Nghiên cứu chiết tách, phân lập và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất vitexoid từ phân đoạn dichloromethane của hoa đu đủ đực

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA HỢP CHẤT VITEXOID TỪ PHÂN ĐOẠN DICHLOROMETHANE CỦA HOA ĐU ĐỦ ĐỰC LUẬN VĂN CỬ NHÂN HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Đà Nẵng -Năm 2020 Nghiên cứu chiết tách phân lập hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất Vitexoid từ phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) Study on extraction, isolation and cytotoxic activity of Vitexoid compound from the dichloromethane extract of male Carica papaya flowers SVTH: Nguyễn Thị Kim Phương, Lớp 16CHDE, Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng GVHD: ThS Đỗ Thị Thúy Vân Khoa Hóa Học, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng Summary From the raw papaya flower material, by various methods, the glues were extracted with the corresponding organic solvents: n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate In addition, we report here in the isolation and structural elucidation of compounds: Vitexoid (CP3) were isolated from the dichloromethane extract of the male Carica papaya flowers As well as, reporting on the cytotoxic activity of compound CP3 on cancer cell lines in humans: A549, MCF-7, Hep3B.Their structures were determined by NMR spectra and in comparison with the reported data Keywords Male carica papaya L.; Vitexoid (CP3), lung cancer cells (A549); liver cancer cels (Hep3B); breast cancer cells (MCF-7) Đặt vấn đề Theo thống kê tổ chức y tế giới trường hợp), …Tại việt nam theo thống kê WHO ung thư nguyên nhân gây tử vong tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế đứng thứ toàn cầu khoảng 9,6 (IARC) năm 2018 việt nam có khoảng triệu ca tử vong năm 2018 Trong 165.000 ca ung thư mắc (chiếm bệnh ung thư phổ biến là: phổi 0,17% dân số) số ca tử vong ước tính (2,09 triệu trường hợp), vú (2,09 triệu năm 2018 khoảng 115.000 người ( trường hợp), đại trực tràng (1,80 triệu chiếm 0,12% dân số) dự kiến số vượt 200.000 người vào năm 2020 ung thư phổi LU – ung thư vú MCF Để ngăn ngừa bệnh hiểm nghèo – (với IC50 từ 1,13 – 3,49 µg/mL)[1] nhà khoa học không ngừng Năm 2012 Đỗ Thi Hoa Viên Phụng Thị nghiên cứu tìm loại thuốc Thủy nghiên cứu hoạt động sinh học phương pháp để điều trị bệnh số chiết xuất từ đu đủ: dịch Hiện nay, việc nghiên cứu chiết nước, carotene dịch chiết cách tổng hợp để tạo thuốc người ta phân cực Kết cho thấy nồng độ ứng dụng thiết bị chiết 100g/mL, hoạt tính ức chế dịng tế tách, phân lập hợp chất có hoạt tính từ bào ung thư phổi LU-1 từ 43,47% (dịch thực vật để làm thuốc chữa bệnh đu đủ chiết nước), 62,88% (dịch chiết phân số Cây Đu Đủ (Carica cực) Trên dòng tế bào ung thư biểu mơ papaya L.) lồi ăn trồng KB, khả ức chế thấp 2,8% (chiết hầu hết tỉnh miền Bắc miền Nam xuất phân cực), 20,6% (dịch chiết nước) nước ta Đu đủ khơng lồi Trên tế bào ung thư vú MCF7, khả cho giá trị mặt dinh dưỡng mà cịn ức chế chiết xuất có tác dụng chữa bệnh Trong dân gian, cao từ 33,95% đến 56,19% Trên dòng tế Đu đủ sử dụng để sát khuẩn, bào ung thư bạch cầu HL 60, khả ức kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ chế chiết xuất cao từ điều trị số bệnh 39,56% đến 60,64% Ngoài ra, kết ung thư Năm 2014, Hồ Thị Hà xác tế bào gốc phân lập định phân đoạn cặn chiết diclometan từ phôi chuột (ESC) chiết xuất (CH2Cl2) đu đủ có khả gây khơng độc hại tế bào khỏe độc tế bào ung thư biểu mô B với IC50 = mạnh dịng [6] Năm 2006, Đỗ Thị 18,44 µg/mL, ung thư phổi LU-1 với IC50 Thảo nghiên cứu cặn chiết methanol = 18,21mg/mL, ung thư vú MCF-7 với đu đủ kết có tác dụng gây IC50 = 19,16µg/mL Đồng thời hợp chất độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = carpaine Pseudocarpaine phân lập từ 19,2 μg/mL, khơng có tác dụng gây cặn dichlometan đu đủ lần độc dòng tế bào ung thư khác ung chứng minh có hoạt tính gây độc thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung mạnh dòng tế bào ung thư người: thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt ung thư biểu mô B, ung thư máu HL – 60, tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7 giun sán [3] [7] [2] [8] Đồng thời cặn chiết methanol không dụng hoa đu đủ đực để điều trị gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột bệnh đường hô hấp ho, viêm họng, Về thành phần hóa học, năm 2014, Hồ … Ngồi ra, người ta sử dụng để điều Thị Hà cộng sự, Trường Đại học Bách trị bệnh ung thư như: ung thư phổi, Khoa Hà Nội phân lập xác định ung thư gan, ung thư vú, … cho tác cấu trúc hợp chất, dụng hiệu quả, việc sử dụng Carpainone hợp chất Hai hợp hoa đu đủ đực để điều trị bệnh chất Danielone Apocynol A lần đầu theo phương thức dân gian truyền tiên tách từ đu đủ [1] Năm 2018, miệng cơng trình nghiên Đỗ Thị Thúy Vân cộng phân lập cứu hoa đu đủ đực Do đó, việc xác định cấu trúc hợp chất nghiên cứu thành phần hóa học hoa 1- Đu đủ đực để tìm hiểu hoạt chất có tác hentriacontanol từ cặn chiết chloroform dụng chữa bệnh, chứng minh cho hoạt đu đủ đực [5] tính hoa cơng việc có ý nghĩa Đặc biệt, người dân địa khoa học thực tiễn [4] tetratriacontanyl palmitat phương Đà Nẵng - Quảng Nam sử Bài báo trình bày kết chiết lập xác định cấu trúc hợp chất tách phân lập hợp chất vitexoid từ tinh khiết vitexoid (CP3) phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đực (Carica papaya L.) Bằng phương ung thư hợp chất CP3 dòng tế pháp TLC, CC phương pháp phổ bào ung thư người A549, MCF-7, đại (1H-NMR, 13C-NMR,…) phân Hep3B Nguyên liệu phương pháp Sắc ký lớp mỏng sử dụng mỏng 2.1 Nguyên liệu nhôm tráng sẵn silica gel 60GF254, độ dày Nguyên liệu hoa đu đủ đực 0,2mm Phân lập chất phương thu hái Quảng Nam - Đà Nẵng vào pháp sắc ký cột với chất hấp phụ tháng 01 năm 2017 Hoa đu đủ đực silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck định danh, sau thu hái silicagel pha đảo RP-18 Thuốc thử rửa sạch, phơi, sấy khô xay nhỏ phun lên mỏng chủ yếu sử dụng dung thành bột để sử dụng cho nghiên cứu dịch H2SO4 10%, sau sấy nhiệt độ 2.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu khoảng 110℃ Dung môi dùng để chạy cột triển khai sắc kí lớp mỏng bao gồm siêu âm Cao chiết tổng chế n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, MeOH thêm nước chiết phân lớp với BuOH loại tinh khiết cất lại qua n-hexan, chloroform, dichloromethane cột trước sử dụng để loại tạp chất… ethyl acetate phễu chiết Với Các thiết bị xác định cấu trúc chất: loại dung môi thực chiết lần Các Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, dịch chiết cất loại dung môi thu C-NMR, HSQC HMBC đo máy cao chiết tương ứng (cao chiết Bruker Avance – 500 MHz, chất chuẩn n-hexan, chloroform, dichloromethane nội TMS cho 1H-NMR tín hiệu dung EtOAc) để tiếp tục nghiên cứu môi (CDCl3) cho 13C-NMR Đèn tử ngoại 2.3.2 Phương pháp tách tinh chế (UV BIOBLOCK) bước sóng λ = 254nm chất 13 365nm dùng để soi mỏng Các cao chiết dung mơi Ngồi cịn dùng số trang thiết khác tách tinh chế bị khác máy quay cất chân không, phương pháp sắc kí cột kết hợp với sắc kí máy sấy, máy nung, máy siêu âm, cân lớp mỏng với hệ dung mơi thích hợp phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, Sắc kí cột thường sử dụng silicagel pha loại pipet, bình định mức, giấy lọc, cột thuận pha đảo Đối với chất có khối sắc ký lượng phân tử khác sử dụng 2.3 Phương pháp nghiên cứu sắc kí cột Sephadex LH–18 Trường hợp 2.3.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật cần thiết chạy cột lặp lại nhiều lần Rót dung mơi tinh khiết (H2O, MeOH) dùng phương pháp kết tinh phân vào bình bề mặt lớp bột đoạn, kết tinh lại để tinh chế chất Kiểm Chiết mẫu nhiệt độ từ 800℃ – 900℃ tra độ tinh khiết chất Sau đó, dung dịch chiết lọc ngang theo dõi trình tách chất cột qua tờ giấy lọc Q trình chiết sắc kí lớp mỏng với hệ dung mơi thích lặp lại nhiều lần, lần chiết khoảng hợp 24h Gộp dịch chiết, cất loại dung môi 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc áp suất thấp máy quay cất chân hóa học hợp chất không, thu cao chiết tổng Có thể gia Việc xác định cấu trúc hóa học tăng hiệu chiết cách thỉnh chất thực thông qua thoảng đảo lộn, xốc hoăc sử dụng máy việc đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (1D 2D-NMR) H–NMR, 13 Dồn dịch đặc sau lần chiết, cất loại dung môi bổ sung lít nước cất, sau C–NMR, DEPT, HSQC, phân HMBC, COSY, NOESY… lớp với n-hexane, chloroform, dichloromethane ethyl acetate 2.4 Điều chế cao chiết 2.4.1 Điều chế cao tổng (cao methanol) Phân lớp với n-hexane, chiết lần, Nguyên liệu hoa đu đủ đực sau lần khoảng lít n-hexane Sau cất thu hái, rửa sạch, phơi, sấy khơ, đem loại dung môi áp suất thấp thu xay nhỏ kg bột 54g cao n-hexane Lần 1: Cho 5kg bột nguyên liệu vào Phân lớp với chloroform, chiết lần, bình cầu, cho lít dung dịch methanol, lần khoảng lít chloroform Sau ngâm khoảng 12 Cho vào máy siêu cất loại dung môi áp suất thấp thu âm sử dụng tần số 40kHz khoảng 12g cao chloroform Phân lớp với dichloromethane, chiết Sau lấy dịch chiết đem cất loại dung lần, lần khoảng lít dichloromethane mơi đến gần kiệt tạo dịch đặc Sau cất loại dung mơi áp suất thấp Lần 2: Cho lít dung dịch methanol thu 52g cao dichloromethane vào bả nguyên liệu chiết lần 1, tiếp tục ngâm khoảng 12 Cho vào máy siêu Phân lớp với ethyl acetate, chiết lần, âm sử dụng tần số 40kHz khoảng lần khoảng lít ethyl acetate Sau Sau lọc lấy dịch chiết đem cất loại cất loại dung môi áp suất thấp thu dung môi đến gần kiệt, thu dịch đặc 20g cao ethyl acetate 2.5 Phân lập hợp chất CP3 từ cao Lần 3: Tương tự lần Tiếp CPD túc cho lít dung dịch vào bã nguyên liệu methanol chiết lần 2, ngâm khoảng 12 Cao chiết dichloromethane (CPD, Cho vào máy siêu âm sử dụng tần số 52g) hòa tan với lượng tối thiểu 40kHz khoảng Sau lọc lấy dịch dichloromethane, sau tẩm với 150g chiết đem cất loại dung môi thu silica gel, cất quay bột tơi khô dịch đặc cuối Tiến hành phân tách hỗn hợp cột 2.4.2 Điều chế cao n-hexane (CPH), silica gel pha thường, rửa giải gradient chloroform (CPC), dichloromethane (CPD), ethyl acetate (CPET) dichloromethane/methanol với độ phân hệ dung môi cực tăng dần Kết (dichloromethane/methanol,100:0→ 3.1 Kết phân lập hợp chất hóa học 0:100) thu phân đoạn: CPD1 cao chiết Dichloromethane Hợp chất CP3 phân lập (20,6g), CPD2 (4,0g), CPD3 (2,5g), CPD4 dạng chất nhựa, không màu Công thức (3,5g), CPD5 (15,1g) Phân đoạn CPD2 (4,0 g) phân phân tử C10H16O3, M = 184 Trên phổ 1H- tách cột silica gel pha thường với hệ NMR (500 MHz, CDCl3) CP3 thấy có giải xuất tín hiệu đặc trưng proton dichloromethane/methanol (20/1, v/v) thu nhóm vinylene H 5,93 (1H, dd, J = phân đoạn CPD2A (1,2 g), 10,5; 17,0 Hz, H-7) 5,14 (1H, dd, J = CPD2B (0,8 g), CPD2C (0,5 g) 1,5; 10,5 Hz, H-8a); 5,33 (1H, dd, J = 1,5; CPD2D (1,24 g) Phân đoạn CPD2A (1,2 17,0 Hz, H-8b), nhóm oxymethine - g) phân tách cột silica gel đảo H 4,74 (1H, m, H-4), nhóm methyl với hệ dung môi acetone/nước (2/1, v/v) H 1,27 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-9) 1,33 thu hợp chất CP3 (7 mg) (3H, s, H-10), nhóm methylene H dung mơi rửa CP3 (Vitexoid): Chất nhựa, không 2,03 (1H, m, H-3a); 2,10 (1H, m, H-3b) màu, công thức phân tử C10H16O3, M = 1,78 (1H, dd, J = 3,0; 11,5 Hz, H-5a); 184 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 2,03 (1H, dd, J = 8,0; 15,5 Hz, H-5b), 1 2,67 (1H, m, H-2); 2,03 (1H, m, Ha-3); nhóm methine H 2,67 (1H, m, H-2) 2,10 (1H, m, Hb-3); 4,74 (1H, m, H-4); Phổ 1,78 (1H, dd, J = 3,0; 11,5 Hz, Ha-5); 2,03 CP3 tín hiệu 10 carbon bao gồm (1H, dd, J = 8,0; 15,5 Hz, Hb-5); 5,93 (1H, C-NMR (125 MHz, CDCl3) 13 carbon methyl, carbon methylene, dd, J = 10,5; 17,0 Hz, H-7); 5,14 (1H, dd, carbon methine, carbon liên kết với oxy J = 1,5; 10,5 Hz, Ha-8); 5,33 (1H, dd, J = bậc bốn, carbon vinylene, carbon 1,5; 17,0 Hz, Hb-8); 1,27 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-9); 1,33 (3H, s, H-10) 13 oxymethine carbon carbonyl ester C-NMR Trong đó, diện liên kết đôi (125 MHz, CDCl3): δC 179,34 (C-1); thể qua tín hiệu carbon 33,83 (C-2); 36,60 (C-3); 75,75 (C-4); vinylene C 144,03 (C-7) 112,86 (C- 47,06 (C-5); 72,62 (C-6); 144,03 (C-7); 8) Tín hiệu carbon oxymethine, 112,86 (C-8); 15,84 (C-9) 28,74 (C- carbon carbonyl ester, carbon liên kết với 10) oxy bậc bốn quan sát C 75,75 (C-4); 179,34 (C-1) 72,62 (C-6) 72,62); H-10 (H 1,33) C-5 (C 47,06); Ngoài ra, cấu trúc đặc trưng vòng H-5 (H 1,78; 2,03) C-7 (C 144,03) năm cạnh suy từ chuyển dịch cho phép xác định vị trí carbon bậc hóa học điển hình C 179,34 75,75 C-6 Hai hệ thống tương tác độc lập COSY H- Từ liệu phổ thu kết hợp 9/H-2/H-3/H-4/H-5 H-7/H-8 với với liệu phổ hợp chất tham khảo tương tác HMBC H-2 (H tài liệu[9], cho phép khẳng định hợp chất 2,67)/H-3 (H 2,03; 2,10)/H-9 (H 1,27) CP3 5-(2-hydroxy-2-methylbut-3-en- C-1 (C 179,34); H-5 (H 1,78; 2,03)/H-7 1-yl)-3-methyldihydrofuran-2(3H)-one (H 5,93)/H-10 (H 1,33) C-6 (C (cịn gọi Vitexoid) (Hình 1) HO 10 O 3.2 HO Kết đánh giá hoạt tính O HMBC gây độc tế bào ung thư hợp COSY O chất hóa học Hình Cấu trúc hóa học hợp chất CP3 O Với dòng tế bào ung thư A549 có IC50 54,63±3,67, MCF-7 34,73±1,55 Hep3B 60,37±3,71 Như vậy, hợp chất CP3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng tế bào ung thư người A549, MCF-7, Hep3B Hình Tương tác HMBC, COSY hợp chất CP3 Kết luận NMR, Phổ Từ nguyên liệu ban đầu phương HMBC, phổ COSY, phổ NOESY so pháp khác thu cao chiết sánh với tài liệu tham khảo xác định n-hexan, chloroform, dichloromethane cấu trúc hợp chất tinh khiết CP3 ethyl acetate (Vitexoid) Bằng phương pháp sắc ký cột sắc ký Đã đánh giá hoạt tính gây độc tính tế bào mỏng phân lập hợp chất tinh ung thư hợp chất CP3 (Vitexoid) Kết khiết CP3 Đồng thời phân tích số liệu cho thấy hợp chất CP3 có hoạt tính phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H- gây độc tế bào ung thư dòng tế C-NMR, phổ HSQC, phổ 13 bào ung thư người A549, MCF-7, Hep3B (Carica papaya L.) Quảng Nam – Đà Tài liệu tham khảo Nẵng Tạp chí Dược học, số 10, Trang 58 [1] Hồ Thị Hà (2014) Nghiên cứu hoạt [6] Đỗ Thị Hoa Viên Phụng Thị Thủy tính sinh học mợt sớ hợp chất chiết (2012) Nghiên cứu hoạt động sinh học tách từ Đu đủ(Carica papaya Linn), một số chiết xuất từ đu đủ Việt Luận án tiến sĩ, Đại học Bách khoa Hà Nam, Tạp chí Asean Journal Chemical nội Engineering, số 2, Tập 12 [2] Khan, J., et al (2012) In vitro [7] evaluation of antimicrobial properties of Effectiveness of dried Carica papaya Carica papaya International Journal of seeds Biology, Pharmacy and Allied Sciences, parasitosis: a pilot study Journal of 1(7): p 933-945 medicinal food, 10(1), p 194-196 [3] Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004), [8] Zakaria Z (2006) et al The In vitro Cây Đu đủ kỹ thuật trồng, Nxb lao Antibacterial activity of methanol and động xã hội ethanol extracts of Carica papaya flowers [4] Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu xác and Mangifera indica leaves Journal of định khả phịng chớng ung thư Pharmacology and Toxicology, 2006 chất hóa học mợt số thuốc 1(3): p 278-283 Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học [5] Đỗ Thị Thúy Vân cộng (2018) Hoạt tính gây đợc tế bào ung thư thành phần hóa học đu đủ đực Okeniyi, against J.A., et human al.(2007) intestinal ... dichlometan đu đủ lần độc dòng tế bào ung thư khác ung chứng minh có hoạt tính gây độc thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung mạnh dòng tế bào ung thư người: thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt ung. . .Nghiên cứu chiết tách phân lập hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất Vitexoid từ phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) Study on extraction,... vitexoid (CP3) phân đoạn dichloromethane hoa đu đủ đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đực (Carica papaya L.) Bằng phương ung thư hợp chất CP3 dòng tế pháp TLC, CC phương pháp phổ bào ung thư người