả chín được bỏ hạt phơi hoặc sấy khô, nghiền thành bột mịn, rây, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi xác định và chụp ảnh những đặc điểm của bột qua kính hiển vi

- Tiến hành kiểm tra và so sánh các đặc điểm hình thái và vi học của quả Bồ kết

(Fructus Gleditsiae) của mẫu nghiên cứu với DĐVN V

- Xác định tên khoa học của loài nghiên cứu dựa trên tài liệu tham khảo [3], [7], [9], [11] và so sánh với tiêu bản mẫu với sự giúp đỡ của chuyên gia phân loại thực vật của Việt Nam

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính

12

Sử dụng phản ứng hóa học thường quy cùng với các thuốc thử đặc hiệu và sắc ký lớp mỏng định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu theo tài liệu [1], [5], [6], [8]

- Phản ứng Liberman - Burchard: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid

acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu tím đỏ giữa hai lớp

- Phản ứng Baljet: Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch

acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều Cho vào ống nghiệm

có chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha vào ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ cam

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90% Lắc đều

cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt dung dịch natrinitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện dung dịch màu đỏ

- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung

tích 20ml, thêm vào đó 5ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20ml, thêm 5ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

- Phản ứng Liberman - Burchardat: Cho vào bình nón 1g dược liệu, thêm 20ml

ethanol 90%, đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm 45o, cho từ từ vào thành ống nghiệm 1-2 giọt acid H2SO4đặc Phản ứng dương tính khi màu vàng, đỏ, xanh lá hoặc tím

d Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntraeger: Lấy 2g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml,

thêm 50ml dung dịch H2SO4 10% Đun cách thủy sôi trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5ml chloroform Gạn lớp chloroform để làm phản ứng Cho vào 2 ống nghiệm, lắc nhẹ:

Ống 1: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NH4OH 10%

Ống 2: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NaOH 10%

Phản ứng dương tính khi cả 2 ống có màu đỏ sim

- Vi thăng hoa: Trải khoảng 1g bột dược liệu thành lớp mỏng trong một đĩa nhôm

Hơ nhẹ trên bếp điện cho bay hết nước trong dược liệu Đặt lên trên đĩa nhôm một lam kính, trên lam kính đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh Để đĩa

- Phản ứng với NH 3 : Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, quan sát

dưới ánh sáng thường thấy có màu vàng, sau đó hơ trên miệng lọ amoniac đặc Phản ứng dương tính khi vết màu vàng đậm hơn

- Phản ứng với NaOH: cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung

dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính khi dung dịch màu vàng đậm

- Phản ứng Cyanidin: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie

kim loại, rồi giỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đậm đặc Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu đỏ cam

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm

2-3 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu xanh lục, xanh hoặc nâu

- Phản ứng Diazo hóa: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng NaOH

10% Thêm vài giọt thuốc thử Diazoni, lắc đều, đun cách thủy vài phút Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch

f Định tính coumarin

Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi trong 5 phút Lọc nóng Dịch lọc thu được để làm phản ứng

- Phản ứng mở, đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết

Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để nguyên Đun sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội Quan sát hiện tượng, phản ứng dương tính khi:

Ống 1: Dung dịch có tủa vàng hoặc tủa đục có màu vàng

Ống 2: Trong

15

Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất Lắc đều, thấy:

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2

- Phản ứng Diazo hóa: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó 2ml

dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ gạch

- Quan sát huỳnh quang: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ trên ngọn lửa

đèn cồn cho khô Nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%, hơ cho khô Bịt một nửa phần giấy lọc thấm dịch chiết bằng tấm kim loại và đặt tấm giấy lọc dưới ánh sáng UV trong vòng 10 phút Phản ứng dương tính khi bỏ miếng kim loại ra và quan sát dưới đèn UV thấy phần giấy lọc thấm dịch chiết không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che, tiếp tục đặt giấy lọc dưới ánh sáng UV mà không bị che miếng kim loại

k Định tính acid hữu cơ

Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2CO3 Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí

Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất, đun sôi cách thủy

5 phút, lọc nóng Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy 10 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu tím

17

n Định tính polysaccharide

Lấy khoảng 2g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi cách thủy vài phút, lọc lấy dịch; cho vào 2 ống nghiệm:

- Ống 1: 4ml dịch lọc + 5 giọt thuốc thử Lugol

- Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu nâu đỏ ở ống 1

o Định tính bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC

- Chuẩn bị dịch chiết

+ Dịch chiết MeOH: Cân khoảng 1,0g bột Bồ kết cho vào bình nón 100ml, cho 20

ml MeOH vào và chiết siêu âm 30 phút Lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc trong, cô dịch chiết còn khoảng 2 ml để chấm sắc ký

+ Dung dịch đối chiếu: Lấy khoảng 1,0mg chất đối chiếu Vitexin, hòa tan hoàn toàn trong 10ml MeOH, cô cách thủy còn 2 ml để chấm sắc ký

+ Hệ dung môi khai triển: Khảo sát ít nhất là 3 hệ dung môi

- Tiến hành

Thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC - CAMAG LINOMAT

+ Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng Silicagel 60F254 tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở

110oC trong 1 giờ, bảo quản trong bình hút ẩm

+ Pha động: Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất được tách tốt nhất [41]

+ Bình sắc ký rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và kín mặt thành trong của bình, đưa vào hệ thống, đậy kín nắp

18

+ Bão hòa dung môi: Rót dung môi đã pha vào hệ thống, cài đặt chế độ bão hòa dung môi

+ Chấm sắc ký: Sử dụng hệ thống chấm sắc ký lớp mỏng CAMAG LINOMAT 5 Lấy một thể tích mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống bơm mẫu tự động Lập tập tin quản lý cho mỗi mẫu phân tích Nhập các thông số cần thiết: độ rộng vết, số lượng vết, thể tích mẫu chấm

+ Triển khai sắc ký: Đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín, để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt

+ Quan sát, chụp ảnh và phân tích sắc ký bằng phần mềm winCATS và VideoScan dưới ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm trước và sau khi phun thuốc thử hiện màu vanilin trong ethanol 96%

2.2.2.2 Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn

1kg quả bồ kết bỏ hạt, nghiền thô, chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%; cất thu hồi dung môi, hòa cắn vào nước, lần lượt lắc phân đoạn với các dung môi (n-hexane, dicloromethane, ethyl acetate, n-butanol, nước) Cất thu hồi dung môi các phân đoạn được cao n-hexane, cao dicloromethane, cao ethyl acetate, cao n-butanol và

cao nước

19

Hình 2 1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và cao toàn phần

Bột dƣợc liệu

Chiết với ethanol 70%

Dịch chiết toàn phần Bã nguyên liệu (loại bỏ)

20

2.2.2.3 Phân lập các hợp chất chính

Tiến hành sắc ký cột silicagel đối với cao phân đoạn ethyl acetate, rửa giải bằng hệ dung môi dicloromethane – methanol Sử dụng sắc ký cột silicagel pha thường để phân lập các phân đoạn, cột Sephadex LH-20 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng TLC Silicagel 60 GF254 (Merck) nhằm theo dõi vết các chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch vanilin trong ethanol 96%

a Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo

- Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3 lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập

- Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách

Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột:

- Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó, làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột

- Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

b Sắc ký lớp mỏng (TLC)

21

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng Trong

đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Sắc ký lớp mỏng được dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lượng Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng

2.2.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, ) và dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS), cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố

Trên thân non có lông che chở và các nốt sần màu vàng Lá kép lông chim 2 lần chẵn, cuống chung có lông và có rãnh dọc, có từ 6 đến 8 đôi lá chét mọc đối hoặc so le, phiến lá hình trứng lệch, dài trung bình 25mm, rộng 15mm, mặt trên của lá có màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn Gân lá hình lông chim, mép lá có khía răng cưa nhỏ (Hình 3.2) Hoa màu trắng, đều, đơn tính và lưỡng tính cùng gốc, mọc thành chùm ở kẽ lá và đầu cành Hoa có 5 lá đài phân, 5 cánh hoa rời nhau Hoa đơn tính đực có 10 nhị rời, hoa lưỡng tính có 5 nhị Bầu thượng có 2 lá noãn rời (Hình 3.3)

Hình 3 1Thân và cành mang hoa lá của cây Bồ kết tại thực địa

(Thôn 84 - xã Kim Quan - huyện Thạch Thất - Hà Nội)

23

Hình 3 2Một số đặc điểm hình thái lá Bồ kết (1) Cành mang hoa lá; (2)(3) Lá kép lông chim 2 lần; (4) Cành non; (5) Cuống lá chung;

(6) Lá chét

Hình 3 3 Một số đặc điểm hình thái hoa Bồ kết (1) Hoa mọc kẽ lá; (2) Cụm hoa chùm; (3) Hoa đực; (4) Hoa cái; (5) Tràng hoa; (6) Đài

hoa; (7) Bộ nhị; (8) Bộ nhụy