PHẠM THANH HIỀN NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT, PHÂN lập và TINH CHẾ δ⁹ TETRAHYDROCANNABINOL từ cây cần SA làm NGUYÊN LIỆU THIẾT lập CHẤT CHUẨN LUẬN văn THẠC sĩ dƣợc học

Như vậy, với nhu cầu thực tiễn đòi hỏi có chất chuẩn phục vụ cho công tác giám định nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Δ 9 -tetrahydrocannabino

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn Xuân Trường – Giám đốc Trung tâm giám định ma túy, Viện Khoa học hình sự và TS.Trần Nguyên Hà – Trưởng Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tôi có thể áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Đức Trọng và các anh chị ở Trung tâm Giám định ma túy- Viện Khoa học hình sự đã hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi

và phối hợp giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài Những kinh nghiệm và kỹ năng học hỏi được đã góp phần giúp tôi thực nghiệm chính xác và thực tế hơn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp tôi hoàn thành được khóa học này

Hà Nội, ngày 06 tháng 04 năm 2019

Dược sĩ Phạm Thanh Hiền

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Tên khoa học và đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Thành phần hóa học trong cần sa 4

1.1.3 Sử dụng cần sa 8

1.2 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế 9

1.2.1 Các phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế 9

1.2.2 Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THC 10

1.2.3 Các nghiên cứu tinh chế THC 15

1.3 Phân tích định tính, định lượng cannabinoids trong cây cần sa 16

1.4 Một số phương pháp hóa lý dùng trong đề tài 18

1.4.1 Sắc kí lớp mỏng 18

1.4.2 Sắc kí cột 19

1.4.3 Sắc kí lỏng khối phổ 19

1.4.4 Sắc kí khí 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.2 Phương tiện, dụng cụ 22

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 22

2.2.2 Chất chuẩn và dung môi hóa chất 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 23

2.3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế 23

2.3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng THC tinh chế được 23

2.3.3 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng THC tinh chế bằng

LC-MS/MS 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp chiết xuất THC từ nguyên liệu cần sa 23

2.4.2 Phân lập, tinh chế THC 24

2.4.3 Định tính, xác định cấu trúc của THC tinh chế được 26

2.4.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng THC tinh chế bằng

LC-MS/MS 26

2.4.5 Xử lí kết quả 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng THC bằng LC-MS/MS 29

3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 29

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc kí 31

3.1.3 Kết luận về điều kiện sắc kí 34

3.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất 34

3.2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy 34

3.2.2 Khảo sát thời gian sấy 38

3.2.3 Khảo sát dung môi chiết 39

3.2.4 Kết luận về điều kiện chiết xuất 40

3.3 Phân lập THC từ dịch chiết cần sa 41

3.3.1 Khảo sát lựa chọn hệ dung môi trên sắc kí bản mỏng 41

3.3.2 Phân lập CBD ra khỏi hỗn hợp THC, CBN 43

3.3.3 Phân lập THC ra khỏi hỗn hợp THC, CBN 45

3.3.4 Tinh chế THC bằng sắc kí lỏng điều chế (PHPLC) 47

3.4 Xác định cấu trúc THC tinh chế bằng NMR, MS, IR 49

3.4.1 Kết quả phổ NMR 49

3.4.3 Kết quả phổ MS 53

3.5 Thẩm định phương pháp định lượng THC trong mẫu tinh chế bằng LC-MS/MS.53 3.5.1 Chuẩn bị mẫu 53

3.5.2 Độ thích hợp hệ thống 54

3.5.3 Độ đặc hiệu 54

3.5.4 Khoảng tuyến tính 56

3.5.5 Độ chụm 58

3.5.6 Giới hạn định lượng 60

3.6 Xác định tạp liên quan trong mẫu THC tinh chế 61

Chương 4 BÀN LUẬN 66

4.1 Về qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế THC từ dược liệu 66

4.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế được 67

4.3 Về định tính, định lượng THC tinh chế được bằng LC-MS/MS 67

4.4 Về xây dựng phương pháp xác định tạp liên quan bằng LC-MS/MS 68

4.5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

LLE

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa trong khoa học hình sự 5

Bảng 1.2 Điều kiện phân lập bằng sắc kí cột 12

Bảng 1.3 Điều kiện decarboxyl hóa 14

Bảng 1.4 Điều kiện tinh chế bằng sắc kí lỏng điều chế 16

Bảng 1.5 Một số điều kiện chạy LC/MS 17

Bảng 1.6 Một số hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng 18

Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ của chất phân tích 29

Bảng 3.2 Điều kiện khảo sát pha động rửa giải THC 31

Bảng 3.3 Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát nhiệt độ sấy 35

Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát thời gian sấy 38

Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng THC khi khảo sát dung môi chiết 39

Bảng 3.6 Kết quả phân lập CBD giai đoạn 1 44

Bảng 3.7 Kết quả phân lập THC ở giai đoạn 2 46

Bảng 3.8 Dữ liệu phổ của THC tinh chế và Δ9-tetrahydrocannabinol 50

Bảng 3.9 Kết quả sắc ký thẩm định độ thích hợp hệ thống 54

Bảng 3.10 Kết quả sắc ký thẩm định khoảng tuyến tính 56

Bảng 3.11 Kết quả tính độ chệch từng điểm 57

Bảng 3.12 Kết quả hàm lƣợng mẫu thử khi thẩm định độ lặp lại 58

Bảng 3.13 Kết quả thẩm định độ thu hồi 60

Bảng 3.14 Điều kiện khối phổ 2 chất CBD, CBN 61

Bảng 3.15 Các tạp liên quan dung dịch thử 64

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1Mối quan hệ các thành phần chính trong cây cần sa 8

Hình 1.2 Hệ thống máy UPLC-MS/MS Brucker 20

Hình 3.1 Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 315.2 30

Hình 3.2 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định lượng của THC 30

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định tính của THC 31

Hình 3.4 Chương trình pha động 33

Hình 3.5 Chương trình 33

Hình 3.6 Chương trình pha động 33

Hình 3.7 Chương trình pha động 33

Hình 3.8 Chương trình pha động 33

Hình 3.9 Sắc kí đồ của THCA trong các mẫu (tR=5,4) 36

Hình 3.10 Sắc kí đồ của CBN ở các nhiệt độ sấy 37

Hình 3.11 Sắc ký đồ Thành phần dịch chiết n-hexan 40

Hình 3.12 Biểu đồ phân lập CBD giai đoạn 1 45

Hình 3.13 Biểu đồ phân lập THC giai đoạn 2 46

Hình 3.14 Thành phần dịch phân lập cuối 47

Hình 3.15 Sắc kí đồ tinh chế 48

Hình 3.16 Quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế THC từ cây cần sa 49

Hình 3.17 Phổ IR của chất chuẩn THC 52

Hình 3.18 Phổ IR của mẫu tinh chế 52

Hình 3.19 Sắc ký đồ LC-MS của mẫu tinh chế bắn phá mức năng lượng 10eV 53

Hình 3.20 Sắc ký đồ LC-MS của mẫu chuẩn bắn phá mức năng lượng 10eV 53

Hình 3.21 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 55

Hình 3.22 Đường chuẩn và phương trình hồi qui khoảng tuyến tính 57

Hình 3.23 Sắc kí đồ thẩm định giới hạn định lượng 61

Hình 3.24 Sắc kí đồ CBN trong dung dịch thử 62

Hình 3.25 Sắc kí đồ của CBN trong dung dịch đối chiếu 62

Hình 3.26 Sắc kí đồ CBD trong dung dịch thử 63

Hình 3.27 Sắc kí đồ tạp liên quan của dung dịch thử 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tệ nạn ma túy là hiểm họa đối với toàn xã hội, gây tác hại cho sức khỏe, là nguyên nhân dẫn đến nhiều loại tội phạm khác Cùng với sự gia tăng của tệ nạn ma túy thế giới, những năm qua, tệ nạn ma túy nước ta cũng tăng lên Cần sa và các sản phẩm của cần sa được trồng, sản xuất và buôn bán bất hợp pháp tại nhiều quốc gia, chiếm 65% tổng số vụ bắt giữ ma túy trên thế giới (1.65 triệu vụ) thu giữ 5200 tấn cây cần sa và 1000 tấn nhựa cần sa năm 2006.Năm 2006, hiện có hơn 160 triệu người trên thế giới sử dụng cần sa thường xuyên và hiện vẫn có xu hướng gia tăng [27] Những năm gần đây ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Công an năm 2015, tỷ

lệ sử dụng cần sa ở nước ta chiếm khoảng 1,6-2% số người nghiện nhưng tình hình

sử dụng cần sa trong nhóm thanh thiếu niên ngày càng phổ biến hơn.Thời gian gần đây, cần sa lại được buôn bán dưới nhiều hình thức: buôn bán công khai qua mạng hay được trồng trong vườn ngay tại các ngôi nhà trong thành phố

Theo quy định tại Bộ Luật Hình sự Việt Nam 2015, tất cả các mẫu thu giữ nghi là ma túy đều phải giám định Trong quy trình giám định, hầu hết các phương pháp đều cần dùng đến chất chuẩn

Hoạt chất chính trong cần sa là Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) Chính hoạt chất đó làm cho người sử dụng cần sa có cảm giác hưng phấn, tinh thần lên cao; khi dùng liều cao sẽ gây ảo giác; sử dụng lâu dài gây ra rối loạn tâm thần [47] Để xác định và kết luận giám định là cần sa, ngoài giám định đặc điểm thực vật học, cần phân tích hàm lượng THC trong mẫu vật Đến nay, Trung tâm giám định ma túy, Viện Khoa học hình sự đã thiết lập được một số chất chuẩn nhưng chuẩn THC vẫn phải mua ở nước ngoài với giá cao, thủ tục phức tạp và không chủ động trong công tác giám định tư pháp

Như vậy, với nhu cầu thực tiễn đòi hỏi có chất chuẩn phục vụ cho công tác

giám định nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và

tinh chế Δ 9 -tetrahydrocannabinol từ cây cần sa làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn” với các mục tiêu:

- Chiết xuất, phân lập, tinh chế Δ9-tetrahydrocannabinol từ cây cần sa có hàm lƣợng tối thiểu 95% làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

- Nhận dạng, xác định cấu trúc và xác định tạp liên quan của Δ9tetrahydrocannabinol tinh chế đƣợc

Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng Δ9-tetrahydrocannabinol trong mẫu tinh chế

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Tên khoa học và đặc điểm thực vật

Cây cần sa có tên khoa học là: Canabis sativa, Họ Cần sa (Cannabaceae) [15]

❖ Phân loại theo thực vật học [15]

Lá cây màu xanh đậm, có răng cưa, thô ráp cả hai mặt Cặp lá đầu tiên chỉ có một lá chét, số lượng lá chét tăng dần, tối đa là 13 lá chét trên mỗi lá, phụ thuộc vào giống và điều kiện sinh trưởng.Cặp lá bên dưới thường mọc đối trong khi cặp lá phía trên mọc so le [41]

Cần sa là loài cây lưỡng tính hoặc hoa đơn tính khác gốc [3] Các hoa cái mọc theo chùm gồm một trục chính là hoa lớn và nhánh là các hoa nhỏ Các hoa đực mọc thành các chùy hoa lỏng lẻo [15] Cây đực thường cao hơn nhưng không sum suê bằng cây cái [34]

Hạt cần sa có hình dạng bầu dục và hơi dẹt, màu xanh lục hoặc xám Khi chín hạt đổi màu thành nâu nhạt hoặc nâu [34] Hạt không có nội nhũ, chứa nhiều dầu [3] Quả có chứa một hạt giống gồm hai lá mầm, phần lớn là chứa các chất dự trữ [12]

❖ Trồng và thu hoạch cần sa

Nếu người trồng không loại bỏ những cây đực và cây lưỡng tính (bao gồm cả hoa đực và hoa cái) thì khi hoa đực trưởng thành sẽ bung túi phấn ra Phấn hoa trong tự nhiên theo gió đến với hoa của cây cái Hoa cái sau khi nhận được phấn sẽ thụ phấn và tạo hạt đến cuối vụ người trồng sẽ thu hoạch được hạt cần sa và những bông hoa nhỏ do hoa tập trung vào thụ phấn mà không phát triển hoa

Trên thế giới hiện nay, cần sa được trồng theo hai phương thức chính: ngoài trời hoặc trong nhà Để tăng hàm lượng THC trong cây:đối với cần sa trồng ngoài trời thường được áp dụng kỹ thuật ngăn không cho hoa cái thụ phấn để không tạo hạt; nếu trồng cần sa trong nhà thì kiểm soát các yếu tố: nhiệt độ, pH đất, môi trường (ánh sáng, khí) và kết hợp dùng kỹ thuật nhân giống[43]

Phần lớn những giống cần sa hiện nay có thời điểm thu hoạch vào khoảng tháng 5 hoặc tháng 10 hàng năm Trên cây cần sa, lá hoa và quả là những phần chính chứa hoạt chất tác dụng lên hệ thần kinh được gọi là “những phần chứa ma túy” Khi những bông hoa chuyển thành màu lốm đốm, cánh hoa quăn dần rồi chuyển màu nâu là dấu hiệu báo hiệu đã đến lúc thu hoạch cần sa

1.1.2 Thành phần hóa học trong cần sa

Có khoảng 20 nhóm hợp chất trong cây cần sa, trong đó có 3 nhóm hợp chất chính là: Cannabinoids, Flavonoids, Terpenoid [15] Thành phần Terpenoids và Flavonoids có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của nhóm Cannabinoids trong cây cần sa [34]

 Tổng quan về nhóm hợp chất Cannabinoids

Mechoulam và Gaoni (1967) định nghĩa Cannabinoids là: nhóm các hợp chất 21C có ở hầu hết ở các loài Canabis, bao gồm các dạng: trung tính, acid carboxylic (dạng A, B), các đồng phân và các sản phẩm chuyển hóa của chúng[11], [12]

Cannabinoids là thành phần hoạt tính sinh học chính của cây cần sa [26] Hầu hết các bộ phận trong cây đều chứa Cannabinoids có nhiều trong lá và hoa nhưng hạt không có thành phần này [11], [12]

Phân loại dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra thành 10 nhóm: Cannabigerol, Cannabichromene, Cannabidiol, Delta-9-tetrahydrocannabinol,

cannabinodiol, Cannabitrol và nhóm khác

Trong đó, hợp chất ∆9-Tetrahydrocannabinol (THC) thuộc nhóm

Delta-9-tetrahydrocannabiol,có hoạt tính chính trên thần kinh trung ương Hàm lượng THC

có trong cây phụ thuộc vào tính di truyền, điều kiện nuôi trồng, khí hậu, đất và số năm trồng [34]

Bảng 1.1 Các thành phần Cannabinoids có ý nghĩa trong khoa học hình sự

Tên hợp chất và công thức Đặc điểm và tính chất

(6aR)-6,6,9-trimethyl-3-pentyl-6a,7,8,10a Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol

- Là chất bán rắn màu nâu, chất lỏng nhớt, hoặc là chất rắn màu vàng

- Không tan trong nước (2,8 g/l ở 230C),

- Tan tốt trong Ethanol, Chloroform, Hexan logP = 3.78 – 7.6 [10]

THCA - Công thức phân tử: C22H30O4

- Thuộc nhóm Delta-9- tetrahydrocannabiol

- Gần như không tan trong nước, tan tốt trong dung môi ethanol, chloroform, hexan

Các hợp chất trên có mối quan hệ với nhau thông qua 3 quá trình (hình 1.1) [27]:

 Quá trình sinh tổng hợp

 Quá trình dercarboxyl hóa

 Quá trình thoái hóa như: oxy hóa, đồng phân hóa hay tác động của ánh sáng

CBGA nhờ các enzyme synthase (THCA, CBDA synthase) tạo thành dạng acid phổ biến trong cây là THCA, CBDA Các dạng acid này có thể bị decarboxyl hóa thành dạng trung tính dưới tác động của nhiệt độ, ánh sáng và các yếu tố khác tạo các sản phẩm THC, CBDtương ứng THC sẽ bị oxy hóa tạo CBN, đồng phân hóa tạo Δ8-Tetrahydrocannabinol (Δ8-THC)

Dựa vào thành phần hóa học đặc trưng trên chia thành hai loại cần sa sợi và cần sa ma túy [19], [24], [40] Người ta phân biệt hai loại cần sa trên dựa vào tỉ lệ hàm lượng THC và CBD Bởi vì THC bị oxy hóa một phần thành CBN, nên tổng diện tích píc của THC và CBN được sử dụng và được chia cho diện tích của CBD

[ ] [THC]: diện tích pic của THC trên sắc kí đồ

[CBN]: diện tích pic của CBN trên sắc kí đồ

[CBD]: diện tích pic của CBD trên sắc kí đồ

Hệ thống phân loại của Grlic:

Hình 1.1 Mối quan hệ các thành phần chính trong cây cần sa [36]

1.1.3 Sử dụng cần sa [43]

Theo Nghị định 73/2018/NĐ-CP quy định các danh mục chất ma túy và tiền chất thì cần sa và các chế phẩm trong cần sa đều thuộc danh mục các chất ma túy cấm sử dụng dưới mọi hình thức.Các sản phẩm buôn bán trái phép bao gồm: nhựa cần sa, cây cần sa

Cây cần sa

Các bộ phận nụ hoa và các lá gần nụ hoa chứa một lượng đáng kể THC và chúng được gọi là “những bộ phận chứa ma túy” Chế phẩm sẽ được sàng tách bỏ hết tất cả các phần thân, chỉ giữ lại các hạt hoa và nụ hoa cần sa là những phần chứa khá giàu hàm lượng THC Chế phẩm có thể ở dạng bột hoặc bánh

Nhựa cần sa (Hashish)

Nhựa cần sa được tiết ra trong các tuyến túm lông mọc theo hàng ở hoa hay

bề mặt trên của lá, chứa một hàm lượng lớn THC so với phần khác của cây cần sa

Có nhiều cách để lấy nhựa từ cây cần sa: đập, ép, hay từ máy li tâm “pollinator”

1.2 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế

1.2.1 Các phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế

Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau:

- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội

- Căn cứ chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục

- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa hai pha: Phương pháp chiết ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng

- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phương pháp chiết

ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)

- Căn cứ vào trạng thái làm việc của hai pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp ngấm kiệt

- Dựa vào biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm; Phương pháp khí hóa lỏng; Phương pháp tạo lốc xoáy

1.2.2 Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THC

Cannabioids tồn tại trong cây có hai dạng chính là dạng acid và trung tính THCA phân cực và dễ bị decarboxyl thành THC Hiện có hai hướng để phân lập được THC tinh khiết:

- Phương pháp A: Phân lập THC từ cây cần sa

- Phương pháp B: Phân lập THCA rồi decarboxyl hóa thành THC

1.2.2.1 Chiết xuất và phân lập THC từ cây cần sa (Phương pháp A)

 Các nghiên cứu về chiết xuất cần sa

Hai kỹ thuật chiết xuất phổ biến đối với cần sa là: chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng – lỏng (LLE) Đây là những kĩ thuật thông dụng được sử dụng xử lí mẫu cần sa

để định lượng Trong phân lập, các tác giả hay dùng kĩ thuật chiết xuất đơn giản là ngâm ở nhiệt độ phòng

Dung môi được sử dụng phổ biến bao gồm các dung môi phân cực như methanol [13], [37], ethanol [13], [37], chloroform [28], [30], [37], [38] ; các dung

môi ít phân cực hơn như benzen [22], [37], ether dầu hỏa [14], [37], và n-hexane [14], [20], [22], [37], [46], hỗn hợp dung môi MeOH/CHCL3 (9:1) [12], [13], [19]

và các dung môi khác: aceton, toluene, methyllen clorua [40] Dung môi không phân cực thích hợp cho quá trình chiết xuất là các alkan thẳng và phân nhánh, cụ thể

là pentane, hexan, heptan, octan và nonan

Dung môi ethanol (EtOH) có hiệu suất chiết cao do EtOH có ái lực cao với cấu trúc phân tử cannabinoid Chiết xuất bằng EtOH 96% (v/v) đã được đề xuất trong một dự thảo chuyên đề Cannabis Flos của Dược điển Đức [17]

Các dung môi chiết không phân cực như n-hexan hoặc ether dầu hỏa có thể chiết được chủ yếu các dạng trung tính còn các dung môi khác có thể chiết được cả dạng acid và trung tính [16], [40]

 Các nghiên cứu về phân lập THC

Năm 1964, Gaoni và Mechoulam đã phân lập THC tinh khiết đầu tiên.Từ dịch chiết hexan bằng sắc ký cột lặp lại trên florisil và alumina, tiếp tục phản ứng tạo tinh thể 3,5-dinitrophenylurethane với THC rồi thủy phân bởi kiềm nhẹ để có được THC tinh khiết Độ tinh khiết của THC được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

và phân tích phổ (IR và NMR)

Năm 1965, Korte và cộng sự đã phân lập THC từ dịch chiết xuất của hoa cái của Cannabis Sativa indica và Cannibis Sativa non-indica Dịch chiết đã được chạy trên cột alumina để loại các tạp chất.Sau đó, tinh chế bởi phương pháp lưu động ngược dòng

Các nghiên cứu trên mới là bước đầu, chủ yếu dùng cột silicagel và alumina để phân lập THC và được áp dụng để tinh chế lấy một lượng nhỏ THC.Để thu được nhiều lượng THC và có độ tinh khiết cao hơn, nhiều phương pháp khác cải tiến như: phân lập bằng sắc kí cột, phân đoạn chứa THC sẽ được chưng cất phân đoạn ở áp suất giảm sẽ thu được THC; thực hiện thêm tinh chế bằng sắc kí cột hoặc sắc kí điều chế pha thường hoặc pha đảo để thu được THC trên 95%

Quá trình phân lập thực hiện trên sắc kí cột silicagel hoặc alumina Đối với sắc

kí pha thường, sử dụng dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần Các dung môi

không phân cực hay sử dụng là các alkan mạch thẳng ví dụ nhƣ heptan, hexan, isoctan, ether dầu hỏa Các dung môi phân cực bao gồm ether hữu cơ, rƣợu và các acid hữu cơ nhƣ: ethyl acetat, aceton, diethyl ether, isopropyl alcohol Tỷ lệ dung môi không phân cực: dung môi phân cực có thể thay đổi 100:0 đến 80:20

Bảng 1.2 Điều kiện phân lập bằng sắc kí cột

Tỉ lệ nguyên liệu:

silicagel

Tài liệu tham khảo

1,2 g THC

độ tinh khiết 99%, hiệu suất 55%

dần)

THC 54,74% từ dịch chiết hexan THC 41%

dần)

THC 98%

từ THC 96%

Methanol (phân đoạn 2)

THC 55,56%

[21]

Ví dụ

7

1.2.2.2 Phân lập từ THCA trong cây cần sa (Phương pháp B)

 Các nghiên cứu về chiết xuất, phân lập THCA

Chiết xuất phân đoạn THCA cần chú ý đến nhiệt độ chiết để tránh bị decarboxyl hóa và pH của môi trường chiết để đảm bảo chuyển THCA sang dạng muối [17] Dung môi chiết cũng giống như đã đề cập ở phần trên Dịch chiết acid thu được thêm một base mạnh như natri hydroxyd (NaOH) 0,1M để tạo thành muối rồi tách lấy pha nước [37]

Lehmann và Brenneisen (1992) chiết xuất bằng ether dầu hỏa; dịch chiết thu được tiếp tục được chiết ba lần với 200ml hỗn hợp dung môi NaOH và NaHSO3 Sau đó, acid hóa dịch chiết trên đến pH=3 và chiết lại bằng diethyl ether Phân lập, tinh chế dịch chiết cuối bằng sắc kí lỏng áp suất trung bình (MPL) thu được THCA [14] Cũng theo phương pháp chiết xuất Lehmann và Brenneisen (1992), một tác giả khác phân lập THCA bằng silicagel (63-200µm), hỗn hợp dung môi hexan-toluen-aceton-acid acetic [20]

Goodwin [25] sử dụng dung môi chiết xuất bột cần sa là dung môi không phân cực hoặc hỗn hợp dung môi không phân cực nhóm alkan mạch thẳng và phân nhánh: pentan, hexan, heptan, octan và nonan Dịch chiết được kiềm hóa đến pH=12.7-13.2 tao dạng muối Pha nước (chứa dạng muối natri của THCA) được chiết với dung môi isopropyl ether vì nó hòa tan trong isopropyl ether nhiều hơn là

so với pha nước, kết quả thu được là thành phần của dịch chiết isopropyl ether: 96,4% dạng muối, 0,5% CBD, 0,8% CBN

 Các nghiên cứu về decarboxyl hóa THCA

Mục đích của quá trình decarboxyl hóa này là chuyển THCA phân lập được (THCA trong dịch chiết) thành THC thô để làm nguyên liệu cho bước tinh chế tiếp theo Bảng 1.3 tổng hợp một số điều kiện decarboxyl hóa đã được sử dụng

Bảng 1.3 Điều kiện decarboxyl hóa

Thứ nhất, chiết lấy phân đoạn THCA: Cần chú ý đến pH môi trường chiết vì nếu pH quá kiềm, khi chiết có thể tạo 3 phân lớp (lớp muối ở giữa lớp nước và lớp dung môi hữu cơ) sẽ gây khó khăn cho bước tiếp theo Đồng thời với môi trường

pH đó, có thể tăng sự biến đổi và decarboxyl hóa của THCA dẫn đến ảnh hưởng đến hiệu suất phân lập THC

Thứ hai, quá trình decarboxyl hóa: Việc khảo sát quá trình decarboxyl cần được kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, thời gian gia nhiệt vì có thể xảy ra các phản ứng phụ tạo CBN, CBNA Kiểm soát thời gian gia nhiệt: hàm lượng THC cao nhất

ở 145°C trong 7 phút, sau 40 phút tổng THC giảm đi một nửa; hàm lượng THC cao nhất ở 150°C sau 3 phút, giảm nhanh về 0% sau 7 phút [31] Một trong những điều

kiện khi thực hiện decarboxyl hóa cần thực hiện trong một lọ thủy tinh kín [40] và bơm khí N2 vào trong bình phản ứng để giảm thiểu các phản ứng phụ có thể xảy ra [42]

Để nhằm tối ưu lượng THC thu được theo phương pháp A, ta có thể thực hiện quá trình decarboxyl hóa nhằm chuyển THCA trong dịch chiết hay trong cây thành THC Trong luận văn này, chúng tôi có thể khảo sát decarboxyl hóa ở 2 giai đoạn: chuẩn bị nguyên liệu, xử lí dịch chiết (đã đề cập ở trên)

Trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu trước khi chiết xuất, Taschwer M, Schmid MG đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chuyển hóa THCA thành THC Tác giả đã khảo sát ở 3 nhiệt độ 50, 100, 150°C trong 24h rồi phân tích kết quả bằng HPLC/DAD Ở nhiệt độ 100, 150°C xảy ra quá trình decarboxyl hóa trong thời gian1-2h [41]

Một số điều kiện decarboxyl hóa khác là: sấy ở 105°C trong 15 phút rồi sấy ở145°C trong 55 phút [32] hoặc sấy 110°C trong 1 giờ

1.2.3 Các nghiên cứu tinh chế THC

Khi tinh chế bằng sắc kí lỏng điều chế, sử dụng dung môi rửa giải có độ phân cực giảm dần Dung môi phân cực là nước hoặc đệm acid và nhóm ít phân cực hơn

là alcol carbon ít như methanol, ethanol, isopropanol hoặc acetonitrile với tỉ lệ 50:50 đến 0:100

Phân đoạn thu được ở trên chiết với MBTE (Metyl tert butyl ether) rồi rửa dịch lọc với H2O, loại tạp bằng than hoạt tính, đem bay hơi một phần dung môi rồi lọc và đem chưng cất ở áp suất giảm nhiệt độ<45°C, sau đó duy trì ở nhiệt độ 50-55°C trong 4-4,5 h [23]

Một phương pháp tinh chế khác: tinh chế bằng cột silicagel, kích thước hạt 40µm, một số hệ dung môi khai triển: isooctane: aceton; isooctane: ethyl acetat; isooctane: isopropyl alcohol

Bảng 1.4 Điều kiện tinh chế bằng sắc kí lỏng điều chế

Tài liệu tham khảo

methyl-t-10 ml/ph trong 10phút

25 ml/ph trong 60phút

10 ml/ph trong

10 phút, 25 ml/ph trong 50 phút và cuối cùng 50 ml/ph trong 140 phút

Từ THC 92% thu được THC 98%

[21]

11

1.3 Phân tích định tính, định lượng cannabinoids trong cây cần sa

Về định hướng phân tích định lượng, có hai phương pháp phân tích: định lượng tổng lượng THC (bao gồm THCA và THC) và THC Hiện phương pháp phân tích tại Viện Khoa học hình sự cho phép định lượng tổng THC bằng GC-FID, GC-

MS Đây là phương pháp có độ lặp cao nhưng bởi GC hoạt động dựa trên chương trình nhiệt độ nên sẽ tác động đến quá trình decarboxyl hóa THCA thành THC, và không định lượng được THC riêng lẻ Để phục vụ cho quá trình nghiên cứu chiết xuất, phân lập THC từ cây cần sa để thiết lập chuẩn, chúng tôi xây dựng phương pháp đinh lượng THC riêng lẻ bằng sắc kí lỏng khối phổ Một số điều kiện chạy sắc

kí lỏng khối phổ được trình bày ở bảng 1.5

Các tài liệu tham khảo đều lựa chọn mảnh 193,1 ±0,1 làm mảnh định lượng Nhưng mảnh định tính có sự khác nhau có hai mảnh chính là 123,1 và 259,0 Mảnh định tính có tín hiệu không ổn định và cố định như mảnh định lượng, có thể phụ

thuộc vào cấu tạo tứ cực của từng máy và khả năng ion hóa đầu phun điện tử, năng lượng bắn phá mà các mảnh định tính có thể khác nhau

Bảng 1.5 Một số điều kiện chạy LC/MS

liệu tham khảo

Pha tĩnh Chương trình pha động Tốc độ dòng

(µL/min)

Mảnh

mẹ

Mảnh định lượng

Mảnh định tính

Cột C18

(4,6×100mm,

3,5µm)

H2O(0,1% acid formic)/Acetonitri

l (0,1% acid formic): 10/90

Các hệ dung môi chạy TLC từ đơn giản đến phức tạp (hỗn hợp từ 2 thành phần đến 4 thành phần phần) Hệ dung được công bố khá là phong phú Trong các

hệ dung môi trên hầu như đều có sự kết hợp giữa dung môi hữu cơ như hexan, ether

dầu hỏa và một ether khác như diethylether hoặc di-isopropyl ether Thuốc thử hiện màu đơn giản

Bảng 1.6 Một số hệ dung môi chạy sắc kí lớp mỏng

Hệ dung môi

100:10:1 v/v/v Hiện màu bằng thuốc thử Muối Fast Blue B

1.4 Một số phương pháp hóa lý dùng trong đề tài

1.4.1 Sắc kí lớp mỏng

 Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật sắc kí, trong đó pha tĩnh chứa các chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại làm bằng nhựa; pha động là một hệ dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều dung môi phối hợp nhau theo tỷ lệ quy định Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh mà trên đó đặt các chất cần phân tách Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần trong mẫu thử) được

di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết

quả thu được là một sắc kí đồ trên lớp mỏng Cơ chế sự phân tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [4]

 Ứng dụng [4]

Định tính: Dựa vào giá trị Rf mỗi chất có một giá trị Rf đặc trung cho một hệ dung môi pha động Khi định tính thường so sánh với chất chuẩn trong cùng một điều kiện

Thử tinh khiết: dùng sắc kí lớp mỏng để kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất

thể hiện các vết lạ ngoài vết chính của hợp chất khi triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau

Định lượng: bằng biện pháp chính xác hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng có

thể áp dụng sắc kí lớp mỏng để định lượng

1.4.2 Sắc kí cột

Trong chất sắc kí cột các chất hấp phụ hoặc làm nền cho pha cố định được nhồi trong các ống hình trụ gọi là cột Nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo

cơ chế hấp phụ hoặc cơ chế phân bố [6]

1.4.3 Sắc kí lỏng khối phổ [5]

Sắc ký lỏng khối phổ là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối phổ của detector khối phổ

Trong kỹ thuật LC-MS, sắc ký lỏng hiệu năng cao có vai trò phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong nền mẫu hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với hoạt chất đi vào nguồn ion Do vậy hiệu suất ion hóa được cải thiện góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích

Phương pháp khối phổ là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion m/z được tạo thành trong pha khí phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tùy thuộc cấu tạo của chất phân tích và kỹ thuật ion hóa được sử dụng mà chất phân tích

có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích điện hoặc bị phân mảnh, bẻ gãy cấu trúc phân tử các ion hoặc các tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn Hỗn hợp các ion, tiểu phân mang điện được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác nhau

sẽ chuyển động với tốc độ và quỹ đạo khác nhau Tốc độ, quỹ đạo chuyển động của ion phụ thuộc vào cường độ điện trường của bộ phận phân tích khối, điện tích và khối lượng

Hình 1.2 Hệ thống máy UPLC-MS/MS Brucker

1.4.4 Sắc kí khí

Sắc kí khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thai khí, ứng dụng tốt đối với những chất dễ bay hơi và bền nhiệt Pha động trong GC là chất khí (thường sử dụng các khí trơ như He, Ar, N2 ) Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ Chất phân tích được pha động đưa vào cột dưới dạng hơi Trong cột,xảy ra quá trình tương tác giữa chất phân tích trong pha động (hơi) với pha tĩnh

Do các chất phân tích khác nhau về tính chất lý hóa, chúng được tách ra khỏi nhau [7]

Detector là bộ phận thu nhận, xử lý tín hiệu chất phân tích, chuyển thành các tín hiệu có thể đo lường được Detector sử dụng trong đề tài là detector quang hóa

ngọn lửa (FID) Khí mang từ cột cùng với không khí và hydro đã được đôt cháy ở đầu đốt kim loại Một điện thế dòng một chiều 150-200V được áp vào đầu đốt (cực âm) và cực góp (cực dương) được đạt ngay trên ngọn lửa.Hai điện cực được nối với một mạch điện ngoài để khuếch đại và ghi tín hiệu FID là detector được sử dụng vạn năng, rất nhạy và đáp ứng với tất cả chất hữu cơ, có khoảng tuyến tính rộng Nhược điểm là không đáp ứng với các chất vô cơ vì chúng không cháy được [1]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao UPLC-MS/MS Bruker

- Máy GC-FID, GC-MS Agilent Teachnologies

- Máy sắc ký lỏng điều chế Preparative Agilent Teachnologies 1260

- Cân phân tích Sartorius, d=0,01mg

- Máy siêu âm Elemanosic

- Thiết bị thổi khí nitơ

- Thiết bị cô quay chân không EYELA

- Quang phổ kế Hồng ngoại Thermo Scientific Nicolet iS50

- Tủ sấy, Tủ hút mùi

2.2.2 Chất chuẩn và dung môi hóa chất

- Chất chuẩn THC 5mg/ml của Lipomed Thụy Sĩ; seri: 135.1B56.1L4

- Chất chuẩn CBD của Lipomed Thụy Sĩ, seri:303.1B19.1, lọ 20 mg, HL:99,33%

- Chất chuẩn CBN của Lipomed Thụy sĩ, seri: 377.1B8.3, lọ 20 mg, HL: 99,17%

- Dung môi Hexan, diethyl ether, di-isopropyl ether (Trung Quốc): Tinh khiết để phân tích

- Dung môi Acetonitril (Merk): Tiêu chuẩn dùng cho LC-MS

- Dung môi Methanol (Merk): Tiêu chuẩn dùng cho HPLC

- Silicagel 0,04-0,063µm (Merk): PA

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế

Nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế THC

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất THC từ nguyên liệu cần sa

 Khảo sát các yếu tố:

- Lựa chọn dung môi: Hexan, hỗn hợp dung môi MeOH/CHCL3 (9:1)

- Điều kiện decarboxyl hóa

 Quy trình chiết:

Nguyên liệu được sấy rồi nghiền rây qua màng 0,25 mm Nguyên liệu được ngâm trong dung môi thích hợp Dịch chiết được lọc qua giấy lọc Sau khi xác định hàm lượng, dịch chiết được cô quay chân không thu lấy cắn dược liệu

Xác định hàm lượng THC chiết được:

Định lượng tỷ lệ THC có trong dược liệu bằng LC-MS/MS Tỷ lệ THC được tính theo công thức:

⁄

Trong đó: St: diện tích pic của dung dịch thử

Sc: diện tích pic của dung dịch chuẩn

Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

D: độ pha loãng

: thể tích dung môi chiết mẫu

m: khối lượng cân nguyên liệu (g)

Định tính bằng cách so sánh thời gian lưu của THC, CBD, CBN trong dịch chiết cuối với thời gian lưu của chất chuẩn tương ứng

+ Tỉ lệ nguyên liệu và silicagel (khảo sát trong quá trình phân lập)

+ Khảo sát hệ dung môi chạy cột thích hợp: Dựa trên tài liệu tham khảo và khảo sát trên sắc kí bản mỏng thực tế

 Quy trình phân lập:

Chuẩn bị mẫu:

Một lượng cắn dược liệu thu được ở mục 2.4.1 trộn với silicagel (tỉ lệ 1:1) và một lượng dung môi hexan rồi cô quay chân không đến khô rồi nhẹ nhàng đưa lên cột

Chuẩn bị cột:

Chuẩn bị cột thủy tinh silicagel có khóa điều chỉnh dung môi, được lắp thẳng đứng trên giá Đóng khóa, lót một lớp bông ở dưới và đổ vào cột một ít dung môi đã lựa chọn

Nhồi cột:

Cân một lượng silicagel thích hợp (phụ thuộc lượng mẫu thô đem phân lập) thêm dung môi đã lựa chọn, trộn đều, nhẹ nhàng đưa lên cột, mở khóa cho dung môi chảy tuần hoàn đến khi silicagel được nén chặt (sử dụng máy nén khí) thì khóa cột

Nạp mẫu:

Đưa mẫu từ từ qua một cái phễu dài Mở khóa để cho dung dịch mẫu đi xuống

và hấp phụ vào pha tĩnh Rồi cho 1 ít silicagel lên phía trên để khi đổ dung môi tránh ảnh hưởng đến lớp mẫu Cho hệ dung môi rửa giải vào cột và bắt đầu phân lập

Rửa giải mẫu và thu lấy dịch rửa giải: Dùng các ống nghiệm 5-10 ml để thu lấy dịch rửa giải Mỗi phân đoạn tương ứng với một độ phân cực của dung môi

 Xử lí phân đoạn phân lập được:

- Xác định phân đọan chứa THC bằng GC: so sánh thời gian lưu của mẫu chuẩn với thời gian lưu của chất trong phân đoạn tương ứng

- Tiến hành phân lập trên máy Aligent 1260 pha đảo (RP C18) có detector DAD với hệ dung môi là Acetonitril: H2O

- Xác định phân đoạn chứa THC thu được dựa vào đáp ứng tại bước sóng hấp thụ của chất phân tích

- Xác định hàm lượng THC tinh chế được bằng LC-MS/MS

2.4.3 Định tính, xác định cấu trúc của THC tinh chế được

Xác định cấu trúc, nhận dạng: Từ chất tinh khiết đã tinh chế được, xác định cấu trúc bằng LC-MS, NMR, IR so sánh với phổ chất chuẩn

2.4.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng THC tinh chế bằng LC-MS/MS

Khảo sát điều kiện sắc kí

Thành phần pha động, tốc độ dòng, một số loại cột sắc ký

Thẩm định phương pháp

Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc kí, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC (2016) [9] với các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng

 Độ phù hợp của hệ thống

- Tiến hành: sắc ký 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn THC theo điều kiện đã có

- Ghi nhận SKĐ và xác định các giá trị thời gian lưu, diện tích của pic THC Tính RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic

- Yêu cầu: RSD (%) về diện tích và thời gian lưu nằm trong khoảng quy định của từng nồng độ

 Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trắng, chuẩn và thử thêm chuẩn theo điều kiện đã lựa chọn, ghi nhận SKĐ

Yêu cầu:

- Trên SKĐ dung dịch thử thêm chuẩn, pic chính có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic THC trong SKĐ của dung dịch chuẩn Chênh lệch (RSD%) về thời gian lưu không được quá 5% đối với sắc ký lỏng

- SKĐ mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic THC trong SKĐ dung dịch chuẩn

- Tỷ lệ thu hồi đạt 80-110% với mức nồng độ 10 ppb-1ppm

- RSD (%) của tỷ lệ thu hồi tại mỗi mức nồng độ ≤ 15%

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE

Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV

Độ lệch chuẩn tương đối RSD:

Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký (Y) và nồng độ chất phân tích (C):

Y = aC+b Trong đó:

Hệ số góc a: Hàm SLOPE

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng THC bằng LC-MS/MS

3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Để phân tích được THC bằng LC-MS/MS cần phải xác định được ion phân

tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với chế độ ESI chế độ dương, các ion phân

tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-H]++ Từ ion mẹ đã xác định được tiến hành bắn phá để xác định ion định tính

và ion định lượng

Sử dụng dung dịch chuẩn đơn nồng độ 1000 ng/ml tiêm không qua cột vào

hệ thống MS để xác định ion mẹ và ion con Các điều kiện phân mảnh ion, năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ Từ kết quả tối

ưu hóa, lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính (xem phụ lục 2) Điều kiện khối phổ lựa chọn và phổ

đồ các chất phân tích được trình bày trong các hình

Các thông số máy khối phổ:

- Điện áp đầu phun: 4511V

- Khí chắn: 20 psi

- Nhiệt độ côn: 350oC

- Khí ion hóa 1: 40 psi

- Nhiệt độ ion hóa: 250oC

- Khí ion hóa 2: 45 psi

- CID gas: On: 1,5m Torr

Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ của chất phân tích

Hình 3.1 Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 315.2

Hình 3.2 Phổ khối MS/MS với mảnh ion định lƣợng của THC