Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa hóa học của cây rau má

dung dịch H2SO4 IN, gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid.• Cho Im l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thửDragendorff thấy xuất hiện t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ

DS NGUYỄN THỊ HOÀI

p h ầ n HOÁ HỌC CỦA CÂY RAU MÁ

( C entella asiatica (L.) Urb.) Họ H oa T án (A piaceae )

Chuyên ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền

v iên Bộ m ô n D ư ợ c liệ u , c á c p h ò n g b a n tro n g trư ờ n g đ ã tạo m ọ i

đ iề u k iệ n th u ậ n lợi c h o tô i tro n g su ố t q u á trìn h h ọ c tậ p v à thực

h iện đ ề tài này

C u ố i c ù n g , tôi x in b ày tỏ lò n g b iế t ơ n tớ i n g ư ờ i th ân và

b ạn bè đ ã đ ộ n g v iên , k h íc h lệ tô i tro n g su ố t q u á trìn h h ọ c tậ p và

h o à n th iệ n đ ề tài

T h á n g 11 n ă m 2 0 0 3

N g u y ễ n T h ị H o à i

M Ụ C L Ụ C CHÚ GlẢl C H Ữ V IẾ T T Ắ T

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

Phần 1: TỔNG Q U A N 2

1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.1 Vị trí phân loại họ A piaceae 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ A piaceae 2

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Centella L 3

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Centella asiatica (L.) U rb 4

1.2 Thành phần hoá h ọ c 7

1.3 Công dụng và tác dụng 9

1.4 Cách dùng và các chế p hẩm 10

P h ần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯDNG PHÁP NGHIÊN c ú u 12

2.1 Nguyên liệ u 12

2.2 Phương pháp nghiên cứ u 12

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 12

2.2.2 Nghiên cứu về hoá học 12

2.3 Phương tiện nghiên cứu 12

Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KÊT Q U Ả 14

3.1 Thực v ậ t 14

3.1.1 Đặc điểm hình th á i 14

3 1.2 Đặc điếm vi phẫu cuống lá 15

3.1.3 Đặc điểm vi phẫu th â n 15

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu l á 16

3.1.5 Đặc điểm vi phẫu r ễ 17

3.1.6 Đặc điểm bột dược liệ u 17

3.2 Hoá h ọ c 17 3.2.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ bằng các phản ứng hoá

h ọ c 17

3.2.2 Xác định chỉ số bọt và chỉ số phá huyết của saponin 25

3.2.3 Quy trình chiết xuất flavonoid và saponin 28

3.2.4 Định lượng hỗn hợp flavonoid và hỗn hợp sa p o n in 28

3.2.5 Phân lập flavonoid 30

3.2.6 Nhận dạng H I và H 2 32

3.2.7 Phân lập sa p o n in 37

3.2.8 Nhận dạng H3 và H 4 39

P h ần 4: BÀN LUẬN 46

4.1 Về thực vật 46

4.2 Về hóa học 46

Phần 5: KÊT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết lu ậ n 48

5.2 Đề n g h ị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Phụ lục 2

Phụ lục 3

Phụ lục 4

Phụ lục 5

CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

' ^C-NMR : Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

'H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

ỊR : Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

J ; Hằng số tương tác ( đơn vị tính là Hertz)

MS : Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

NXB : Nhà xuất bản

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

u v : Ultraviolet Spectroscopy (Phổ tử ngoại)

ô : Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính là ppm: Parts

per million)

Đ Ặ T VÂN ĐỂ

ơ Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới, việc sử dụng cây

cỏ làm thuốc đã trở thành tập quán từ lâu đời Rau má (Centelỉa asiatica (L.) Urb.) họ Hoa tán (Apiaceae) là cây mọc hoang và được

trồng khá phổ biến ở Việt Nam để làm rau ăn và làm thuốc Rau má được sử dụng để phòng và chữa trị rất nhiều căn bệnh như: các bệnh về gan (xơ gan, hạn chế phát triển khối u ở gan, cải thiện chức năng gan), làm lành vết thương, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, thông tiểu, các trường hợp vàng da, sốt nóng, mụn nhọt, sởi, mẩn ngứa, thổ huyết, viêm họng, viêm phế quản, viêm đường tiết niệu ở các nước trên thế giới, Rau má đã được nghiên cứu khá nhiều, ở nước ta cũng đã có một

số tác giả nghiên cứu về loài này tuy nhiên còn rất ít và hạn chế Với mong muốn góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu, chứng minh thành phần hóa học có tác dụng của cây thuốc dân gian sẵn có và quý báu này để sớm đưa việc khai thác, sử dụng rộng rãi cây Rau má vào làm thuốc phòng và chữa bệnh chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc

điểm thực vật và thành phần hoá học của cây Rau má *' với hai mục

tiêu chính:

1 Xác định đặc.điểm thực vật của cây

2 Xác định thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập và dự kiến cấu trúc các chất phân lập được

P h ầ n l : TỔ NG Q U A N 1.1 Đặc điểm thực vật

1.1.1 Vị trí phán loại họ Hoa tán:

Họ Hoa tán (Apiaceae) thuộc bộ Sơn thù du (Cornales), phân lớp Hoa hổng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Trên ihế giới họ Hoa tán có khoảng 300 chi và 3000 loài, phân bố gần như kháp nơi nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới bắc và có một ít chi, loài ở vùng núi cao nhiệt đới

ở Việt Nam họ Hoa tán có hơn 20 chi: Anethum, Angelica, Apium, Bupleurum, Centeỉla, Cnidium, Coriandrum, Cryptotaenia, Daucus, Eryngium, Foeniculum, Glehnia, Heracleum, Hydrocotyle, Ligusticum, Oenanthe, Petroselinum, Peucedanum, Pimpinella, Rernopetalum , Sanicula, Torilis, Trachyspermum và trên 30 loài [1],[11]

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Hoa tán

Cây Iháo, rất ít khi'là cây bụi nhỏ, mọc sát đất, sống 1 năm hay nhiều năm Lá mọc so le, không có lá kèm, cuống lá ở phía dưới rộng ra thành bẹ

ôm lấy 1 phần của đốt Phiến lá rất ít khi nguyên, có răng cưa hay chia thuỳ

mà thường chẻ lông chim 1, 2 hay nhiều lần Trong thân và lá có ống tiết dầu thơm Thân thường chia thành mấu và dóng rõ ràng, ở giữa các dóng thường rỗng do có mô mềm tuỷ phân hoá sớm Mặt ngoài của dóng thường có những khe lõm dọc nông hay sâu Mạch thủng lỗ đơn hoặc lỗ gần tròn

Hoa thường nhỏ, tập hợp thành cụm hoa, thường là tán kép (Coriandrum, Daucus, Selinum.,v.v.), nhưng cũng có khi tán đơn (Centella,

Hydrocotyle) hay hình đầu (Eryngium) Tán đơn hay tán kép mọc trên đỉnh của Ihân hay ca ở đinh thân lẫn nách lá.

Gốc của tán có những lá bắc nhỏ mọc vòng làm thành tổng bao, còn

các hoa ở bên trong thì không có lá bắc riêng biệt Lá bắc có thể có cả ở gốc

của tán kép lẫn tán đơn Hoa lưỡng tính hay đơn tính cùng gốc Hoa thường là đều nhưng có khi trong 1 tán có những hoa ở vòng ngoài có cánh hoa quay ra ngoài phát triển mạnh làm cho hoa trở thành đối xứng 2 bên Đài gồm 5 lá đài màu lục, thường nhỏ, hình vẩy, nhưng có khi hoàn toàn không có lá đài Cánh hoa 5, rời nhau, nhỏ, có màu trắng, hồng, vàng lục Nhị 5, xếp xen kẽ với các cánh hoa, có chỉ nhị dài Bao phấn 2 ô, đính lưng Màng hạt phấn thường có 3 rãnh lỗ Bộ nhuỵ gồm 2 lá noãn đính với nhau ở mặt trong, 2 vòi nhuỵ lự do, dạng sợi, đầu nhuỵ hơi phổng, gốc của vòi nhuỵ xoè rộng ra thành chân vòi phủ lên đỉnh của bầu Bầu dưới Quả đóng đôi hình cầu hay hình bầu dục mang theo vòi nhuỵ và thuỳ đài Hạt đính chặt vào vỏ quả, phôi nhỏ nằm trong nội nhũ sừng có nhiều dầu [9],[22]

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Centella:

Cây nhiều năm, đôi khi là dạng nửa bụi, mọc đứng, mọc bò hoặc có rễ

ở các đốt Lá nguyên, khía tai bèo hoặc chia thuỳ, gân hình chân vịt, không

có lá kèm, cuống lá có bẹ Hoa không cuống hoặc có cuống ngắn, cụm hoa xếp Ihành lán đơn Lá bắc thường nhỏ hoặc không có Đài tiêu giảm thành răng, tràng hoa nguyên xếp chồng khi còn trong nụ Đĩa tuyến mật phẳng, mép đĩa hơi vếnh lên Vòi nhuỵ bắt nguồn từ gốc, dạng hình chỉ Quả dẹt, có cạnh lồi và vân mạng

Theo Nguyễn Tiến Bân chi Centella ở Việt Nam chỉ có 1 loài là

Centella asiatica (L.) U rb.[l],[27].

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Centelỉa asiatìca (L.) Urb :

Tên khoa học: Centeỉla asiatica (L) Urb còn có tên gọi khác như

ỉlydrocotyle asiatica L., Trisanthus cochinchinesis Lour., họ Hoa tán Apiuceae

Tên Việt Nam: Rau má, Tích tuyết thảo, Tỉnh tuyết, Liên tiền thảo [2],[14]

Rau má là loại cây cỏ mọc bò trên mặt đất, phân nhánh nhiều Thân gầy, nhẩn, chia thành các đốt dài, có rễ ở các mấu, thân non phủ lông mềm

Lá mọc thành cụm, phiến lá đơn hình tròn, gần tròn hoặc hình thận, rộng 1 - 7

cm, mép xẻ răng cưa, gân chân vịt, gốc rộng, chóp tròn Cuống lá dài 10 - 12

cm hoặc cuống dài bằng phiến lá Cụm hoa hình tán đơn mọc ở kẽ lá, gồm 2 -

3 hoa nhỏ không cuống, hoặc hoa ở giữa hầu như không cuống, các hoa ở bên cạnh có cuống ngấn Hoa lưỡng tính, mẫu 5 Đài tiêu giảm Cánh hoa gần iròn hoặc hình trứng, dài 1 - 1 ,5 mm màu xanh nhạt, hồng nhạt hoặc đỏ Nhị xen giữa các cánh hoa Bầu nhuỵ một ô, vòi nhuỵ xẻ 2 Quả gần hình cầu với nhiều rãnh dọc Hạt dẹp Lá mầm hình trứng rộng hay hình bầu dục[8],[10],[14],[17],[23],

Rau má phân bố nhiều ở Ấ i độ, Xri lanca, Malaixia, Việt Nam, Lào, Cămpuchia, Trung Quốc, Indonexia, Madagascar

ở Việt Nam Rau má mọc tự nhiên trên các bãi đất hoang ven đường, ven ruộng tại nhiều địa phương suốt từ Bắc vào Nam Rau má có thể được thu hái quanh năm nhưng chủ yếu thường vào mùa Hạ hoặc đầu mùa Thu khi cây đang xanh lốt Nhổ cả cây rửa sạch đất cát, dùng tươi hoặc khô bằng cách phơi náng hoặc sấy khô ở nhiệt độ dưới 50°c rồi đóng gói bảo quản nơi khô ráo

Hầu như toàn bộ Rau má thương phẩm đều được sử dụng trong chế biến thuốc Trên thế giới trong những năm 1991-1994 lượng Rau má khô

được dùng để chế biến thuốc trong y học dân tộc khoảxig 19-125 tấn/ năm Hầu hết khối lượng Rau má xuất khẩu ra thị trường thế giới từ Madagasca, lượng Rau má xuất khẩu của Madagasca đạt 26-29 tấn/ năm.

Đến nay chỉ có Sri Lanca gieo trồng Rau má trên diện tích lớn theo qui

mô sản xuất hàng hoá, còn ở các nước Rau má hầu như được thu hái từ cây mọc hoang và ihường được mua bán tại các chợ địa phương, ở nước ta Rau

má mọc hoang nhiều, luy nhiên do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng nên rau

má đã được trổng nhiéu ở một số nơi như Phong Điền (Thừa Thiên Huế) và các tỉnh phía Nam ở thành phố Hổ Chí Minh Rau má được trồng nhiều trong các vườn nhà thuộc xã An phú đông, Thạch lộc huyện Hóc môn Với 0,1 ha đất trừ chi phí người dân thu được khoảng 2 triệu đồng/ năm [3],[19],[21]

Ngoài loài Centella asiatỉca nói trên, ở nước ta còn có một số loài khác cũng thuộc họ Hoa tán {Apiaceae ) được gọi là Rau má [10],[14],[17],[21] như:

• tỉydrocotyle chevaỉieri (Chern.) Tard = Hydrocotyle poỉycephala var chevaìieri Chern.

Tên Việt Nam: Rau má Chevalier

• Hydrocotyle chinensis (Dunn.) Craib = Hydrocotyle javanica var cliinensis Dunn.

Tên Việt Nam: Rau má Trung Quốc

• Hydrocotyle nepalensis Hook = Hydrocotyle javanica

Thunb.C.B.Clarke

Tên Việt Nam: Rau má Java, Rau má lá to, Rau má dại, Rau má rừng

• ỉỉydrocoíyìe peteìotii Tard.

Tên Viêt Nam: Rau má Pê-tơ-lô

• Hydrocotyle pseudosanicula De Boiss.

Tên Việt Nam: Rau má dạng sanh cầu

• Hydrocotyle siamica Craib.

Tên Việt Nam: Rau má Xiêm

• Hydrocotyìe rotundifolia Roxb = Hydrocotyle sibthorpioides Lamk

Tên Việt Nam; Rau má mỡ, Rau má nhỏ, Thiên hồ thái

• Hydrocotyle tonkinensis Tard.

Tên Việt Nam: Rau má Bắc Bộ

• Hydrocotyle wilfordii Maxim.

Tên Việt Nam; Rau má Wilford

Ngoài ra còn một số cây cũng được gọi là Rau má nhưng thuộc họ khác:

• Emilia sonchifolia (L.) DC., Asteraceae.

Tên Việt Nam: Rau má lá rau muống, Rau chua lè, c ỏ huy

• Gleclioma hrevituhơ Kupr = Glechoma longỉtuba Kupr = Glecchoma

iìederacel^., Lamiaceae.

Tên Việt Nam; Rau má lông, Liên chiền thảo

• Geophiìa herbacea (L.) o Kuntze = Geophila reniformis D.Don = Geophila repens (L.) Johnst., Riibiaceae.

Tên Việt Nam: Rau má núi

• Polygonum perfoliatum L., Polygonaceae.

Tên Việt Nam; Rau má ngọ, Rau sông chua dây

1.2 Thành phần hoá học:

Theo các tài liệu [3],[17],[19],[20],[32], loài Centella asiatica (L.) ưrb ở

các nước có một số chất thuộc các nhóm sau;

• Alcaloid: Hydrocotylin có công thức phân tử C2 2H3íỊOịịN, độ chảy 210-

212‘’c Chất này cho các muối oxalat (độ chảy 295”C), muối picrat (độ chảy 110-112‘’C), muối cloroplatinat (độ chảy 134-136°C)

• Saponin

Asiaticosid và madecassoid là các saponin triterpenoid thuộc nhóm ursan.Asiaticosid có công thức phân tử C5jỊHịịịị0 3 , dạng tinh thể, tan trong cồn Khi thuỷ phân cho phần aglycon là acid asiatic và đường liên kết gồm có 1

rhamnose và 2 glucose (rha-glc-glc = 0-a-L -rham nopyranosyl-(l-> 4)-0-P - D-glucopyranosyl-(l-^6)-ị3-D-glucopyranosyl hoặc 0-6-deoxy-a-L -

m annopyranosyl-(l-^4)-0-Ị3-D-glucopyranosyl-(l->6)-P-D-glucopyranosyl)

Acid asiatic RI = H, R2 = HAcid madecassic RI = OH, R2 = HAsiaticosid RI = H, R2 = rha-glc-glcMadecassosid RI = OH, R2 = rha-glc-glc

Mạch đường nối với aglycon theo dây nối ester với nhóm carboxyl ở C-26.Madecassoid có phần aglycon là acid madecassic và mạch đường cũng giống như asiaticosid.

Ngoài ra còn có một số saponin khác với hàm lượng thấp như: centellosid, thankunisid, brahminosid, brahmosid, oxyasiaticosid

Acid asiatic và madecassic cũng tổn tại ở dạng tự do trong cây

Một sapogenin nhóm lupan: acid betulinic cũng đã được phân lập

• Flavonoid: kaempferol, quercetin và các glycosid của chúng là 3-glucosyl quercetin và 3-glucosyl kaempferol

• Tinh dầu: loài Centella asiatica (L.) Urb ở Sri Lanca có chứa tinh dầu với

các thành phần chính: a-copaen (14%), P-caryophyllen (12%), trans-P- farnesen (5%), và a-hum ulen (9%) Rau má M alaixia có p-caryophyllen (27%), a-hum ulen (33,4%), germacren-D (10%) [19]

• Các chất khác: P-sitostirol, stigmasterol, campesterol, camphor, cineol và các chất khoáng như: K, Mg, Mn, p, Fe, hỗn hợp vitamin B (Bi, B2, B3, B5, Bfi,

Bj2 ) vitamin c , tiền vitamin A, các amino acid, enzym cũng thấy có trong

Centeỉla asiatica (L.) Urb.

ở Việt Nam, loài Centella asiatica (L.) Urb đã được GS Đặng Hồng

Vân và cộng sự chiết xuất được 1 hỗn hợp saponin triterpen có tác dụng tăng cường khả năng tổng hợp chất tạo keo hàn gắn vết thương [16] Vài năm gần đây ở thành phố Hổ Chí Minh đã có một số công trình nghiên cứu định lượng hỗn hợp saponin trong Rau má và một số chế phẩm chứa cao Rau má bằng phương pháp cân và định lượng asiaticosid trong Rau má bằng sắc ký lỏng cao áp với chất chuẩn mua ở nước ngoài [13],[18]

1.3 Tác dụng và công dụng:

• Theo y học hiện đại:

Saponin toàn phần của Rau má có tác dụng tăng tổng hợp collagen và fibronectin làm tái sinh mô, giúp các mô liên kết được tái tạo một cách nhanh chóng qua cơ chế:

+ Điều hoà sự tăng sinh của tế bào sợi

+ Gia tăng tiến trình tạo chất sinh cơ

+ Giúp các tế bào sợi tổng hợp ưu tiên chất sinh cơ

Do đó Rau má được sử dụng ngày càng phổ biến và có hiệu quả trong các hội chứng giãn tĩnh mạch, viêm mô tế bào, phù cứng da, sẹo lồi, kích thích lên da non Dịch chiết Rau má được sử dụng làm thuốc bôi ngoài da trong trườnghợp tiểu phẫu, các vết bỏng thông thường hoặc bỏng độ 2, độ 3, vết thươngnhẹ ở da Có hiệu quả đối với mụn nhọt ở chân tay, sưng viêm mạch, chứng cứng da, bệnh Luput, các vết nứt nẻ sưng tấy, lở miệng và bệnh phong [19],[20],29],

- Asiaticosid giúp cải thiện và tăng cường chức năng gan, làm chậm sự phát triển khối u ở gan, đẩy lùi các tác nhân gây viêm ở bệnh nhân xơ gan Có khả năng giải độc kể cả trường hợp ngộ độc Arsen (As) hoặc lá ngón [19],[25],[26],[29],[31],

- Điều trị loét dạ dày tá tràng do hội chứng stress nhò tác dụng lên thần kinh trung ương làm tăng sự gia tăng GABA (y-aminobutyric) trong não [29],[33]

- Hỗn hợp Brahmosid và Brahminosid có hoạt tính chống co giật, chữa sốt nóng, giảm đau, điều hoà các nhóm tế bào cảm giác làm dịu sự căng thẳng thần kinh, giúp chống hội chứng stress

- Giúp tăng trí nhớ và phát triển não bộ

• 'ỉ'heo y học cô íniyền:

Rau má vị ngọt hơi đấng, tính hơi mát

Tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán ứ, chỉ thống, lương huyết, sinh tân, lợi niệu

Dùng Rau má để chữa các chứng bệnh: Vàng da, sốt nóng, mụn nhọt, sởi, viêm gan, viêm amidan, chảy máu cam, thổ huyết, phụ nữ bạch đới (khí hư), đái buốt, đái rắt (có thể có sỏi), đái ra máu, thương tích phần mềm, bị ngộ độc do thuốc trừ sâu có phospho Rau má còn có tác dụng bồi bổ sức khoẻ cho những người yếu mệt, ho lâu ngày, biếng ăn, phụ nữ kinh nguyệt không đều [ 1 ],

1.4 Cách dùng và các chẻ phẩm:

- Dùng tươi: Xay với nước, lọc lấy dịch, có thể thêm đường để uống

Nhân dân ta thường dùng Rau má làm rau ăn và làm nước giải khát

- Dùng khô: dạng thuốc sắc Ngày dùng 30-40g

Rau má là một thành phần trong phương thuốc đông y chữa viêm gan, chống lão hoá[17]

ở Ấn độ và Madagascar Rau má được chế biến làm thuốc chữa động kinh, chữa hủi ớ Thái Lan người ta dùng Rau má làm thuốc bổ và chữa kiết lỵ [19],

- Dùng ngoài; đắp vết thương, chữa tổn thương do ngã, gãy xương, bong gân, mụn nhọt hoặc làm các chế phẩm dưỡng da, chống nhăn da [10],[24]

Chế phẩm viên nén bao phim Centula 25® kết hợp Rau má và Nghệ có tác dụng tái tạo chức năng gan, giúp chuyển hoá mỡ dư thừa, làm giảm cân, giảm Triglycerid máu, cân đối vòng eo, làm da mịn màng

Phòng bào chế Syntex của Pháp có biệt dược Mạdecassol dưới dạng viên chứa lOmg cao Rau má, dạng thuốc mỡ, mỗi ống chứa 0 ,lg cao và dạng liêm, mỗi ống chứa 20mg cao (cao có chuẩn độ) Thành phần hoạt chất trong cao có acid madecassic, acid asiatic và asiaticosid Madecassol được chỉ định trong các trường hợp rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch và các vết thương chậm lên sẹo.

Ngoài ra còn có các chế phẩm Madecassol loại bột, đóng lọ 2g và lOg,

chứa 2% cao Rau má để rắc vào các vết loét do bỏng hoặc vết thương

Madecassol loại gạc thấm chứa khoảng 2g cao Rau má dùng để băng vết thương

Một số chế phẩm khác được sản xuất từ Rau má như: Remember Now® Centellin®, Celluligne® dùng phòng chống bệnh Alzheimer, giảm thiếu trí nhớ, giúp điều hoà chức năng gan, cải thiện chức năng da, giảm cân giúp cơ thể thon lại

Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

• Mô tả hình thái thực vật, phân tích và đối chiếu với Dược điển Việt Nam.

• Nghiên cứu đặc điểm vi học: Làm vi phẫu cắt ngang, nhuộm kép rễ, thân, cuống lá, lá; soi bột dược liệu theo các phương pháp ghi trong tài liệu [6],[15],

2.2.2 Nghiên cứu về hoá học:

• Định tính một số nhóm chất tự nhiên bằng các phản ứng hoá học theo phương pháp ghi trong tài liệu [4],[5],[12]

• Định lượng hỗn hợp flavonoid và hỗn hợp saponin bằng phương pháp cân theo tài liệu [3],[12]

• Chiết xuất, phân lập flavonoid và saponin

• Dự kiến cấu trúc chất phân lập được bằng phương pháp đo độ chảy,

phổ u v , IR, MS, NMR.

2.3 Phương tiện nghiên cứu:

Máy, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu:

Vi phẫu và đặc điểm vi học của bột được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi MBI-15 (Nga) tại bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà nội.

Đo độ ẩm dược liệu bằng máy sấy ULTRA tại bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà nội

Đo độ chảy bằng máy KALLEN KAMP tại phòng thí nghiệm trung lâm -Trường Đại học Dược Hà nội

Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy PYE-UNICAM SP-800 và phổ hồng ngoại (IR) trên máy BERMAM ở dạng viên nén KBr tại phòng thí nghiệm trung tâm -Trường Đại học Dược Hà nội

Đo phổ khối (MS) trên máy 5889-B-HP-MS tại phòng cấu trúc Viện hoá học -Trung tâm khoa học và công nghệ quốc gia

Đo phổ NMR bằng máy Brucker 500 MHz tại Viện hoá học - Trung tâm khoa học và công nghệ quốc gia

Phần 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Thực vật:

3.1.1 Đ ặc điểm hình th ái

Cây cỏ m ọc bò, lan rộng trên m ặt đất, phân n h ánh nhiều R ễ m ọc ở các

m ấu của thân T hân nhỏ, đường kính từ l- l,5 m m , chia thành các đốt, m ỗi đốt dài khoảng 8-12cm , có m àu xanh đậm hoặc xanh tím T hân non có phủ lông

m ềm hoặc gần như nhẵn L á m ọc so le hoặc tụ tập 2-5 lá ở 1 m ấu Phiến lá

h ìn h tròn hoặc hình thận, m ép khía tai bèo L á rộng khoảng 2-6cm , gốc lá rộng, ngọn lá tròn, gân lá hình chân vịt C uống lá tròn, đường kính l-2 m m , dài 6-12cm , trong rỗng, có m àu xanh lá hoặc xanh tím Cụm hoa dạng tán đcfn, m ọc ở nách lá hoặc ở gốc T án dài l-2 cm , m ang 3-5 hoa rất nhỏ H oa lưỡng tính, dài 3-4m m , k hông cuống, m ẫu 5 Đ ài tiêu giảm C ánh hoa hình tròn hoặc hìn h trứng, rộng l-2 m m , m àu trắng hoặc phớt đỏ N hị 5, xen giữa các cánh hoa, chỉ nhị dài Đ ĩa tuyến m ật bằng phẳng Bầu nhụy 1 ô gồm 2 lá noãn đính vói nhau ở phía trong V òi nhuỵ xẻ 2, dạng sợi chỉ, đầu nhuỵ hcd phồng Bầu dưới Q uả dẹt, tròn, đường kính 2-3m m , có nhiều rãnh dọc, m ang theo vòi nhuỵ C uống quả ngắn khoảng từ 0 ,5 -Im m H ạt đính chặt vào vỏ quả (H ình 1,2)

i nillịlllllỊíllỊlHlụỊlliilịỊìỊỊỊ

II ÌIM Ị M M11Ii111Ih II:'' i I 1IIIII í III I H 11 I I { I

ỈO II ip Id

H ình 1,2 C â y Rau má

hơi tròn, soi dưới kính hiển vi thấy:

Biểu bì (1) là 1 hàng tế bào hình chữ nhật M ô dày (2) nằm sát dưới biểu bì gồm 2-3 lớp tế bào có thành dày Tiếp đó là m ô m ềm vỏ (3) Các bó libe - gỗ chồng kép không đều nhau xếp theo vòng tròn không liên tục, thường có m ột bó bé giữa hai bó lớn M ỗi bó gồm m ột đám m ô cứng (4), libe (5) và m ạch gỗ lớn (6 ) M ô m ềm ruột (7) là những tế bào hình chữ nhật thành m ỏng, xếp rời rạc tạo thành các khuyết

H ình 3: V/ phẫu cuống lá Rau má

H ình 4 ; Vi phẫu thân R au m ắ 3.1.4 Đ ặ c điểm vi p h ẫ u lá:

M ặt cắt vi phẫu (hình 5) soi dưới kính

hiển vi thấy:

Phần gân lắ: trên hơi lõm , dưới lồi, biểu

bì trên và dưới (1) cấu tạo bởi 1 lớp tế

bào nhỏ xếp đều đặn M ô dày (2) nằm

sát dưới biểu bì trên và dưới là những tế

bào có thành dày, xếp lộn xộn Bó libe

gỗ gồm cung libe (3) ôm lấy phần gỗ

(4)

Phần ph iến lá T ế bào biều bì trên và

dưới giống vói phần gân lá M ô dậu (5)

nằm dưới biểu bì trên gồm hai lớp tế

bào Dưới m ô dậu là m ô khuyết (6 )

H ình 5: V i phẫu ỉầ R au m ẩ

3.1.5 Đ ặc điểm vi p h ẫ u rễ:

M ặt cắt vi phẫu (hình 6 ) có hình tròn,

soi dưới kín h hiển vi thấy:

Bần (1) cấu tạo bởi vài lớp tế

bào hìn h chữ nhật, nhiều chỗ bị bong

ra Dưới bần là m ô m ềm vỏ (2), là

những tế bào hình nhiều cạnh, xếp lộn

xộn và hơi bị ép vào nhau Bó libe -

gỗ có gỗ (4) ở trong, libe (3) ngoài

Gỗ gần như hoá gỗ hoàn toàn, các

m ạch gỗ nhỏ hơn ở bên ngoài, to ở ịn

(5) hẹp cắt các bó libe - gỗ thành dạng H ình 6: Vi phẫu r ễ Rau má

quạt M ô m ềm ruột (6 )

3.1.6 Đ ặc điểm b ộ t dược liệu:

Bột m àu xanh xám , m ùi đặc biệt, vị hơi nhạt

Soi dưới kín h hiển vi thấy; R ất nhiều m ảnh m ạch: m ạch chấm , m ạch xoắn,

m ạch m ạng (5) Sợi riêng lẻ (3) hoặc thành từng bó (4), thành hơi dày M ảnh

m ô m ềm (1) M ảnh biểu bì m ang lỗ k h í (2) H ạt tinh bột có rốn đậm đứng riêng lẻ (7) hoặc tụ tập thành đám (8 ) T inh thể canxi oxalat hình khối(9),(10) H ạt phấn hoa m àu vàng đậm , hình trứng, m ặt ngoài hơi xù xì (6 ) (H ình 7)

\ A ĩ m J

H ình 7 ; Đ ặc điểm bột Rau má

l.M ả n h m ô m ềm ; 2.M ảnh biểu bì m ang lỗ khí; 3,4.Sợi; 5.M ảnh

m ạch; 6 H ạt phấn hoa; 7.H ạt tin h bột; S.Đám tinh bột; 9.T inh thể canxi oxalat; lO.Tế bào m ang tinh thể canxi oxalat

dung dịch H2SO4 IN, gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng với thuốc thử chung của alcaloid.

• Cho Im l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thửDragendorff thấy xuất hiện tủa màu da cam

• Cho Im l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện tủa trắng

• Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt thuốc thửBoLichardal thấy xuất hiện tủa nâu

• Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2-3 giọt dung dịch acid picric 1 % thấy xuất hiện tủa vàng

Phản ứng dương tính với các thuốc thử chung của alcaloid

* Định tính anthranoỉd:

Lấy khoảng Ig nguyên liệu cho vào ống nghiệm, thêm lOml dung dịch acid sulfuric IN Đun sôi trực tiếp 10 phút Để nguội, lọc Thêm ether vào dịch lọc, lấc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, lớp ether làm phản ứng Bortraeger

Cho Iml dịch ether vào ống nghiệm nhỏ, thêm Iml dung dịch NaOH10%, lắc

kỹ, không thấy xuất hiện màu đỏ

Phản ứng âm tính

* Định tính acid hữu cơ:

Cho bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm nước cất, đun sôi trực tiếp trong vài phút, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít bột Natri cacbonat thấy có bọt khí CO2

Phản ứng dương tính

* Đinh tính coumarin:

Chiết xuất comarin bàng cồn 96", lọc, dịch lọc trong để làm các phản ứng định tính;

• Phản ứng mở và đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống Iml dịch chiết Thêm vào ống thứ nhất 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống thứ 2 để nguyên Đun cách thuỷ cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát:

• Soi huỳnh quang:

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên đó dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ Che 1/2 vết bằng đổng xu, soi dưới đèn tử ngoại (A, = 366 nm) trong vài phút, sau đó bỏ đổng xu ra sẽ thấy phần bị che phát quang yếu, phần không che có huỳnh quang màu xanh lơ Tiếp tục soi vài phút sau thì phần bị che sẽ sáng dần lên và cá vết chất có huỳnh quang màu xanh lơ

Phản ứng dương tính

• Phản ứng diazo hoá:

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH10% Đun sôi cách thuỷ vài phút Lấy ra để nguội rồi cho thêm vào đó 2-3 giọt thuốc thử diazo, thấy xuất hiện màu đỏ

Phản ứng dương tính.

• Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%

Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện tủa màu xanh nâu

• Phán ứng với dung dịch gelatin 1%:

Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không thấy xuất hiện tủa bông trắng

Phản ứng âm tính

• Định tính Saponin:

Cho 5g dược liệu vào bình nón lOOml, chiết bằng 30ml cồn 90”, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp Dịch chiết cồn để làm phản ứng:

• Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho vài giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm

có 5ml nước, lắc mạnh trong 1 phút, có cột bọt cao bền vững trong 15 phút.Phản ứng dương tính

• Phản ứng với H2SO4 đậm đặc:

Nhỏ 1 giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc chứa cắn của dịch chiết cồn, thấy xuất hiện màu tím hổng

Phản ứng dương tính

• Phản ứng sơ bộ phân biệt saponin sterolic và saponin triterpenic:

Bố trí thí nghiệm trong 2 ống nghiệm:

• Phản ứng Legal:

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, lắc, không thấy xuất hiện màu hổng

Phản ứng âm tính

• Phản ứng Baljet:

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) không thấy xuất hiện màu đỏ da cam

• Phản ứng Liberman:

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến khô Hoà tan cắn bằng Iml anhydrid acetic Đặt nghiêng ống nghiệm 45”, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống để dịch lọc trong ống nghiệm được chia thành 2

lớp Giữa 2 lớp xuất hiện vòng tím đỏ

Phản ứng dương tính

Kết quả định tính các nhóm chất trong Rau má được tóm-tắt ở bảng

Bảng 1; Kết quà định tính các nhóm chất trong cây Rau má.

1:

1 Alcaloid

Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Bouchardat Acid picric

++++

Có

3 Acid hữu cơ Phản ứng với NajCO, giải

phóng CO2

4 Coumarin

Phản ứng mở và đóng vòng lacton

Soi huỳnh quang Phản ứng diazo hoá

Nhận xét: Bằng các phản ứng định tính sơ bộ 1 số nhóm chất tự nhiên, chúng tôi thấy trong Rau má không có anthranoid, tanin và glycosid tim, có alcaloid, acid hữu cơ, coumarin, flavonoid, saponin và acid amin Trong đó flavonoid và saponin cho phản ứng dương tính rõ nhất, chứng tỏ chúng có hàm lượng cao và là thành phần có tác dụng sinh học chính của Rau má Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 2 nhóm hợp chất này.

3.2.2 Xác định chỉ sô'bọt và chỉ s ố phá huyết của saponin:

• Xác định chỉ sò bọt:

Cân khoảng Ig bột dược liệu cho vào bình nón 250ml Thêm lOOml nước cất, đun cách thuỷ 30 phút, lọc nóng, để nguội rồi cho vào bình định mức lOOml Thêm nước cất đến vạch, dịch chiết để xác định chỉ số bọt

Lấy 10 ống nghiệm (16 X 1,6) đánh số theo thứ tự từ 1 đến 10 và bố trí thí nghiệm theo bảng sau;

Kết quả ống số 6 có cột bọt cao Icm

Chí số bọt (CSB) được tính theo công thức:

lOxVCSB =

ax nTrong đó: V: thể tích dịch chiết để xác định chỉ số bọt

a: khối lượng dược liệu.

n: số thứ tự của ống nghiệm có cột bọt cao Icm

Vậy chỉ số bọt của saponin có trong Rau má là:

10 X 100

CSB = — - = 166,7

1 x 6

* Xác định chỉ số phá huyết của saponin:

* Pha dung dịch dược liệu 10%:

Cân lOg bột dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml Thêm vào 50ml dung dịch NaCl 0,9% Đun cách thuỷ 30 phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp vào cốc, để nguội, chuyển dịch chiết vào bình định mức lOOml Bổ sung dung dịch NaCl 0,9% cho vừa đủ lOOml, lắc đều

* Pha dung dịch máu bò 2%;

- Loại fibrin trong máu:

Trộn cẩn thận 1 thể tích dung dịch Natri citrat 3,65% với 9 thể tích máu bò tươi trong bình nón có nút mài, bảo quản ở 2-4"C

- Pha dung dịch máu 2%;

Lấy 50ml dung dịch NaCl 0,9% cho vào bình định mức lOOml Thêm chính xác 2ml máu bò đã loại fibrin ở trên, lắc nhẹ, thêm dung dịch NaCl 0,9% vừa

đủ lOOml

* Gây hiện tượng phá huyết:

Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5ml) đánh số thứ tự từ 1 đến 20 Cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt các dung dịch ghi trong bảng 3

Trộn đều dung dịch trong ống bằng cách dốc ngược Sau 30 phút lắc lại lần nữa Để yên Sau 24 giờ đọc kết quả

K ết q u ả: Hiện tượng phá huyết xảy ra đầu tiên và hoàn toàn ở ống sô' 9

Bảng 3: Thi nghiệm xác định chỉ sô'phá huyết:

s r i Dung dich NaCl 0,9%

c : nồng độ dung dịch dược liệu ( c =1 % )

X : số ml dịch chiết dược liệu đã cho vào ống nghiệm mà ở đó xảy ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn

Vậy chỉ số phá huyết của saponin trong Rau má đối với máu bò trong điều kiện thí nghiệm là:

2 X 100

CSPH = — — = 44,44

10 X 0,45

3.2.3 Quy trình chiết xuất flavonoid và saponin:

lOOg bột Rau má khô được thấm ẩm bằng lOOml cồn 90” trong 1 giờ cho trương nở hoàn toàn, sau đó cho vào bình cầu thể tích 2 0 0 0 ml với ống sinh hàn hồi lưu Thêm lOOOml cồn 90” ( ngập dược liệu), đun sôi trong 1 giờ Lọc nóng, lấy dịch chiết trong, bã còn lại được tiếp tục chiết thêm 2 lần nữa Gộp toàn bộ dịch chiết, đem thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Phân tán cắn bằng nước cất rồi chuyển vào bình chiết Chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi: Chloroform, Ethylacetat, n-Butanol Đối với mỗi dung môi tiến hành lắc nhiều lần cho đến khi dịch chiết không màu

Từ phân đoạn Ethylacetat sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được hỗn hợp flavonoid (ký hiệu: cắn A).

Từ phân đoạn n-Butanol sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được hỗn hợp saponin (ký hiệu: cắn B).

3.2.4 Định lượng hỗn hợp flavon oid và hỗn hợp saponin :

Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu, sau đó chiết theo quy trình như trên.Cắn A được sấy khô ở 60"c đến khối lượng không đổi, cân rồi tính ra khối lượng hỗn hợp flavonoid (al)

Cán B được sấy khô ở 60" đến khối iượng không đổi, cân rồi tính ra khối lượng hỗn hợp saponin (a2 )

Công thức tính:

a X 10000

Hàm lượng(%) =

A.(IOO-X)

Quy trình chiết xuất được thể hiện trên sơ đổ 1.

Sơ đồ 1; Quy trình chiết xuất Flavonoid và Saponin trong cây Rau má

Trong đó;

A: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g)

X: Hàm ẩm của dược liệu ( 9,11%)

a: lượng cắn khô (g) a = a l: lượng cắn khô hỗn hợp flavonoid

a = a2 : lượng cắn khô hỗn hợp saponin

Bảng 4: Kết quả định lượng hỗn hợp flavonoid và hổn hợp saponin

* Phân tích hỗn hợp flavon oid bằng SKLM:

* Dịch chấm sắc ký: Hoà tan hoàn toàn một ít cắn A trong Metanol

* Tiến hành sắc ký:

110‘’c trong 1 giờ Sắc ký được triển khai với hệ dung môi; Toluen- Ethylacetat- Acid formic (5: 7: 1) Hiện màu các vết chất bằng dung dịch AICI3 3% / ethanol và soi huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại với Ằ=254

nm

K ết quả cho thấy hỗn hợp flavonoid có 11 vết trong hệ sắc ký phân tích ( Bảng 5, H ình 8 a).

Bảng 5: K ết quả phân tích fla vo n o id bằng SKLM

vàngđâm

vàngđâm

vàngnhat

vàngđâm

• P hân lậ p ýlavon oid:

Cắn A được hoà tan hoàn toàn trong 1 lượng tối thiểu M etanol 80% D ung

d ịch đậm đặc này được khai triển qua cột Sephadex L H 20, với dung m ôi đẩy

là M etanol 80% H ứng lần lượt vào 100 ống nghiệm , m ỗi ống khoảng 2 ml

K iểm tra thành phần flavonoid trong các ống bằng sắc ký lớp m ỏng, với thuốc

thử hiện màu là dung dịch AICI3 3%/ Ethanol Gộp dịch rửa giải ở các ống nghiệm có số vết chất giống nhau Bốc hơi dung môi.

* Kết quả cho thấy phân đoạn từ 50-55 (phân đoạn I) và phân đoạn từ 75-85 (phân đoạn II) chỉ có một vết chất trên sắc ký đồ trong các hệ dung môi khai triển (hình 8 b,c,d):

Hệ 1: Toluen : Ethylacetat: Acid formic ( 5 : 7 : 1)

Hệ 2: Toluen : E th y lacetat: Aceton : Acid formic ( 5 : 2 : 2 : 1)

Hệ 3: Ete dầu : E ta n o l: Acid formic ( 1 6 : 7 : 2 )

Chất thu được từ phân đoạn I ký hiệu H2 H2 có giá trị Rf và màu sắc tương tự vết số 8 trong hỗn hợp flavonoid (Hình 8 a)

Chất thu được từ phân đoạn II ký hiệu H l H I có giá trị Rf và màu sắc tương

tự vết số 9 trong hỗn hợp flavonoid (Hình 8 a)

Kết quả thu được trên đây sơ bộ chứng tỏ H I và H2 là 2 thành phần tinh khiết

3.2.6 Nhận dạng H I và H2:

• Nhận dạng H I :

- Chất H I thu được dưới dạng bột, màu vàng, không mùi, vị hơi đắng, dễ tan trong metanol, etanol, diethyl ether, rất ít tan trong chloroform,

- Phổ tử ngoại (UV) đo trong metanol cho 2 đỉnh hấp thụ cực đại 255,5

nm và 371,1 nm đặc trưng cho cấu trúc dẫn chất flavonoid thuộc nhóm flavonol (Phụ lục 1)

- Phổ hồng ngoại (IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh

ở 3283,3 cm * ( ~ V OH); 1600,7 cm'*; 1613 cm ’ ( ~ V c = 0 của vòng

y-pyron); 1513,8 cm '; 1361,0 cm 1314,0 cm ' (~ V -G=C- của nhân thơm) (Phụ lục 1).

- Phổ khối (MS): Phổ khối lượng được ghi bằng phương pháp bắn phá electron với lượng 70ev đã chỉ ra pic [M]"^ có số khối 302 Như vậy khối lượng phân tử của H I là 302 mu Việc tra cứu, so sánh với thư viện phổ đã cho thấy HI có khả năng lớn là Qưercetin với độ trùng lặp 95% Cơ chế phá mảnh của Quercetin được đưa ra (sơ đồ 2-phụ lục 1) là phù hợp với phổ thực nghiệm

Phổ 'H-NM R còn cho thấy tồn tại các nhóm OH trong phân tử H l Từ việc kết hợp sự phân tích phổ MS ( với khối lượng phân tử được xác định là 302 m.Li) và phổ NMR có thể rút ra phân tử HI có chứa 5 nhóm OH Trên cơ sở

đó xác định được công thức cộng của phân tử là C |5Hj„0 7

Trên cở sở phổ HMQC, HMBC kết hợp với các tính toán dựa trên các phần mềm mô phỏng Chem-Draw và ACD/NMR DB v7.05 để hỗ trợ cho việc phân tích phổ, kết quả giải phổ NMR được đưa ra ở bảng 6 Kiểm tra bằng phần mềm mô phỏng cho thấy kết quả này hoàn toàn chính xác

• Kết luận: Căn cứ vào phổ ư v , IR, MS, 'H-NMR, ‘^C-NMR, DEPT,

HMQC và HMBC nhận dạng flavonoid H I là Quercetin

— OH

4H-l-Benzopvran-4-one, 2-(3 ,4 -dihvdroxvphenvD -3,5,7-trihvdroxv

Hình 9: Cấu trúc phẳng của phân tử H ỉ (Quercetin)

• Nhận dạng H2:

- Chất H2 thu được có dạng bột, màu vàng, không mùi, vị hơi đắng, dễ tan trong metanol, etanol, diethyl ether, rất ít tan trong chloroform,

- Phổ tử ngoại (UV) đo trong metanol cho 2 đỉnh hấp thụ cực đại 266,6

nm và 366,6 nm đặc trưng cho cấu trúc dẫn chất flavonoid thuộc nhóm flavonol (Phụ lục 2)

- Phổ hồng ngoại (IR) đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh

ở 3321,4 cm ‘ ( ~ V OH); 1656,8 cm '‘; 1611,5 cm ‘ ( ~ V c = 0 của vòng Ỵ- pyron); 1507,3 em '; 1380,2 em '; 1309,1 cm‘‘(~ V -C=C- của nhân thơm) (Phụ lục 2)

- Việc xác định cấu trúc của H2 được thực hiện hoàn toàn theo phương pháp

đã áp dụng cho H 1 Từ phổ khối lượng xác định được khối lượng phân tử của H2 là 286 mu = 286 mu.) Có thể thấy qua phổ MS H2 có công thức phân lử khác HI một nguyên tử oxy, có nghĩa là H2 có công thức phân tử C|^H|,)Of, Dự báo trên được khẳng định qua việc phân tích phổ ’H-NMR, '^C- NMR, DEPT và HMBC Qua phổ NMR có thể thấy H2 gồm 15 cacbon, trong

đó có 6 CH nhân thơm và 9 cacbon bậc 4 (kém H I một cacbon bậc 4) Tuy nhiên trong 6 nhóm CH có chứa 2 cặp CH tương đương (2 cặp tín hiệu ‘^c có

sự chập của 2 cacbon thành 1 vạch) Điều này chứng tỏ có một vòng thơm được thế đối xứng (para) Phần còn lại của H I và H2 giống nhau về cấu trúc Dựa vào kết quả phân tích phổ NMR của H I ta phân tích phổ NMR của H2 Kết quả phân tích phổ NMR của H2 được chỉ ra ở bảng 7 Kết quả này hoàn loàn phù hợp với kết quả tính dựa vào các phần mềm mô phỏng Chem-Draw

và ACD/NMR DB v7.05 Cơ chế phá mảnh trong phổ khối cũng hoàn toàn phù hợp với phổ thực nghiệm Do đó chất H2 chính là Kaempferol