ĐINH THỊ NGỌC ANH NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và KHẢO sát hàm LƯỢNG NYSTOSE của BA KÍCH tại tây GIANG, QUẢNG NAM KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Nhằm bước đầu nghiên cứu về đa dạng và chất lượng của cây Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát hàm lượng nystose của Ba kích tại Tây Giang,

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE

CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG,

QUẢNG NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ NGỌC ANH

MÃ SINH VIÊN: 1401016

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NYSTOSE

CỦA BA KÍCH TẠI TÂY GIANG,

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân đối với Ban giám hiệu cùng các thầy cô bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và chỉ bảo tận tình em trong quá trình thực hiện đề tài

Đặc biệt với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân

thành đến TS Hoàng Quỳnh Hoa và DS Phạm Thị Linh Giang, người đã dìu dắt,

động viên, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em xin cảm ơn các chị kỹ thuật viên và các bạn sinh viên khóa 69 cùng nghiên cứu tại bộ môn đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực nghiệm

Con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ, khích lệ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt 5 năm học và trong thời gian thực hiện khóa luận này

Sau cùng, em xin kính chúc các thầy, các cô trong bộ môn Thực Vật thật dồi dào sức khỏe, công tác tốt

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Đinh Thị Ngọc Anh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về loài Ba kích Morinda officinalis How 2

1.1.1 Đa dạng sinh học 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Thành phần hóa học của rễ Ba kích 2

1.1.4 Tác dụng sinh học 3

1.1.5 Công dụng theo Y học cổ truyền 4

1.1.6 Tổng quan về nystose 5

1.1.6.1 Công thức phân tử 5

1.1.6.2 Tính chất của nystose 5

1.1.6.3 Tác dụng sinh học 5

1.1.6.4 Một số phương pháp xác định hàm lượng nystose trong rễ Ba kích 6

1.2 Một số nghiên cứu về cây Ba kích tại Việt Nam 6

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 9

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 9

2.1.2 Dung môi, hóa chất 9

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 10

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 11

2.3.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu 11

2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm bột rễ 11

2.3.4 Giám định tên khoa học 11

2.3.5 Xây dựng và thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC 12

2.3.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng 12

2.3.5.3 Bán định lượng hàm lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Kết quả thực nghiệm 17

3.1.1 Đặc điểm hình thái 17

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2 18

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4 19

3.1.1.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6 20

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 21

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 21

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân 22

3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu rễ 24

3.1.3 Đặc điểm bột rễ 26

3.1.4 Giám định tên khoa học 28

3.1.5 Bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC 28

3.1.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC 28

3.1.5.2 Thẩm định phương pháp bán định lượng Nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC 29

3.1.5.3 Bán định lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích 33

3.3 Bàn luận 34

3.3.1 Hình thái thực vật 34

3.3.2 Bán định lượng và thẩm định phương pháp 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

AOAC Association of Official Analytical Chemists – Hiệp hội các nhà

hóa phân tích chính thống

DĐVN Dược điển Việt Nam

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

ELSD Evaporative Light Scattering Detector- Detector tán xạ bay hơi

HPLC High Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng

cao

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography- Sắc

ký lớp mỏng hiệu năng cao

ITS Internal Transcribed Spacer- Vùng phiên mã bên trong

RADP Random Amplified Polymorphic DNA- Đa hình phân đoạn ADN

nhân bản ngẫu nhiên

rDNA Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid

Rf Retention factor- Hệ số lưu giữ

RSD Relative Standard Deviation- Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng

UV- VIS Bức xạ tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Ký hiệu của các mẫu Ba kích 9

Bảng 3.1 Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu lá các mẫu Ba kích 22

Bảng 3.2 Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu thân các mẫu Ba kích 24

Bảng 3.3 Kết quả tỷ lệ Spic m cân của các dung môi chiết 29

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính 31

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại 33

Bảng 3.7 Kết quả bán định lượng hàm lượng Nystose trong các mẫu nghiên cứu 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của nystose 5

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2 18

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4 19

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6 20

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá BK4 21

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân BK6 23

Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu rễ BK4 25

Hình 3.7 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK2 26

Hình 3.8 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK4 27

Hình 3.9 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK6 27

Hình 3.10 Hình ảnh bản mỏng của các hệ dung môi triển khai trên TLC sau khi phun thuốc thử 28

Hình 3.11 Kết quả chồng pic của 3 mẫu: chuẩn, thử, trắng 31

Hình 3.12 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và lượng chất của nystose 32

Hình 3.13 Đặc điểm hình thái rễ của các mẫu Ba kích 35

Hình 3.14 Đặc điểm hình thái thân của các mẫu Ba kích 36

Hình 3.15 Đặc điểm hình thái lá kèm của các mẫu Ba kích 36

Hình 3.16 Đặc điểm hình thái lá của các mẫu Ba kích 37

Hình 3.17 Đặc điểm hình thái cụm hoa của các mẫu Ba kích 38

Hình 3.18 Đặc điểm hình thái tràng hoa của các mẫu Ba kích 38

Hình 3.19 Đặc điểm hình thái bộ nhụy của các mẫu Ba kích 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ba kích là một trong những cây thuốc quý được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu đời và được biết đến là có nhiều công dụng như bổ thận dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể [19] Ngày nay, nhu cầu sử dụng Ba kích trong đời sống hàng ngày cũng như trong các chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ dược liệu ngày một tăng với mức trên 205 tấn/ năm [16] Cũng chính vì nhu cầu sử dụng tăng vọt đã giúp cho Ba kích giờ đây không chỉ là vị thuốc dân gian,

sử dụng nhỏ lẻ mà vươn lên thành cây chủ lực, là nguồn nguyên liệu, dược liệu quý

để sản xuất dược phẩm, phát triển nền kinh tế địa phương Theo dải phân bố tự nhiên, cây Ba kích mọc hoang trong rừng thưa hoặc rừng thứ sinh, hay gặp ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Quảng Ninh, Lạng Sơn, Yên Bái, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Thanh Hóa Thời gian gần đây, một số giống ba kích đã được phát hiện và trồng trọt ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam Việt Nam như Quảng Trị, Quảng Nam

và Phú Yên

Tại huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam cây Ba kích bản địa sinh trưởng và phát triển tốt ở vành đai ôn đới ở độ cao trên 700m, khác biệt so với Ba kích ở các vùng miền núi phía Bắc mọc ở độ cao gần so với mực nước biển (< 500m) Đồng thời, qua khảo sát ban đầu nhận thấy các giống Ba kích tại Tây Giang tương đối đa dạng và có một số đặc điểm khác với cây Ba kích tại miền Bắc Mặt khác, tại địa phương, cây Ba kích từ rừng đã được người dân Cơ Tu nhân giống và trồng trọt, đem lại giá trị kinh tế cao và được chính quyền địa phương chú trọng phát triển các sản phẩm từ cây Ba kích trong khuôn khổ dự án OCOP (Mỗi làng xã một sản phẩm) Nhằm bước đầu nghiên cứu về đa dạng và chất lượng của cây Ba kích tại Tây Giang,

Quảng Nam, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát hàm lượng nystose của Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam” đã được tiến hành với những

mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm hình thái, vi học và giám định tên khoa học của một số mẫu

Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam

- Xây dựng phương pháp bán định lượng và xác định hàm lượng nystose trong

rễ mẫu Ba kích tại Tây Giang, Quảng Nam

cả ở Trung Quốc [7], [8], [19]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Morinda officinalis How., họ Cà phê: Rubiaceae

Tên thường gọi: Ba kích

Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, Dây ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thau tày cáy (Tày), Chồi hoàng kim, Sáy cáy (Thái), Chày kiang dòi (Dao), Ba kích nhục, Liên châu ba kích, Medicinal indian Mulberry (Anh) [17], [19]

Cây thảo sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét, sống lâu năm Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi Thân non

có cạnh, màu tím, có lông, sau nhẵn bóng Lá mọc đối, phiến lá hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2.5- 6 cm, cuống ngắn , khi non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, sau già ít lông hơn, gân phụ 8-9 cặp Lá kèm bé, mỏng, ôm sát vào thân Hoa tập trung ở đầu cành thành tán nhỏ, hoa lúc non có màu trắng sau hơi vàng, dài 0,3- 1,5 cm Đài hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều Tràng hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn Nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài tồn tại ở đỉnh [2], [3], [6], [13], [19]

1.1.3 Thành phần hóa học của rễ Ba kích

Thành phần hóa học của rễ Ba kích được biết gồm có :

Các dẫn chất anthranoid: nhiều anthraquinon đã được phân lập từ Ba kích như: 1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxy-anthraquinon, 1,6-dihydroxy-2-methoxyanthraquinon, methylisoalizarin, methyliso-alizarin-1-methyl ether, physcion,, 1-hydroxyanthraquinon, 2-methylanthraquinon, rubiadin, rubiadin-1-

methyl ethe, 2-hydroxy-3- hydroxy anthraquinone, 1-hydroxy-2- anthraquinone, 2-hydroxy-3-hydroxymethyl-anthraquinone, tectoquinone, 2-hydroxy-1-hydroxymethyl-anthraquinone, 1,3-dihydroxy-2- methoxy-anthraquinone, 1-hydroxy-2,3-dimethyl-anthraquinone, 1- hydroxy-3-methoxy-anthraquinone, 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methyl-anthraquinone, 3-hydroxy-1, 2-dimethoxy-anthraquinone, 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone-monohydrate, 1,2- dihydroxy-3-methyl-anthraquinone, 1,3,8-trihydroxy −2-methoxy-anthraquinone, 2-hydroxymethyl-3-hydroxy-anthraquinone, 2-methoxyanthraquinone, 1,2-dimethoxy-anthraquinone, alizarin-2-methyl ether, digiferruginol, lucidinѡ-ethyl ether, anthraquinone-2-carboxylic acid, 1,2-dimethoxy-3- hydroxy-anthraquinone, 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone

methyl-Các iridoid glycosid bao gồm: asperulosid tetraacetat, monotropein, morindolid và morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidie, acid asperulosidic, asperuloside…

Steroid tự do có sitosterol, 24- ethylcholesterol

Các saccharide như là mannose, nystose, 1F-fructofuranosyl nystose, sucrose, oligosaccharide kiểu inulin như hexasaccharid và heptasaccharid…

Ngoài ra còn có các thành phần khác như: coumarin (scopoletin), sterol (1 số phytosterol: sigmasterol, daucosterol, β- sitosterol…), các acid hữu cơ (acid fumaric, acid succinic…)

Lacton: (4R, 5S) 5- hydroxy hexan- 4- olid

Acid hữu cơ: acid fumaric, acid succinic

Các chất vô sơ gồm K, Na, Mg, Al, Fe, P, Na, Ba, Zn, Cu, Sr, Pb, Ti, Sn,

Tác dụng tăng lực: bằng phương pháp chuột bơi thực hiện trên chuột nhắt trắng, Ba kích với liều 5- 10g/kg dùng liên tiếp 7 ngày trước lúc thí nghiệm có tác dụng kéo dài thời gian chuột bơi [19]

Ngoài ra, Ba kích còn được chứng minh là có một số tác dụng khác: Phân đoạn chiết nước của dịch chiết cồn Ba kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy hóa trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường [37]

Các hợp chất trong Ba kích có tác dụng bảo vệ xương, chống mất xương và có tính chống oxy hóa do tăng hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm lượng MDA (Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm [22], [29], [31], [39], [40]

Thành phần monotropein có tác dụng chống viêm [19], [25], [35]

Thành phần oligosaccharides từ Ba kích có tác dụng chống trầm cảm, làm giảm đáng kể các biểu hiện của hành vi trầm cảm gây ra bởi mô hình stress trường diễn không thể dự đoán (CUS- chronic unpredictable stress) trên thử nghiệm lựa chọn Sucrose và thử nghiệm bơi cưỡng bức Các oligosaccharid này cũng cải thiện

sự bất thường của con đường BDNF-GSK3β-β-catenin và sự suy giảm của các protein synaptic gây bởi CUS ở vùng trung tâm vỏ não trước Sự hoạt hóa của GSK3β của LY294002 làm mất tác dụng chống trầm cảm của các oligosaccharid từ

ba kích trên thử nghiệm chuột bơi cưỡng bức Chuột bình thường khi được điều trị bằng các oligosaccharid này cũng làm tăng tính chịu đựng đối với CUS, đồng thời làm tăng mức độ biểu hiện của BDNF, p-Ser9 GSK3β và β-catenin ở vùng trung tâm

vỏ não trước [41], [45]

1.1.5 Công dụng theo Y học cổ truyền

Theo Y học cổ truyền, Ba kích được coi là một vị thuốc bổ đã được nhân dân

ta dùng và ưa chuộng từ lâu

Tính vị: vị cay, ngọt, tính ấm

Quy kinh: vào kinh thận

Công năng chủ trị: Bổ thận dương, mạnh gân cốt, chữa di tinh, liệt dương,

xuất tinh sớm, phụ nữ đau bụng dưới, không có con, người già đau lưng, gối mỏi

Bổ tỳ vị, ích tinh tủy, điều huyết mạch

Trị cao huyết áp của phụ nữ [5]

1.1.6 Tổng quan về nystose

Nhóm saccharide là một trong những thành phần quan trọng trong rễ cây Ba kích Rất nhiều các oligosaccharide đã được phân lập bao gồm bajijiasu, mannose, nystose, 1F-fructofuranosyl nystose, inulintype hexasaccharide và heptasaccharide, sucrose, inulin-type trisaecharide, inulotriose, inulotetraose, inulopentaose [42]

1.1.6.1 Công thức phân tử

Công thức phân tử của nystose C24H42O21 [48]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của nystose

sự phát triển của các vi sinh vật có lợi như bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn

gây hại, đặc biệt là Clostridia perfringens FOS còn có thể cải thiện sự hấp thu và lưu

giữ khoáng chất, chủ yếu là calci, magnesi ở ruột FOS giúp tăng cường miễn dịch hệ tiêu hóa, giảm khả năng viêm ruột và ung thư ruột kết nhờ cải thiện cấu trúc niêm mạc, làm dày lớp chất nhầy bảo vệ, phát triển hệ bạch huyết và các nang Peyer [32], [34]

Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh rằng FOS làm giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid máu, cholesterol toàn phần và LDL cholesterol nhờ cơ chế giảm tổng hợp chất béo ở gan bằng cách giảm sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzyme lipogen Điều này rất có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tim mạch [32], [34]

Theo các nghiên cứu, oligosaccharide trong rễ Morinda officinalis How cho

thấy có tác dụng bảo vệ DNA của tinh trùng người khỏi bị phá hủy bởi H2O2, góp phần trong điều trị vô sinh [23] Oligosaccharide còn được chứng minh có thể cải thiện khả năng ghi nhớ trên chuột - được gây mất trí nhớ bằng beta-amyloid [24], chống trầm cảm [41], [45], bảo vệ xương, chống mất xương [25], [27]

Hiện nay nystose đang được dùng làm chất chuẩn định lượng nhằm xác định tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Ba kích và các chế phẩm từ Ba kích trong chuyên luận Dược điển của một số quốc gia và vùng lãnh thổ như Trung Quốc, Hồng Kông [9]

1.1.6.4 Một số phương pháp xác định hàm lượng nystose trong rễ Ba kích

Nystose trong cây Ba kích có thể được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]; sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) [27], [46]; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [11], [33] Tuy kết quả

có độ chính xác thấp và có nhiều yếu tố tác động hơn, nhưng bán định lượng bằng HPTLC cũng có nhiều ưu điểm so với HPLC như: cách tiến hành khá đơn giản, thực hiện được trên số lượng mẫu lớn, chuẩn bị mẫu đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất và vật tư tiêu hao, độ nhạy cao, có tính kinh tế, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, phù hợp với

cả nghiên cứu định tính và định lượng [1]

1.2 Một số nghiên cứu về cây Ba kích tại Việt Nam

Một số nghiên cứu về Ba kích đã được thực hiện ở Việt Nam và trên thế giới: Trên thế giới, có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng dược lý, sinh học, phân lập các chất, giải trình tự gen đã được thực hiện trên cây Ba kích Tuy nhiên vẫn chỉ tập trung chủ yếu ở cây Ba kích ở Trung Quốc, Hàn Quốc [25], [26], [28], [43], [47]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về cây Ba kích được nhiều tác giá tiến hành với các nội dung chính liên quan đến đa dạng hình thái, di truyền, phân lập và xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất quan trọng

Năm 2015, Mai Thị Phượng đã tiến hành nghiên cứu cây Ba kích tím ở Ba

Chẽ, Quảng Ninh Đề tài tiến hành mô tả đặc điểm hình thái các mẫu Ba kích tím tại

Ba Chẽ, Quảng Ninh với các đặc điểm về dạng sống; thân ( non, già; màu sắc; lông);

lá, lá kèm ( cách mọc; hình dạng; thể chất; lông); hoa ( màu sắc; đài; tràng; nhị; nhụy); quả; rễ ( hình dạng, màu sắc) Đồng thời tiến hành mô tả đặc điểm vi học Đối chiếu các đặc điểm với khóa phân loại thực vật, xác định mẫu phân tích là

Morinda officinalis F.C.How

Đề tài đã tiến hành định tính dịch chiết methanol toàn phần bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, kết quả sắc ký đồ thu được cho thấy hệ dung môi pha động:

Toluen: Ethylacetat: Acid acetic (4:1:0,05) có hiệu lực tách tốt nhất

Năm 2016, Thạc sĩ Ngô Thị Thu Hiền đã tiến hành phân tích đa dạng hình

thái và đoạn trình tự ITS của 11 mẫu cây thuộc loài Morinda officinalis How tại nhiều

địa phương khác nhau thuộc miền Bắc Việt Nam bao gồm Đông Bắc ( Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh); Tây Bắc (Lào Cai) được thu thập ngẫu nghiên từ

tháng 1/2014 - 4/2014 Kết quả phân loại các mẫu Morinda officinalis How bằng

phép phân loại đa biến TWINSPAN cho thấy 11 mẫu nghiên cứu được phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm bề mặt dưới phiến lá, các mẫu được phân vào 2 nhóm chính: nhóm 1 gồm các mẫu có lông, nhóm 2 gồm các mẫu không có lông Đặc điểm có lông hay không thường bảo thủ trong một giống trên tất cả các bộ phận của thân, lá,

lá kèm và hoa Đồng thời với việc xác định đa dạng về mặt hình thái, nghiên cứu cũng đã tiến hành định tính nystose trong rễ Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao với dịch chiết methanol toàn phần và hệ pha động Ethylacetat :

Nước : Acid formic : Acid Acetic (6,5:2,5:2:2) Sắc ký đồ của các mẫu phân tích cho

các vạch sắc ký tương đồng nhau khi quan sát ở cả hai bước sóng 366nm và ở điều kiện ánh sáng trắng tuy nhiên độ đậm nhạt của các vạch sắc ký trong từng mẫu là khác nhau giữa các mẫu khác nhau Tất cả các sắc ký đồ của 11 mẫu đều xuất hiện vết sắc ký tương ứng với vết chuẩn nystose [11]

Năm 2017, Nguyễn Thị Hiền và cộng sự đã tiến hành đánh giá sinh trưởng

cây Ba kích nuôi cấy in vitro trồng thử nghiệm tại Trà Lĩnh (Cao Bằng) và Sông Hinh (Phú Yên) trong 4 năm Kết quả trồng thử nghiệm giống ba kích nuôi cấy in vitro cho thấy: sau 4 năm trồng tỷ lệ cây sống khá cao, ở cả 2 địa điểm cây đều sinh trưởng nhanh và phát triển ổn định theo thời gian, các chỉ số sinh trưởng, phát triển tương đương với cây giống Ba kích gieo hạt Song song với đó, nghiên cứu cũng tiến hành định lượng nystose trong cây Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ hấp thụ quang (TLC-scanner) với dịch chiết methanol 70%, sử dụng

hệ dung môi Ethyl acetat: Nước: Acid formic: Acid acetic (6:3:2:2) Kết quả phân

tích cho thấy các mẫu rễ củ Ba kích đều có hàm lượng nystose khá cao, đều đạt trên 3,0% Trong đó, mẫu rễ củ ba kích trồng tại Phú Yên có hàm lượng nystose trung bình đạt cao nhất 5,90%, mẫu trồng tại Cao Bằng hàm lượng nystose trung bình thấp hơn ở mức 4,69% So sánh với tiêu chuẩn trong Dược điển Trung Quốc (hàm lượng nystose không được thấp hơn 2,0%, theo phương pháp HPLC-ELSD), có thể thấy ba kích giống in vitro trồng tại Cao Bằng và Phú Yên đều đạt về hàm lượng nystose so với quy định trong Dược điển Trung Quốc [12]

Năm 2018, Lê Hoàng Khẩn đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng di truyền

cây Ba kích tại Quảng Nam và Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử RAPD Đồng thời xác định tính đa dạng về mặt hình thái Kết quả cho thấy các mẫu cây Ba kích được thu thập tại Quảng Nam và Đà Nẵng được phân loại dựa trên 4 đặc điểm hình thái chính ( màu sắc lá non – tím hay xanh; hình dạng lá – tròn hay thuôn nhọn; bề mặt dưới của lá già – nhiều lông hay trơn nhẵn) So sánh giữa kết quả về mặt di truyền và hình thái nhận thấy có sự khác biệt: các mẫu mặc dù có cùng kiểu hình thái nhưng lại khác xa nhau về khoảng cách di truyền [15]

Như vậy, việc nghiên cứu đa dạng hình thái và di truyền của các mẫu Ba kích

thuộc loài Morinda officinalis How đã cho thấy loài có sự đa dạng nhất định về hình

thái cũng như di truyền trong một khu vực và giữa các khu vực khác nhau Sự đa dạng về hình thái và kiểu gen dẫn đến sự khác biệt về chất lượng giống thể hiện qua hàm lượng các hoạt chất chính Do đó, khi nghiên cứu lựa chọn giống để phát triển loài này ở một địa phương nào đó, việc nghiên cứu đa dạng và lựa chọn được giống phù hợp thổ nhưỡng cho năng suất, chất lượng cao là rất cần thiết

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu Ba kích được thu thập từ các quần thể mọc tự nhiên từ vùng Tây Giang- Quảng Nam và trồng cố định tại vườn trồng Ba kích của anh Phạm Bá Hiển, xã Lăng, Tây Giang, Quảng Nam Thời gian thu mẫu trong giai đoạn từ ngày 06/04/2019- 12/04/2019 Có 3 mẫu được thu thập, được ký hiệu lần lượt là BK2, BK4, BK6

Bảng 2.1 Ký hiệu của các mẫu Ba kích

STT Ký hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Số hiệu tiêu bản

Mẫu phân tích đặc điểm hình thái: Toàn cây

Mẫu phân tích thành phần hóa học: Rễ cây Các mẫu rễ được rửa sạch, bỏ lõi, cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 55- 60oC, xay hoặc nghiền thành bột, rây qua rây 250µm, lấy phần bột dưới rây Bảo quản trong túi ni-lông kín, cho vào bình hút ẩm

Các mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại Phòng Tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP)

2.1.2 Dung môi, hóa chất

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam V

Hóa chất: dung dịch javen, cloran hydrat, acid acetic, xanh methylene, đỏ son phèn, nước cất

Dung môi hữu cơ: ethyl acetat, propanol, methanol, ethanol, acid formic, acid acetic,…

Thuốc thử: Thuốc thử hiện màu sắc ký vanillin/ H2SO4

Dung môi phân tích, các hoá chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích

Chất chuẩn nystose, độ tinh khiết 99,81% (CAS: 13133-07-8, LOT: BRF1002724) hãng Biopurify Phytochemicals Ltd

2.1.3 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tủ sấy WiseVen (R) WOF

Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01g

Cân phân tích Shimadzu (AY 220), độ chính xác 0,1 mg

Máy xác định hàm ẩm AND MF-50

Bể siêu âm WISD

Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: Máy chấm sắc

ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCAT và VideoScan

Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck)

Dụng cụ: Các dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm (Dao cắt, cốc có mỏ, đĩa petri, pipet chính xác các loại, bình nón, lam kính, chày cối, cốc chạy sắc ký…)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu

Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:

- Vi phẫu: rễ, thân, lá

- Soi bột: rễ

Xác định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose trong rễ cây Ba kích bằng phương pháp HPTLC: Khảo sát hệ dung môi khai triển và dung môi chiết xuất

Thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ cây Ba kích bằng phương pháp HPTLC: độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại

Bán định lượng nystose trong các mẫu phân tích bằng HPTLC dựa trên các điều kiện đã được lựa chọn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái được ghi chép lại bao gồm: dạng sống; lá (cuống lá: hình dạng cuống lá, kích thước cuống lá, bề mặt cuống lá; gốc lá: hình dạng gốc lá; phiến lá: hình dạng; chỉ số lá, hình dạng gân lá- gân chính, gân phụ), số lượng gân lá;

bề mặt lá- bề mặt trên và dưới; hình dạng mép lá; hình dạng ngọn lá; lá kèm: cách đính, màu sắc, hình dạng, bề mặt, độ dài; thân: bề mặt thân, màu sắc thân non, màu sắc thân già; quả: cách mọc, bề mặt, số hạt Các đặc điểm hình thái được chụp qua máy ảnh và hệ thống tích hợp với kính lúp soi nổi

2.3.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu

Rễ, thân, lá của các mẫu được cắt, tẩy và nhuộm kép theo phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật [18] Tiêu bản được soi qua kính hiển vi, chụp ảnh lại bằng

hệ thống tích hợp với kính hiển vi và máy ảnh Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của

rễ, thân, lá được quan sát, phân tích và mô tả lại bằng văn viết, ảnh chụp

2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm bột rễ

Rễ được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ 55- 60oC, nghiền hoặc xay thành bột Bột mịn được đưa lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi Các đặc điểm bột

rễ được ghi chép, mô tả và phân tích bằng văn viết, ảnh chụp

2.3.4 Giám định tên khoa học

Tên khoa học được giám định bằng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái, dựa trên khóa phân loại trong Thực vật chí Trung Quốc (Flora of China, volume 19- Rubiaceae) [49], [50] và mô tả về loài trong các tài liệu thực vật trong nước và ngoài nước [7], [13] Các mẫu sau khi tra khóa phân loại, được so sánh đối chiếu với các

tiêu bản tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3.5 Xây dựng và thẩm định phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC

2.3.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng

* Chuẩn bị mẫu:

Rễ Ba kích tươi sau khi thu hái được rửa sạch, bỏ lõi, cắt nhỏ và sấy ở nhiệt

độ 55oC cho đến khô, xay thành bột và rây qua rây 0,25µm để tiến hành bán định lượng

Quy trình chiết mẫu chung: Cân chính xác khoảng 0,25 g bột dược liệu vào bình định mức 50ml Thêm 20 ml dung môi thích hợp, đậy nút kín, chiết có hỗ trợ siêu âm trong thời gian 30 phút Gạn lấy dịch trong cho vào bình nón nút mài đậy kín Tiến hành chiết thêm 2 lần nữa với 10 ml cùng dung môi Gộp tất cả dịch chiết, cho ngược trở lại vào bình định mức 50 ml ban đầu, tráng sạch bình nón và bổ sung dung môi đến vạch Dịch chiết được lọc, bỏ dịch lọc đầu, ly tâm và sử dụng để chấm sắc ký [33]

Mẫu chuẩn: Cân chính xác 1 mg nystose chuẩn pha trong bình định mức 20

ml, thu được mẫu chuẩn nystose có nồng độ thích hợp

Bản mỏng: bản mỏng TLC silicagel GF254 (Merk) được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 10,0 mm Độ rộng của vết chấm là 8,0

mm Thể tích chấm: Mẫu thử: 2 µl; Mẫu chuẩn: 4 µl

Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng:

- Điều kiện môi trường:nhiệt độ 24oC; độ ẩm tương đối 65%

- Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml

- Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút

- Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút

- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút

- Quãng đường di chuyển của pha động: 80,0 mm

- Bản mỏng được phun thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN V), sau đó sấy ở 105oC trong 10 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường

* Khảo sát hệ dung môi khai triển:

Các hệ dung môi khai triển sử dụng để phân tích Ba kích đã được nghiên cứu nhiều Đề tài đã tiến hành khảo sát lại 3 hệ dung môi khai triển thường gặp nhất Lần lượt là:

Hệ 1 [33] : Ethyl acetat: Propanol: Nước: Acid acetic ( 1: 1: 0,5: 0,5 )

Hệ 2 [11] : Ethyl acetat : Nước : Acid formic : Acid Acetic ( 6,5: 2,5: 2: 2 )

Hệ 3 [38] : Ethyl acetat: Nước: Acid formic: Acid acetic ( 30: 15: 10: 10 ) Tiến hành triển khai sắc ký, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực phù hợp, cho hiệu năng tách vết tốt, đồng thời vết được tách lên gọn, tròn, không bị kéo, không bị lẫn vết phụ

* Khảo sát dung môi chiết xuất:

Sau khi lựa chọn được hệ dung môi khai triển, đề tài tiến hành khảo sát dung môi chiết xuất

Nystose thuộc nhóm oligosaccharide, có độ tan là 745 g/L [48], dễ tan trong nước và các dung môi phân cực, không tan trong dung môi không phân cực, không bay hơi Do đó, đề tài tiến hành khảo sát quá trình chiết siêu âm với các dung môi sau: nước cất, methanol, ethanol 40%, ethanol 60%, ethanol tuyệt đối (ký hiệu lần lượt là Nước cất, MeOH, EtOH 40, EtOH 60, EtOH tđ) theo quy trình chiết chung được trình bày ở mục trên

Tiến hành triển khai sắc ký, lựa chọn dung môi chiết cho tỷ lệ 𝑆𝑝𝑖𝑐

𝑚 𝑐â𝑛 lớn nhất, vết nystose đậm, gọn, tròn vết

(Trong đó: Spic là diện tích pic của vết nystose, mcân là khối lượng bột dược liệu)

2.3.5.2 Thẩm định phương pháp bán định lượng

Sau khi đã xây dựng được phương pháp bán định lượng nystose bằng HPTLC,

đề tài tiến hành thẩm định phương pháp với những nội dung thẩm định sau: Độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ thích hợp hệ thống và độ lặp lại của phương pháp [14], [20]

* Độ đặc hiệu

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác có trong mẫu thử [14]

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

1 Mẫu chuẩn nystose hòa tan trong MeOH

2 Mẫu thử: dịch chiết dược liệu được chuẩn bị theo quy trình chiết chung

3 Mẫu trắng: Dung môi chiết xuất đã chọn ( mục khảo sát dung môi chiết xuất) Triển khai sắc ký với 3 mẫu trên bằng hệ dung môi khai triển đã chọn ( mục khảo sát hệ dung môi khai triển) Soi và chụp ảnh các vết tại ánh sáng trắng, sau khi

đã phun thuốc thử hiện màu Quan sát số lượng vết, hình dạng các vết, sử dụng phần mềm VideoScan để phân tích dữ liệu sắc ký đồ; chồng phổ và nhận xét

Đánh giá: Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

- Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị

Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn

- Sắc ký đồ của các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn [21]

* Khoảng tuyến tính

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ/lượng chất ( trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử [14]

Cách tiến hành: Chấm sắc ký dãy chuẩn các vết có thể tích lần lượt là: 1, 3, 6,

9, 12 µl Tiến hành triển khai sắc ký với các thông số khảo sát được Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa lượng nystose có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [20]

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính Thông thường với giá trị r > 0,90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [14]

* Độ thích hợp hệ thống

Khái niệm: Độ thích hợp hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết

bị, dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm [14]

Cách tiến hành: Tiêm 6 lần mẫu chuẩn, triển khai HPTLC theo quy trình đã xây dựng được

Đánh giá: Tính giá trị RSD của diện tích pic, Rf Giá trị RSD của diện tích pic,

Rf giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% [20]

Công thức tính RSD:

RSD =

√∑𝑛𝑖=0(𝑋𝑖−𝑋)2𝑛−1

𝑋

Trong đó:

n : số lượng mẫu nghiên cứu (n=3)

i : chỉ số chạy có giá trị 1, 2, 3 Xi: là giá trị Rf tại mẫu thử i

𝑋 : là giá trị trung bình của các R f

* Độ lặp lại

Cách tiến hành: Chấm sắc ký dãy chuẩn với thể tích lần lượt là: 1, 3, 6, 9, 12

µl Chuẩn bị dịch chiết mẫu thử BK4 với 5 lần chiết khác nhau Tiến hành triển khai sắc ký theo quy trình đã xây dựng được

Đánh giá: Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của hàm lượng nystose (%) thu được giữa các lần phân tích Giới hạn độ lặp lại đối với một phương pháp theo AOAC là RSD ≤ 2% ở nồng độ chất phân tích ≥ 1% và RSD ≤ 3% ở nồng độ chất phân tích ≥ 0,1% [21]

2.3.5.3 Bán định lượng hàm lượng nystose trong các mẫu rễ Ba kích

Chấm sắc ký dãy chuẩn với các thể tích lần lượt là 1, 3, 6, 9, 12 µl Chuẩn bị dịch chiết mẫu thử BK2, BK4, BK6

Tiến hành chiết và triển khai HPTLC với quy trình đã xây dựng

Xử lý kết quả: Sử dụng phần mềm winCAT và VideoScan để phân tích cường

độ màu vết nystose của các mẫu chuẩn và mẫu thử trên bản mỏng đã khai triển Vết

được quan sát dưới ánh sáng trắng, sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin/ H2SO4

Xây dựng đường chuẩn bán định lượng dựa trên diện tích pic và lượng nystose trong vết của mẫu chuẩn Xác định lượng nystose trong các mẫu thử Từ đó tính hàm lượng nystose trong dược liệu theo công thức sau:

2 × 𝑚 × (100 − 𝑎)/100× 0,1 (%) =

𝑚′× 250𝑚(100 − 𝑎)(%)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3, có thể phân tới nhánh cấp 5 Đường kính củ chính từ 4 - 8 mm; chiều dài củ từ 15

- 40 cm Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông giống ruột gà Vỏ ngoài màu vàng trắng, thịt màu trắng hơi vàng, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau

Thân leo hình trụ, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau Thân non thường phủ lông, màu xanh hoặc tím Thân già có màu nâu hoặc tím đậm, lông rụng dần Mỗi gióng dài 4-15 cm

Lá đơn, mọc đối; cuống dài 6 - 9 mm, đường kính 1 -2 mm, phủ lông dài và dày; phiến lá có hình trứng hoặc bầu dục thuôn nhọn ở ngọn lá, dài 5-11 cm, rộng 2,5

- 4 cm, chỉ số lá 2- 3; gốc lá tròn hoặc nhọn, mép nguyên hay lượn sóng; ngọn lá nhọn; mặt trên và mặt dưới nhẵn hoặc có lông ngắn; thường có hốc Domatia- hốc giữa gân chính và phụ có phủ lông; gân lá hình lông chim, gồm 6-9 cặp gân phụ rời hoặc nối tiếp nhau ở gân mép lá; gân chính nổi rõ và có lông; gân cấp 3 hình mạng

Lá kèm mỏng, ôm lấy thân, hàn liền, dài 2- 4 mm, màu trắng xanh hay tím, có phủ lông ngắn và thưa

Cụm hoa dạng tán, gồm 4-5 tán mọc ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang

5-10 hoa; cuống tán dài 0,3-4 cm, đường kính 1-2 mm, có phủ lông Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính, khi mới nở màu xanh, trắng, sau ngả sang vàng Đài 3-4, hơi dính nhau ở dưới, dài 1-4 mm, rộng 1-3 mm, đài hàn liền hình ống, rộng 2-3 mm, dài 3-4 mm, màu xanh, phủ lông Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, đường kính 2- 3mm, cao 5mm, phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời, hình tam giác, dài, rộng khoảng 3mm, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng, dài khoảng 1 mm, ở phía trên họng tràng

Bộ nhị 3-4, dính vào họng tràng Chỉ nhị rất ngắn Bao phấn 2 ô, dài 1mm, thuôn hai đầu, nứt dọc

Bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau tạo thành bầu dưới, 3-4 ô, đường kính 2-3

mm

Quả hình cầu, từ 1-5 quả/1 tán, quả rời (BK6) Bề mặt quả phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam khi chín, mang đài còn lại trên đỉnh quả Hạt 4/quả

Các mẫu Ba kích thu được tại Tây Giang, Quảng Nam có sự khác biệt nhất

định về đặc điểm hình thái Các đặc điểm đó được mô tả cụ thể như sau:

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu BK2

1: Cành trưởng thành; 2,3: Lá kèm; 4: Mặt sau lá; 5: Mặt trước lá; 6,9: Cụm hoa; 7,8: Hình thái lá; 10: Hoa; 11: Bộ nhụy; 12: Đài và bầu; 13: Tràng và bộ nhị; 14:

Số ô của bầu; 15: Rễ; 16: Tiết diện rễ

Thân non màu tím, có lông dài và dày, lóng dài 3,5- 4,5 cm Thân già tím

đậm Lá mọc đối Cuống dài 6-7 mm Phiến lá hình bầu dục, dài 7-8 cm, rộng 2,5-3

cm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông ngắn và thưa; mép lá không có lông mi; gân phụ 8-10 cặp, có Domatia Lá kèm mỏng, khi non màu tím, khi già màu nâu, có gân

nhọn, ôm sát vào thân

Cụm hoa có 4-5 tán nhỏ, cuống dài 5mm, có phủ lông Chiều dài hoa 4-5 mm, đường kính hoa 2 mm Đài hàn liền hình ống, dài 3-4 mm, rộng 2-3 mm, có phủ lông ngắn và thưa Tràng hàn liền hình trụ, bề mặt ngoài có lông ngắn và thưa, mặt trong nhẵn Bộ nhị 3-4, chỉ nhị rất ngắn, dính họng tràng; cùng một vòng lông dày, thẳng, màu trắng, dài 1mm Bao phấn 2 ô, dài 1mm, nứt dọc Vòi nhụy dài, bầu dưới, 3-4 ô

Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, đường kính 4-9 mm; vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt màu trắng, giữa có lõi với tỷ lệ lõi/ rễ là 1/4 (Hình 3.1)

3.1.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu BK4

1: Cành trưởng thành; 2,3: Lá kèm; 4,7: Mặt sau lá; 5: Mặt trước lá; 6,10: Cụm hoa; 8,9: Hình thái lá; 11: Hoa; 12:Bộ nhụy; 13: Tràng và bộ nhị; 14: Số ô của bầu;

Cụm hoa có 4-5 tán nhỏ, cuống dài 20-30 mm, có phủ lông Chiều dài hoa 4-7

mm, đường kính hoa 2-3 mm Đài hàn liền hình ống, dài 4 mm, rộng 2-3 mm, có phủ lông dài và dày Tràng hàn liền hình chum, bề mặt ngoài có lông ngắn và thưa, mặt trong nhẵn Bộ nhị 3-4, chỉ nhị rất ngắn, dính họng tràng; cùng một vòng lông dày, thẳng, màu trắng, dài 1mm Bao phấn 2 ô, dài 1mm, nứt dọc Vòi nhụy dài, bầu dưới,

4 ô

Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, đường kính 4-8 mm; vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt màu trắng, hơi vàng, giữa có lõi với tỷ lệ lõi/ rễ là 1/3 (Hình 3.2)

3.1.1.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái mẫu BK6

1: Cành trưởng thành; 2,3: Lá kèm; 4,7: Mặt sau lá; 5: Mặt trước lá; 6: Cụm hoa;

8,9: Hình thái lá; 10: Hoa; 11,12: Tràng và bộ nhị; 13: Đài; 14: Số ô của bầu; 15: Cách mọc quả; 16: Quả; 17: Quả cắt ngang; 18: Hạt; 19: Rễ; 20: Tiết diện rễ

Thân non màu xanh, có lông ngắn và thưa, lóng dài 3- 5 cm Thân già màu nâu Lá mọc đối Cuống dài 6-9 mm Phiến lá hình bầu dục, dài 7-11 cm, rộng 2,5-4

cm, mặt trên có lông ngắn và thưa, mặt dưới nhẵn; mép lá có lông mi; gân phụ 8-9 cặp, có Domatia Lá kèm mỏng khi non màu trắng xanh khi già màu nâu, có gân nhọn, ôm sát vào thân

Cụm hoa có 5 tán nhỏ, cuống dài 3 mm, có phủ lông Chiều dài hoa 5 mm, đường kính hoa 2 mm Đài hàn liền hình ống, dài 4 mm, rộng 3 mm, có phủ lông ngắn và thưa Tràng hàn liền hình chum, bề mặt ngoài có lông ngắn và thưa, mặt trong nhẵn Bộ nhị 3-4, chỉ nhị rất ngắn, dính họng tràng; cùng một vòng lông dày, thẳng, màu trắng, dài 1mm Bao phấn 2 ô, dài 1mm, nứt dọc Vòi nhụy ngắn, bầu dưới, 4 ô Quả hình cầu, quả đơn, khi chín màu đỏ, có 4 hạt

Rễ hình trụ, mập, vặn vẹo, đường kính 3-7 mm; vỏ ngoài màu vàng nhạt, thịt màu trắng, hơi vàng, giữa có lõi với tỷ lệ lõi/ rễ là 1/4 (Hình 3.3)

Vi phẫu lá Ba kích có phần gân lá nổi ở hai mặt, mặt dưới nổi rõ hơn mặt

trên Quan sát thấy các đặc điểm sau:

Phần gân lá: Bề mặt gân chính có lông che chở (1) Biểu bì dưới (2) của phần

gân lá gồm một lớp tế bào nhỏ, tương đối đồng đều, xếp sát nhau, phủ một lớp cutin mỏng Biểu bì trên (9) có cấu tạo tương tự biểu bì dưới Nằm sát biểu bì trên và biểu

bì dưới là mô dày trên (8) và mô dày dưới (3) gồm 3- 4 lớp tế bào hình trứng, kích thước khác nhau, có thành dày bắt màu đỏ Mô mềm (7) gồm các tế bào hình tròn,

kích thước lớn, không đều, có thành mỏng, xếp lộn xộn Tiếp theo là các tế bào mô cứng (4) bắt màu xanh, xếp vòng cung phía ngoài mô dẫn Mô dẫn gồm các bó libe

gỗ sắp xếp thành hình vòng cung Trong mỗi bó, libe (5)- gồm nhiều lớp tế bào có kích thước nhỏ, ở ngoài ôm lấy cung gỗ ở trong (6) Phía trong cùng là mô mềm ruột

Phần phiến lá: Biểu bì trên (9) và biểu bì dưới (2) gồm một hàng tế bào hình

gần chữ nhật nằm ngang, có lớp cutin mỏng Dưới biểu bì trên là mô giậu (11) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp sít nhau, vuông góc với biểu bì, có thể chứa những bó tinh thể calci oxalat hình kim Dưới mô giậu là mô khuyết (4) gồm những

tế bào hình đa giác, xếp lộn xộn để lại nhiều khoảng gian bào Trong mô khuyết thường xuất hiện mạch xoắn Ngoài các đặc điểm vi phẫu lá chung, các mẫu phân tích có một số đặc điểm khác biệt theo mô tả của Bảng 3.1 dưới đây:

Bảng 3.1 Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu lá các mẫu Ba kích

Đặc

điểm

Bề mặt lá

Có lông dài và dày Có lông ngắn và thưa Có lông rất ngắn và thưa

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân

Các mẫu nghiên cứu có đặc điểm vi phẫu thân tương tự nhau, được mô tả như sau:

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu thân BK6

1: Lông che chở; 2: Biểu bì; 3: Bần; 4: Mô dày; 5: Mô mềm vỏ; 6: Tế bào mô cứng;

7: Libe cấp 2; 8: Gỗ cấp 2; 9: Gỗ cấp 1; 10: Mô mềm ruột

Mặt cắt ngang thân có thiết diện tròn Từ ngoài vào trong gồm có: Biểu bì gồm một lớp tế bào hình chữ nhật kích thước nhỏ, xếp sát nhau, cutin mỏng, có lông che chở, có vị trí đã hóa bần Bần (3) gồm 3-4 lớp tế bào hình chữ nhật, vách tế bào hóa suberin bắt màu xanh, sắp xếp thành dãy xuyên tâm Mô dày (4) gồm 3-4 lớp tế bào thành dày, bắt màu hồng đậm, xếp sát dưới lớp biểu bì Mô mềm vỏ (5) gồm nhiều lớp tế bào hình hơi dẹt thành mỏng, rải rác trong mô mềm vỏ có rất nhiều tinh thể calci oxalat Kề sát mô mềm vỏ là lớp tế bào mô cứng (6) hình đa giác, bắt màu xanh, xếp sát nhau tạo thành hình vòng cung Libe cấp 2 (7) gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, bắt màu hồng nhạt, kích thước không đều, xếp sát nhau Gỗ cấp 2 (8) gồm mạch gỗ kích thước không đều, hình đa giác gần tròn hoặc tròn, kích thước lớn không đều, mô mềm gỗ bao quanh mạch, xếp thành dãy Gỗ cấp 1 (9) tập trung thành

cụm, mỗi bó gồm 3-6 mạch hình đa giác Mô mềm ruột (10) gồm các tế bào đa giác hơi tròn, kích thước không đều, bắt màu hồng nhạt, có các tế bào thành hóa gỗ nhiều

Tế bào ở trong có kích thước lớn hơn, thành mỏng hơn và hóa gỗ ít hơn

Ngoài các đặc điểm vi phẫu thân chung, các mẫu phân tích có một số đặc điểm khác biệt theo mô tả của Bảng 3.2 dưới đây:

Bảng 3.2 Một số đặc điểm khác biệt của vi phẫu thân các mẫu Ba kích

Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu rễ BK4

1: Bần; 2: Mô dày; 3: Tinh thể canxi oxalat hình kim; 4: Tế bào mô cứng; 5: Mô

mềm vỏ; 6: Libe cấp 2; 7: Gỗ cấp 2

Mặt cắt ngang rễ có tiết diện tròn, từ ngoài vào trong gồm: Lớp bần (1) dày gồm

3 -5 lớp tế bào hình chữ nhật xếp tương đối đều đặn theo hướng vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm Mô dày (2) gồm 2-4 lớp tế bào có hình dẹt, vách hơi dày bắt màu hồng Tinh thể calci oxalat hình kim (3) có nhiều trong mô dày và mô mềm vỏ Tế bào mô cứng (4) hình đa giác, thành dày, bắt màu xanh, xếp cạnh nhau và nằm trong mô mềm

vỏ Mô mềm vỏ (5) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác, kích thước lớn, không đều, xếp lộn xộn Libe cấp 2 (6) gồm các tế bào hình chữ nhật, thành mỏng kích thước bé hơn các

tế bào mô mềm, xếp thành vòng cung bên ngoài gỗ cấp 2 Gỗ cấp 2 (7) xếp thẳng hàng thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm có các mạch gỗ lớn nằm xen giữa mô mềm

gỗ

3.1.3 Đặc điểm bột rễ

Bột rễ Ba kích các mẫu BK2, BK4, BK6 có màu vàng nâu hoặc trắng xám, có mùi thơm đặc trưng Quan sát bột dưới kính hiển vi các mẫu có rất nhiều đặc điểm tương tự nhau như sau: Mảnh bần (1) gồm các tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau Các tế bào mô cứng (2) (3) hình khối, vách dày hóa gỗ nhiều và có ống nhỏ trao đổi Hạt tinh bột hình tròn hoặc nhiều cạnh (4) (5) kích thước nhỏ, có đường kính 10-20 µm; hạt tinh bột hình trứng (6) có kích thước 50 µm Mảnh sợi (7) có vách dày Mảnh mô mềm (8) cấu tạo bởi những tế bào đa giác, kích thước lớn, thành mỏng Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (11) (12) đường kính 5-10 µm, tinh thể calci oxalat hình kim (13) xếp với nhau tạo thành bó kích thước 25- 100 µm Ngoài ra còn có các mảnh mang màu (9) và các mảnh mạch điểm (10)

Hình 3.7 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK2

1: Mảnh bần; 2,3: Tế bào mô cứng; 4,5,6: Hạt tinh bột; 7: Sợi; 8: Mảnh mô mềm; 9: Mảnh mang màu; 10: Mảnh mạch điểm; 11, 12: Tinh thể calci oxalat hình cầu gai;

13: Tinh thể calci oxalat hình kim

Hình 3.8 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK4

1: Mảnh bần; 2: Tế bào mô cứng; 3,4,5,6: Hạt tinh bột; 7: Sợi; 8: Mảnh mô mềm; 9: Mảnh mạch điểm;10: Mảnh mang màu; 11: Tinh thể calci oxalat hình cầu gai; 12:

Tinh thể calci oxalate hình kim

Hình 3.9 Hình ảnh các đặc điểm bột dược liệu rễ BK6

1: Mảnh bần; 2,3: Tế bào mô cứng; 4,5: Hạt tinh bột; 6: Sợi; 6: Mảnh mô mềm; 7: Mảnh mô mềm; 8: Mảnh mạch điểm; 9: Mảnh mang màu; 10,11: Tinh thể calci

oxalat hình cầu gai; 12: Tinh thể calci oxalat hình kim

3.1.4 Giám định tên khoa học

Dựa trên đặc điểm hình thái được mô tả trong các khóa phân loại uy tín theo

mục 2.3.4, các mẫu phân tích đã được xác định có tên khoa học là Morinda

officinalis F.C.How

3.1.5 Bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC

3.1.5.1 Xây dựng phương pháp bán định lượng nystose trong rễ Ba kích bằng HPTLC

* Khảo sát hệ dung môi khai triển

Tiến hành khảo sát hệ dung môi khai triển theo mục 2.3.5.1 thu được hình ảnh sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn có sự khác biệt về Rf với 3 hệ dung môi khác

nhau (Hình 3.10) Trong các hệ dung môi pha động được khảo sát, hệ 1 gồm: Ethyl

acetat: Propanol: Nước: Acid acetic ( 1: 1: 0,5: 0,5 ) tách được nhiều vết hơn, Rf vết Nystose không quá cao đồng thời pic vết Nystose gọn, tách rõ ràng với các vết kề cận Do đó, đề tài đã sử dụng hệ 1 cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 3.10 Hình ảnh bản mỏng của các hệ dung môi triển khai trên TLC sau khi

phun thuốc thử

1: Hệ 1 : Ethyl acetat: Propanol: Nước: Acid acetic ( 1: 1: 0,5: 0,5 )

2: Hệ 2 : Ethyl acetat : Nước : Acid formic : Acid Acetic ( 6,5: 2,5: 2: 2 ) 3: Hệ 3 : Ethyl acetat: Nước: Acid formic: Acid acetic ( 30: 15: 10: 10 ) C: Mẫu Nystose chuẩn; T: Mẫu thử

* Khảo sát dung môi chiết xuất

Tiến hành khảo sát dung môi chiết xuất theo mục 2.3.5.1 với 5 hệ dung môi được khảo sát bao gồm: nước cất, MeOH, EtOH 40, EtOH 60 và EtOH tđ Kết quả cho thấy khả năng chiết nystose trong rễ dược liệu với cùng một phương pháp của các dung môi khác nhau là khác nhau Trong đó, MeOH và EtOH tđ cho khả năng chiết thấp hơn hẳn ba hệ dung môi còn lại Dung môi EtOH 40 và EtOH 60 cho khả năng chiết nystose xấp xỉ nhau và cao hơn nước cất Mặt khác, EtOH 60 lại có tỷ số

Spic /mcân cao hơn so với EtOH 40 đồng thời nồng độ ethanol cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phun mẫu (vết gọn hơn) Vì vậy, đề tài đã lựa chọn dung môi EtOH 60 để tiến hành chiết các mẫu thử bán định lượng nystose Kết quả cụ thể ở Bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả tỷ lệ 𝑺𝒑𝒊𝒄

𝒎 𝒄â𝒏 của các dung môi chiết