Phân lập carpain và khảo sát hàm lượng carpain trong một số mẫu lá đu đủ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CAO THỊ THU HẰNG PHÂN LẬP CARPAIN VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CARPAIN TRONG MỘT SỐ MẪU LÁ ĐU ĐỦ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI CAO THỊ THU HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1401189 PHÂN LẬP CARPAIN VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CARPAIN TRONG MỘT SỐ MẪU LÁ ĐU ĐỦ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Chi Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI - 2019 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đu đủ (Carica papaya L.) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Nguồn gốc phân bố .2 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Hoạt tính sinh học 1.2 Hợp chất carpain .9 1.2.1 Công thức cấu tạo số tính chất vật lý .9 1.2.2 Tác dụng sinh học 1.2.3 Một số nghiên cứu phân lập carpain 10 1.2.4 Một số phương pháp định lượng carpain Đu đủ 11 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu .13 2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế carpain từ Đu đủ .15 2.3.2 Xây dựng liệu nhận dạng carpain tinh chế 17 2.3.3 Xây dựng thẩm định phương pháp HPTLC để bán định lượng carpain mẫu Đu đủ 17 2.3.4 Áp dụng phương pháp HPTLC để khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu miền bắc Việt Nam 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Phân lập carpain từ Đu đủ 20 3.1.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế carpain từ Đu đủ .20 3.1.2 Xây dựng liệu nhận dạng carpain tinh chế 21 3.2 Khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu miền bắc Việt Nam .23 3.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp 23 3.2.2 Thẩm định phương pháp HPTLC xây dựng 24 3.2.3 Áp dụng phương pháp HPTLC xây dựng thẩm định để khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu hái miền bắc Việt Nam 27 3.3 Bàn luận 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận bảo tận tình, quan tâm từ thầy cơ, gia đình bạn bè Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Quỳnh Chi, người thầy dành nhiều thời gian, tâm huyết để hướng dẫn tơi, ln hết lòng lắng nghe, quan tâm, động viên tơi vượt qua khó khăn q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng cảm tạ biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh, người thầy nghiêm khắc rèn giũa để tơi có lối tư phương pháp làm việc khoa học, người gợi mở hướng nghiên cứu, đưa lời khuyên hữu ích học tập sống Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu nói riêng Trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, người ln sẵn sàng chia sẻ kinh nghiệm, cho lời khuyên, giúp đỡ động viên kịp thời suốt trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể anh chị, bạn bè em đồng hành suốt khoảng thời gian học tập trường, chia sẻ khó khăn học tập sống Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn u thương tới gia đình tơi, người chỗ dựa tinh thần vững nhất, tiếp thêm động lực để cố gắng trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Cao Thị Thu Hằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT 13 C-NMR: H-NMR: Carbon-13 nuclear magnetic resonance Proton nuclear magnetic resonance AcOH: Acid acetic AOAC: Association of Official Analytical Chemists COSY: Correlation Spectroscopy DEPT: Distotionless Enhancement by Polarization Transfer EtOAc: Ethyl acetat HMBC: Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation IR: Infrared Radiation MeOH: Methanol MS: Mass Spectrometry NMR: Nuclear Magnetic Resonance Rf: Retention factor RSD: Độ lệch chuẩn tương đối SD: Độ lệch chuẩn TT: Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Khảo sát hệ dung môi sắc ký 23 Bảng 3.2 Kết thẩm định khoảng tuyến tính carpain 25 Bảng 3.3 Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống .26 Bảng 3.4 Kết khảo sát hàm lượng carpain mẫu Đu đủ 28 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo số alcaloid phân lập từ Đu đủ Hình 1.2 Công thức cấu tạo carpain .9 Hình 2.1 Cây Đu đủ (Carica papaya L.) 13 Hình 2.2 Sơ đồ trình chiết xuất, phân lập, tinh chế carpain 16 Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ chất phân lập 20 Hình 3.2 So sánh với chất đối chiếu carpain 21 Hình 3.3 Hình ảnh tinh thể thu 21 Hình 3.4 Tinh thể quan sát kính hiển vi .21 Hình 3.5 Cơng thức cấu tạo carpain .22 Hình 3.6 Thẩm định độ đặc hiệu 24 Hình 3.7 Đồ thị mơ tả tương quan diện tích pic lượng carpain vết 25 Hình 3.8 Thẩm định độ thích hợp hệ thống 26 Hình 3.9 Sắc ký lớp mỏng dãy dung dịch đối chiếu mẫu Đu đủ 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Đu đủ trồng phổ biến Việt Nam nhiều nước nhiệt đới khác với mục đích lấy Các phận khác thường xem phụ phẩm không nhận nhiều quan tâm Trong đó, nhiều nghiên cứu tiến hành cho thấy dịch chiết Đu đủ có tác dụng tốt với nhiều bệnh nguy hiểm ung thư, đái tháo đường, tăng huyết áp Dược liệu sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị sốt xuất huyết Một thử nghiệm lâm sàng Ấn Độ năm 2016 chứng minh tác dụng [35] Đồng thời, hầu hết nghiên cứu khơng phát thấy độc tính dịch chiết Đu đủ Carpain, alcaloid Đu đủ, cho đóng vai trò quan trọng đa số tác dụng phận Đồng thời carpain xem chất đặc trưng có Đu đủ Do đó, lựa chọn carpain marker để đánh giá chất lượng, xây dựng tiêu chuẩn cho Đu đủ chế phẩm liên quan cần thiết Tuy nhiên, thị trường chưa có cơng ty cung cấp chất chuẩn carpain chưa có nghiên cứu khảo sát hàm lượng carpain mẫu Đu đủ thu hái nhiều vùng Việt Nam Vì vậy, đề tài “Phân lập carpain khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ” tiến hành với hai mục tiêu: Phân lập carpain từ Đu đủ làm chất đối chiếu Khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu miền bắc Việt Nam HPTLC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đu đủ (Carica papaya L.) 1.1.1 Vị trí phân loại Theo Hệ thống phân loại Takhtajan [64], vị trí phân loại Đu đủ Carica papaya L tóm tắt sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Đu đủ (Caricales) Họ: Đu đủ (Caricaceae) Chi: Carica Loài: Carica papaya L 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây cao 2-10 m, thân mềm, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to cuống rụng để lại Lá mọc so le, có cuống dài rỗng, phiến to 60-80 cm, xẻ chân vịt, gồm 8-9 thùy sâu, thùy lại khía thêm bị xẻ rách Hoa màu vàng lục nhạt, mọc kẽ lá; hoa đực hoa gốc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh, đài hợp có ngắn, tràng cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành vòng ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa có 2-3 hoa, đài tràng gồm phận dính gốc, khơng có nhị lép, bầu ơ, nhiều nỗn Quả mọng to, hình trứng ngược thn dài, chín màu vàng đỏ, thịt dày, ruột có nhiều hạt màu đen [2], [3], [5] 1.1.3 Nguồn gốc phân bố Mặc dù chưa biết xác, Đu đủ cho có nguồn gốc từ vùng đất thấp phía nam Mexico qua miền đông Trung Mỹ bắc Nam Mỹ Cây có lẽ người Tây Ban Nha đưa vào Philippines vào khoảng năm 1550 [5], [39], [55] Rồi PHỤ LỤC BỘ DỮ LIỆU PHỔ - Phổ khối ESI-MS - Phổ hồng ngoại IR - Phổ 1H-NMR - Phổ 13C-NMR - Phổ DEPT135 - Phổ COSY - Phổ HSQC - Phổ HMBC - - - ... vậy, đề tài Phân lập carpain khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ tiến hành với hai mục tiêu: Phân lập carpain từ Đu đủ làm chất đối chiếu Khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu miền... đề tài phân lập carpain từ Đu đủ khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ, nội dung nghiên cứu bao gồm bước sau: - Chiết xuất, phân lập tinh chế carpain từ Đu đủ - Xây dựng liệu nhận dạng carpain. .. để khảo sát hàm lượng carpain số mẫu Đu đủ thu miền bắc Việt Nam 18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Phân lập carpain từ Đu đủ 20 3.1.1 Chiết xuất, phân lập