Để thực hiện được các mục tiêu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm những nội dung chính sau (sơ đồ 2.1):
Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của dược liệu
- Khảo sát động học enzym để xác định thời gian ngừng phản ứng và hoạt độ enzym phù hợp.
- Xác định IC50 của acarbose .
Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết dược liệu lên enzym alpha glucosidase ở 3 nồng độ 5000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL.
Xác định IC50 của Acarbose và các dược liệu tiềm năng.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của dƣợc liệu
2.3.1.1. Nguyên tắc
Hoạt tính ức chế của dịch chiết dược liệu trên enzym alpha glucosidase sẽ được đánh giá dựa trên khả năng ức chế phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl α-D-glucopyranosid (pNPG) của enzym này.
Bình thường enzym alpha glucosidase xúc tác chuyển pNPG thành p-nitrophenol có màu vàng:
Do đó có thể đánh giá khả năng hoạt động của enzym thông qua việc xác định lượng sản phẩm p-nitrophenol tạo ra bằng cách đo quang ở bước sóng 415 nm [37].
2.3.1.2. Chuẩn bị hoá chất dụng cụ
- Đệm kali phosphat 50mM, pH=6,8
- Enzym alpha glucosidase được pha về các hoạt độ khác nhau 2U/mL ; 1U/mL ; 0,5U/mL; 0,1 U/mL bằng đệm potassium phosphat 50mM pH=6,8. Bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
- Dung dịch pNPG 3mM
- Chứng dương acarbose được pha về các nồng độ 1200 µg/mL; 1000 µg/mL; 800 µg/mL; 600 µg/mL; 400 µg/mL.
2.3.1.3. Khảo sát động học enzym
Để xác định được hoạt độ enzym và thời gian ngừng phù hợp, tiến hành khảo sát động học enzyme ở 4 hoạt độ khác nhau 2U/mL ; 1U/mL ; 0,5U/mL; 0,1 U/mL trong 60 phút.
Sơ đồ 2.2: Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym
Giếng trắng và giếng thử được bố trí theo từng cặp. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá bằng cách vẽ đồ thị sự phụ thuộc giữa thời gian và độ hấp thụ A ở các hoạt độ khác nhau của enzym. Từ đó lựa chọn thời gian ngừng phản ứng phù hợp và hoạt độ enzym để tiến hành làm thí nghiệm.
2.3.1.4. Đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của acarbose
Tác dụng ức chế alpha glucosidase của acarbose được tiến hành ở các nồng độ khác nhau 1200 µg/mL; 1000 µg/mL; 800 µg/mL; 600 µg/mL; 400 µg/mL. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Hỗn hợp gồm 80 µL đệm phosphat, 20 µL dung dịch enzym 0,1 U/mL và 20 µL dung dịch acarbose được tiền ủ ở 37°C trong 10
phút. Thêm 20 µL dung dịch pNPG 3mM, ủ ở 37°C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng dung dịch Na2CO3 0,1M. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 415nm (Sơ đồ 2.2).
Sơ đồ 2.3:Quy trình đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của acarbose.
Mẫu chứng (Control) là mẫu không chứa acarbose.
Ứng với mỗi nồng độ mẫu thử có một giếng trắng. Giếng trắng tương tự như mẫu thử nhưng thể tích enzym được thay bằng đệm phosphat tương ứng. Kết quả được đánh giá như sau:
- Công thức tính % ức chế
Giá trị % ức chế là trung bình % I của 3 lần.
2.3.2. Áp dụng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của dƣợc liệu
Enzym alpha glucosidase được hòa tan trong đệm phosphat 50mM, pH=6,8 để thu được dung dịch enzym có hoạt độ 0,1 U/mL. Cơ chất pNPG được pha về nồng độ 3mM bằng dung dịch đệm phosphat. Cao dược liệu được pha về các nồng độ khác nhau 500, 1000, 5000 µg/mL bằng dung môi DMSO 10%.
Thí nghiệm được thiết kế và tiến hành tương tự như thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của Acarbose: Hỗn hợp gồm 80 µL đệm phosphat, 20µL dung dịch enzym 0,1 U/mL và 20µL cao dược liệu được tiền ủ ở 37°C trong 10 phút. Thêm 20µL dung dịch pNPG 3mM, ủ ở 37°C trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng dung dịch Na2CO3 0,1M. Đo độ hấp thu ở bước sóng 415nm. Acarbose nồng độ 800 µg/mL được sử dụng làm chứng dương. Thể tích các hóa chất được mô tả trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính.
Thể tích Control Mẫu DL (µg/mL) Trắng Thử Trắng Thử ở 3 nồng độ khác nhau Đệm 100 80 80 60 Mẫu thử - - 20 20 Enzyme - 20 - 20 pNPG 20 20 20 20 Na2CO3 80 80 80 80 Tổng thể tích 200 200 200 200
Đánh giá kết quả: % ức chế được xác định như công thức (1)
2.3.3. Xác định IC50 của các dƣợc liệu tiềm năng
Giá trị IC50 được định nghĩa là nồng độ dịch chiết mà tại đó ức chế 50% hoạt tính enzym alpha glucosidase trong điều kiện thí nghiệm.
Căn cứ vào kết quả thử hoạt tính ức chế ở trên, các dược liệu có khả năng ức chế tốt enzym alpha-glucosidase được tiếp tục xác định IC50. Mỗi dược liệu được thử ở 5 nồng độ trong khoảng phù hợp.
2.3.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Excel 2010 và SPSS 20. Các giá trị được biểu diễn dưới dạng M ± SD (trong đó M là giá trị trung bình)
Giá trị IC50 được xác định bằng phương pháp phân tích hồi quy từ đồ thị sự phụ thuộc giữa nồng độ dịch chiết dược liệu và % ức chế.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Kết quả
3.1.1. Kết quả xây dựng phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế alpha glucosidase của dƣợc liệu
3.1.1.1. Kết quả khảo sát động học enzym
Động học enzym alpha glucosidase được khảo sát ở 4 hoạt độ 2U/mL; 1U/mL; 0,5U/mL; 0,1 U/mL. Đo độ hấp thụ (A) một cách liên tục trong vòng 60 phút ở các thời điểm 0,1, 3, 6,9,...,60 phút tại bước sóng 415nm. Kết quả thu được như hình 3.1:
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lƣợng p-nitrophenol tạo ra (thông qua A) theo thời gian với các hoạt độ enzym khác nhau.
Nhận xét:
Trong các hoạt độ được khảo sát nhận thấy tại hoạt độ 0,1U/ml đạt được các yêu cầu đề ra như khả năng xúc tác tốt, lượng p- nitrophenol tạo ra tuyến tính theo thời gian ở khoảng 15 phút đầu, mật độ quang đo được nằm trong khoảng thích hợp.
3.1.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của acarbose
Tác dụng ức chế alpha glucosidase của acarbose được tiến hành ở các nồng độ khác nhau 1200 µg/mL; 1000 µg/mL; 800 µg/mL; 600 µg/mL; 400 µg/mL. Mỗi nồng độ được làm thí nghiệm 3 lần. Kết quả được thu được được biểu diễn trong hình 3.2 và bảng 3.1:
Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của acarbose ở các nồng độ khác nhau Nồng độ Hoạt tính ức chế (%) 1200 µg/mL 72,6 ± 1,18 1000 µg/mL 60,2 ± 2,30 800 µg/mL 48,9 ± 2,11 600 µg/mL 30,4 ± 1,10 400 µg/mL 22,1 ± 1,47
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế alpha glucosidase của acarbose ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét:
Kết quả trong bảng 3.1 và hình 3.2 cho thấy acarbose thể hiện hoạt tính ức chế alpha glucosidase rõ rệt. Khả năng ức chế alpha glucosidase tăng khi nồng độ acarbose tăng. Từ kết quả phân tích prohibit, giá trị IC50 của acarbose thu được là 802 µg/ml (733-855 µg/ml).
3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của dƣợc liệu
3.1.2.1. Khả năng ức chế alpha glucosidase của Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult
Khả năng ức chế alpha glucosidase của cắn dịch chiết các mẫu Gymnema sylvestre được thử nghiệm ở 3 mức nồng độ 5000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL. Mỗi nồng độ được làm thí nghiệm 3 lần. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình, kết quả tập hợp trong bảng 3.2 và hình 3.3: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 % Ức chế Nồng độ µg/mL
Bảng 3.2: Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema sylvestre
(Retz.) R.Br. ex Schult
Mã mẫu
Hoạt tính ức chế của dƣợc liệu (%)
5000 µg/mL 1000mL 500 µg/mL GS1 88,3 ± 2,28 60,7 ± 3,08 46,5 ± 3,67 GS2 22,7 ± 0,99 2,6 ± 1,52 9,5 ± 4,60 GS3 - - - GS4 52,4 ± 2,47 18,6 ± 1,80 4,8 ± 1,72 GS5 28,4 ± 2,00 34,6 ± 0,94 24,9 ± 5,45 GS6 39,9 ± 2,62 9,2 ± 1,78 27,1 ± 1,67 - Không có khả năng ức chế
(Retz.) R.Br. ex Schult
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy trong số 6 mẫu Gymnema sylvestre thu hái từ 5 địa phương khác nhau có 5 mẫu có tác dụng ức chế alpha glucosidase và 1 mẫu không thể hiện khả năng ức chế ở các nồng độ nghiên cứu. Mẫu không thể hiện khả năng ức chế là mẫu GS3, được thu hái ở Quảng Ninh. Trong số 5 mẫu có hoạt tính thì mẫu GS1, loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult hoa đỏ thu hái tại Thái Nguyên, có hoạt tính ức chế alpha glucosidase lớn nhất. Khả năng ức chế enzym của loài này cũng tỷ lệ thuận với nồng độ dịch chiết (46,5 ± 3,67%, 60,7 ± 3,08%, 88,3 ± 2,28%).
3.1.2.2. Khả năng ức chế alpha glucosidase của Gymnema yunnanense Tsiang
Khả năng ức chế alpha glucosidase của cắn dịch chiết các mẫu Gymnema yunnanense Tsiang được thử nghiệm ở 3 mức nồng độ 5000 µg/mL, 1000 µg/mL,
500 µg/mL. Mỗi nồng độ được làm thí nghiệm 3 lần. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình, kết quả tập hợp trong bảng 3.3 và hình 3.4:
Bảng 3.3: Hoạt tính ức chế alphaglucosidase của các mẫu Gymnema yunnanense Tsiang
Mã mẫu
Hoạt tính ức chế của dƣợc liệu (%)
5000 µg/mL 1000 µg/mL 500 µg/mL GY1 83,8 ± 3,14 45,9 ± 4,64 22,1 ± 1,00 GY2 - - 5,2 ± 1,68 GY3 3,7 ± 0,59 4,3 ± 0,79 5,1 ± 0,39 GY4 1.0 ± 1.3166 2.6 ± 2,2843 - GY5 97,7 ± 0,08 57,7 ± 2,02 47,6 ± 1,97 - : Không có khả năng ức chế
Hình 3.4: % ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema yunnanense
Tsiang
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.3 và hình 3.4 cho thấy cả 5 mẫu Gymnema yunnanense thu hái từ 3 địa phương khác nhau đều có tác dụng ức chế alpha glucosidase ở nồng độ nghiên cứu. Trong số đó, 2 mẫu GY2 và GY4 thu hái tại Gia Lai chỉ có hoạt tính ức chế rất thấp, trong khi đó 2 mẫu GY1 và GY5 thu hái tại Kon Tum có hoạt tính ức chế khá cao và khả năng ức chế enzym tỷ lệ thuận với nồng độ dịch chiết (hoạt tính ức chế của GY1 lần lượt là: 22,1 ± 1,00%, 45,9 ± 4,64%, 83,8 ± 3,14% còn của GY5 lần lượt là: 47,6 ± 1,97%, 57,7 ± 2,02%, 97,7 ± 0,08%).
3.1.2.3. Khả năng ức chế alpha glucosidase của Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Khả năng ức chế alpha glucosidase của cắn dịch chiết các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight được thử nghiệm ở 3 mức nồng độ 5000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL. Mỗi nồng độ được làm thí nghiệm 3 lần. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình, kết quả tập hợp trong bảng 3.4 và hình 3.5:
Bảng 3.4: % ức chế alphaglucosidase của các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Mã mẫu
Hoạt tính ức chế của dƣợc liệu (%)
5000 µg/mL 1000 µg/mL 500 µg/mL GL1 5,9 ± 0,88 - 2,9 ± 0,88 GL2 8,9 ± 1,18 7,5 ± 1,18 25,6 ± 0,23 GL3 - 13,73 ± 3,68 30,1 ± 4,33 GL4 72,9 ± 1,89 35,0 ± 1,89 22,4 ± 1,42 GL5 - - - - : Không có khả năng ức chế
Hình 3.5: % ức chế alphaglucosidase của các mẫu Gymnema latifolium
Wall. ex Wight 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 I% 5000 µg/ml1000 µg/ml 500 µg/ml
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.4 và hình 3.5 cho trong số 5 mẫu Gymnema latifoliumthu hái từ 5 địa phương khác nhau chỉ có mẫu GL5 thu hái ở Tuyên Quang là không thể hiện hoạt tính ức chế ở các nồng độ nghiên cứu. Mẫu GL4 thu hái tại thái nguyên có hoạt tính ức chế mạnh nhất và hoạt tính ức chế tỷ lệ thuận với nồng độ (22,4 ± 1,42%, 35,0 ± 1,89%, 72,9 ± 1,89%)
3.1.2.4. Khả năng ức chế alpha glucosidase của Gymnema inodorum (Lour.) Decne
Khả năng ức chế alpha glucosidase của cắn dịch chiết các mẫu Gymnema inodorum được thử nghiệm ở 3 mức nồng độ 5000 µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL. Mỗi nồng độ được làm thí nghiệm 3 lần. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình, kết quả tập hợp trong bảng 3.4 và hình 3.6:
Bảng 3.5: Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema inodorum
(Lour.) Decne Wight
Mã mẫu
Hoạt tính ức chế của dƣợc liệu (%)
5000 µg/mL 1000 µg/mL 500 µg/mL GI1 42,5 ± 2,83 22,2 ± 0,82 15,7 ± 1,30 GI2 - 6,0 ± 2,75 24,7 ± 1,02 GI3 20,1 ± 1,19 11,6 ± 0,64 22,3 ± 2,11 GI4 96,6 ± 0,65 27,7 ± 0,70 9,2 ± 0,10 - : Không có khả năng ức chế
Hình 3.6: Hoạt tính ức chế alphaglucosidase của các mẫu Gymnema inodorum
(Lour.) Decne Wight
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.5 và hình 3.6 cho thấy cả 4 mẫu Gymnema inodorum thu hái từ 4 địa phương khác nhau đều có tác dụng ức chế alphaglucosidase ở nồng độ 500 µg/mL và 1000 µg/mL. Trong số đó, mẫu GI2 thu hái tại Vĩnh Phúc chỉ có hoạt tính ức chế tốt nhất ở nồng độ 500 µg/mL (24,7 ± 1,02%) và hoạt tính ức chế giảm khi tăng nồng độ. Mẫu GI4 thu hái tại Hòa Bình thì có hoạt tính ức chế cao nhất và khả năng ức chế enzym tỷ lệ thuận với nồng độ dịch chiết (9,2 ± 0,10%, 27,7 ± 0,70%, 96,6 ± 0,65%).
3.1.3. Kết quả xác định IC50 của các mẫu dƣợc liệu tiềm năng.
Căn cứ vào kết quả sàng lọc ở trên, các mẫu dược liệu có khả năng ức chế tốt được tiến hành xác định IC50. Mỗi mẫu dược liệu được thử 5 nồng độ trong khoảng nồng độ phù hợp. IC50 được xác định sử dụng thuật toán probit của phần mềm SPSS. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.7.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
GI1 GI2 GI3 GI4
I% 5000 µg/ml1000 µg/ml
Bảng 3.6: IC50 của các dƣợc liệu và Acarbose Mẫu IC50 (µg/mL) Mẫu IC50 (µg/mL) Acarbose 802 (733-885) GI1 6228 (5630-6827) GY1 2164 (1979-2349) GL4 3281 (2487 - 3452) GY5 640 (451-830) GS1 463 (272-654) GI4 2412 (2343-2482) GS4 4576 (4276-4876)
() : Giới hạn trên và giới hạn dưới của kết quả.
Hình 3.7: IC50 của các dƣợc liệu và Acarbose Nhận xét:
Kết quả bảng 3.6 và hình 3.7 cho thấy trong số các mẫu dược liệu có hoạt tính ức chế enzym glucosidase, mẫu GS1 Gymnema sylvestre (Retz.) ex Schult thu hái tại Thái Nguyên (IC50 = 463) và mẫu GY5 Gymnema yunnanense Tsiang thu hái tại Kontum (IC50 = 640) là những dược liệu có hoạt tính ức chế enzym glucosidase
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 IC50 (µg/mL) IC50
mạnh nhất với IC50 nhỏ hơn so với chứng dương acarbose
3.2. Bàn luận.
3.2.1. Về phƣơng pháp nghiên cứu
Hiện nay, để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym alpha glucosidase có khá nhiều protocol khác nhau. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym đều dựa trên nguyên tắc chung là định lượng gián tiếp thông qua sản phẩm thủy phân sinh ra từ phản ứng giữa enzym và cơ chất. Cơ chất ở đây có thể sử dụng như pNPG, maltose. Sản phẩm tạo ra được định lượng bằng phương pháp đo quang thông thường trên sắc kí lớp mỏng, qua cuvet hoặc sử dụng đĩa 96 giếng và hệ thống máy Elisa. Ngoài ra, gần đây Sony Pandey và cộng sự đã xây dựng phương pháp mới sử dụng dung dịch enzym –agar trên đĩa petri, nhỏ mẫu thử trên bề mặt thạch và đo vòng tròn ức chế, phương pháp này được sử dụng trên các dịch chiết từ vi sinh vật [33]. Để tăng được số mẫu thử trong cùng một khoảng thời gian và giúp tiết kiệm chi phí đề tài sử dụng phương pháp đánh giá hoạt tính enzym thông qua việc định lượng p-nitrophenol bằng đo quang trên đĩa 96 giếng, kĩ thuật này cũng được đa phần các tác giả trên thế giới lựa chọn.
Enzym có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau, từ động vật có vú như lợn, thỏ hoặc chuột hoặc từ nấm men. Tuy nhiên trên thị trường hiện nay chỉ có sẵn các loài enzym từ nấm men như Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisia