Tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dẫn chất lai hóa dihydroartemisinin và poloxamer 188 qua cầu nối succinyl

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ THỊ TÂM TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ DẪN CHẤT LAI HÓA DIHYDROARTEMISININ VÀ POLOXAMER 188 QUA CẦU NỐI SUCCINYL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ THỊ TÂM MÃ SINH VIÊN: 1501437 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ DẪN CHẤT LAI HÓA DIHYDROARTEMISININ VÀ POLOXAMER 188 QUA CẦU NỐI SUCCINYL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Ngọc Hà TS Đào Nguyệt Sương Huyền Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa đại cương & Vơ Bộ mơn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Ngọc Hà, TS Đào Nguyệt Sương Huyền, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt qng thời gian tơi thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải, TS Nguyễn Văn Giang NCS Nguyễn Thị Ngọc nhiệt tình giúp đỡ, động viên khích lệ và tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trong q trình thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ cán thuộc Phịng Hóa vơ cơ, khoa Hóa và cán Phịng NMR trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội cán Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, xin chân thành cảm ơn Tôi xin cảm ơn bạn bè đồng hành suốt năm tháng học tập trường Xin cảm ơn anh chị, bạn em thực khóa luận phịng thí nghiệm Hóa đại cương & Vơ phịng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược, Bộ mơn Cơng nghiệp Dược ln gắn bó, động viên, giúp đỡ, sẻ chia suốt quãng thời gian thực khóa luận Cuối cùng, xin dành biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, em trai tất người thân gia đình tôi, người yêu thương, ủng hộ để tơi có ngày hơm Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân cịn hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Lê Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hợp chất lai hóa liên hợp thuốc - polymer 1.1.1 Tổng quan hợp chất lai hóa 1.1.2 Tổng quan liên hợp polymer-thuốc 1.2 Tổng quan dihydroartemisinin 1.2.1 Tính chất lý hóa 1.2.2 Tác dụng dược lý 10 1.2.3 Triển vọng phát triển thuốc ung thư dihydroartemisinin 10 1.2.4 Những nghiên cứu liên hợp DHA polymer 12 1.3 Tổng quan poloxamer 13 1.3.1 Tính chất poloxamer 13 1.3.2 Ứng dụng poloxamer 14 1.3.3 Vai trò poloxamer điều trị ung thư 14 1.3.4 Những nghiên cứu phát triển liên hợp poloxamer thuốc 15 1.4 Lựa chọn phương pháp nghiên cứu 16 1.4.1 Lựa chọn hướng tổng hợp 16 1.4.2 Lựa chọn phép thử sinh học 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Tổng hợp hóa học 19 2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất tổng hợp 19 2.3.3 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 20 2.3.4 Xác định độ tan 20 2.3.5 Thử hoạt tính sinh học 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Kết thực nghiệm 23 3.1.1 Xây dựng quy trình tổng hợp 23 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng 24 3.2 Xác định cấu trúc dẫn chất tổng hợp 27 3.3 Xác định độ tan 29 3.4 Thử hoạt tính sinh học 30 3.5 Bàn luận 31 3.5.1 Về phản ứng hóa học 31 3.5.2 Về cấu trúc 33 3.5.3 Về độ tan 38 3.5.4 Về thử hoạt tính sinh học 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic resonance) H-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) AR Analytical reagent ART Artesunat CTCT Công thức cấu tạo CUR Curcumin DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam DHA Dihydroartemisinin DIC N,N’-Diisopropylcarbodiimid DMAP 4-Dimethylaminopyridin DOX Doxorubicin đvC Đơn vị carbon EPR Hiệu ứng tăng tính thấm lưu giữ (Enhanced permeability and retention effect) h Giờ HPMA N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamid IC50 nồng độ ức chế tối đa 50% (Half maximal inhibitory concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) P188 Poloxamer 188 PGA Acid polyglutamic Rf Hệ số lưu giữ SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự Suc Succinyl t° Nhiệt độ T1/2 Thời gian bán thải DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số liên hợp polymer-thuốc nghiên cứu lâm sàng Bảng 1.2 Một số hợp chất lai hóa dẫn chất artemisin polymer Bảng 1.3 So sánh DHA tự liên hợp 8arm-PEG-DHA Bảng 1.4 Một số poloxamer Bảng 2.1 Danh mục dung mơi, hóa chất Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ, thiết bị Bảng 3.1 Ảnh hưởng dung môi tham gia phản ứng Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ mol ART:P188 đến hiệu suất phản ứng Bảng 3.3 Ảnh hưởng lượng dung môi tham gia phản ứng đến hiệu suất phản ứng Bảng 3.4 Kết phân tích phổ hồng ngoại Bảng 3.5 Kết phân tích phổ 1H- NMR (500 MHz, DMSO-d6) ART-P188 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6) ART-P188 Bảng 3.7 Kết thử độ tan sơ ART, P188 ART-P188 Bảng 3.8 Khả gây độc tế bào mẫu dòng tế bào Bảng 3.9 So sánh độ tan ART liên hợp ART-P188 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hợp chất lai azidothymidin-dihydroartemizin Hình 1.2 Công thức cấu tạo hợp chất lai thalidomid-curcumin Hình 1.3 Mô hình liên hợp polymer-thuốc theo Helmut Ringsdorf Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo liên hợp paclitaxel-PGA (CT-2103) Hình 1.5 Công thức cấu tạo DHA Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp DHA ART từ artemisinin Hình 1.7 Sơ đồ liên hợp 8arm-PEG-DHA Hình 1.8 Công thức cấu tạo poloxamer Hình 1.9 Công thức cấu tạo liên hợp CUR-suc-P188-suc-CUR Hình 1.10 Công thức cấu tạo liên hợp DOX-suc-P188 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp liên hợp ART-P188 Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp liên hợp ART-P188 Hình 3.2 Công thức cấu tạo liên hợp ART-P188 Hình 3.3 Cơ chế phản ứng sử dụng DIC DMAP Hình 3.4 Phổ IR chất: liên hợp ART-P188, ART trộn vật lý với P188, nguyên liệu ART P188 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR liên hợp ART-P188 Hình 3.6 Công thức cấu tạo liên hợp ART-P188 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, tỷ lệ mắc ung thư giới có xu hướng tăng nhanh đáng báo động Theo tổng hợp số liệu tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (GLOBOCAN) năm 2018 cho thấy, năm giới có khoảng 18,1 triệu ca mắc ung thư 9,6 triệu ca tử vong [29] Tại Việt Nam, theo tổ chức này, năm 2018 có 164.000 ca mắc mới, ung thư gan ung thư phổi chiếm tỉ lệ cao (15,4%), sau ung thư dày (10,6%), ung thư vú (9,2%), ung thư đại trực tràng (8,9%) [30] Thực trạng cho thấy, nhu cầu phát triển thuốc điều trị ung thư cấp thiết Hiện nay, nhiều nhà khoa học nghiên cứu, phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng bán tổng hợp dẫn chất có hoạt tính tốt Các dẫn xuất artemisinin (phân lập từ Thanh cao hoa vàng) ngồi tác dụng điều trị sốt rét, cịn chứng minh có khả chống tăng sinh tiêu diệt tế bào ung thư [16], [31], [32], [35], [40], [54] Tương tự tác dụng chống sốt rét thông qua gốc tự tạo từ tương tác artemisinin dẫn chất với sắt, dẫn chất điển hình dihydroartemisinin (DHA) [17] Nhưng DHA khó khăn việc áp dụng vào lâm sàng độ tan thấp, thời gian bán thải ngắn [5], [17], [41] Trong hóa trị liệu ung thư, hợp chất lai hóa chứng minh có khả giảm tình trạng kháng thuốc, nâng cao hiệu điều trị [45], [47] Trong lai hóa thuốc với polymer tạo liên hợp polymer-thuốc ví dụ điển hình Liên hợp polymer-thuốc vừa làm tăng khả hòa tan nước, tăng thời gian bán thải, vừa phân phối thuốc chọn lọc đến đích tác dụng nên giảm độc tính [28], [45] Các polymer sử dụng nhiều liên hợp như: polyethylen glycol, poloxamer, acid polyglutamic, N-(2hydroxypropyl) methacrylamid, [28], [45] Trong số poloxamer polymer ứng dụng nhiều dược phẩm với ưu điểm như: tan tốt nước, tương thích sinh học, an tồn với thể, gần chứng minh có khả ức chế tế bào ung thư kháng thuốc [2], [19] Đồng thời, chưa có tài liệu cơng bố việc lai hóa DHA với poloxamer 188 Dựa sở đó, đề tài: “Tổng hợp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dẫn chất lai hóa dihydroartemisinin poloxamer 188 qua cầu nối succinyl” thực với mục tiêu: Tổng hợp dẫn chất lai hóa dihydroartemisinin poloxamer 188 qua cầu succinyl quy mơ phịng thí nghiệm Thử tác dụng chống ung thư hợp chất tổng hợp 57 Yuee C., et al (2016), “Synthesis, characterization and anti-cancer activity of Pluronic F68–curcumin conjugate micelles”, Drug Delivery, 23(7), pp.2587–2595 58 Yuanxiu L., et al (2019), “Progress in the polymer-paclitaxel conjugate”, Journal of Drug Delivery Science and Technology, 54, pp.101237 59 Yuki H., el at (2015), “Direct Evaluation of Molecular States of Piroxicam/Poloxamer Nanosuspension by Suspended-State NMR and RamanSpectroscopies”, Molecular Pharmaceutics, 12, pp.1564-1572 60 Zhang X., et al (2010), “Formulation optimization of dihydroartemisinin nanostructured lipid carrier using response surface methodology”, Powder technology, 197(1-2), pp.120-128 61 Zimmermann G.R., Lehar J., Keith C.T (2007), “Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts”, Drug discovery today, 12(1-2), pp.34-42 62 Zhihong L., et al (2011), “Docetaxel-Loaded Pluronic P123 Polymeric Micelles: in Vitro and in Vivo Evaluation”, International Journal of Molecular Sciences, 12, pp.1684-1696 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1a: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1b: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1c: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2a: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2b: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2c: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 3: Phổ IR liên hợp ART-P188 Phụ lục 4: Phổ IR ART trộn vật lý với P188 Phụ lục 5: Phổ IR ART Phụ lục 6: Phổ IR P188 Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1a: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1b: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 1c: Phổ giãn 1H-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2a: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2b: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 2c: Phổ giãn 13C-NMR liên hợp ART-P188 Phụ lục 3: Phổ IR liên hợp ART-P188 101 100 95 493.57 90 2495.56 3502.02 2637.10 85 448.21 1668.55 2720.97 579.39 690.93 80 %T 725.00 1251.81 75 706.65 1091.94 1717.68cm-1 619.23 484.99 527.29 541.38 70 65 3279.87cm-1 2967.73cm-1 60 835.08 1419.56 2923.57cm-1 1280.65 924.19 55 50 49 4000 513.80 1456.55cm-1 2869.68cm-1 1375.00 1756.60cm-1 871.77 1325.20 1212.50 1031.65 1128.63 1149.60 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1005.44 1250 1000 cm-1 Phụ lục 4: Phổ IR ART trộn vật lý với P188 750 500 400 Phụ lục 5: Phổ IR ART Phụ lục 6: Phổ IR P188 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ... Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ THỊ TÂM MÃ SINH VIÊN: 1501437 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ DẪN CHẤT LAI HÓA DIHYDROARTEMISININ VÀ POLOXAMER 188 QUA CẦU NỐI SUCCINYL. .. nghiệm Thử tác dụng chống ung thư hợp chất tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hợp chất lai hóa liên hợp thuốc - polymer 1.1.1 Tổng quan hợp chất lai hóa Tổng hợp chất bước quan trọng trình phát... hòa tan chất tổng hợp  Thử hoạt tính chất tổng hợp được: tế bào ung thư phổi người A549 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tổng hợp hóa học Tổng hợp hợp chất lai hóa ART poloxamer 188 phản