Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số flavonoid từ lá cây ô đầu trồng ở tỉnh hà giang

Chiết xuất, phân lập hợp chất trong lá cây Ô đầu .... Tuy nhiên trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần flavonoid trong cây ô đầu, chủ yếu là dẫn chất

HÀ NỘI-2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận này tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu, phòng Đào Tạo, Trường Đại Học Dược Hà Nội, sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở Bộ Môn Thực vật, Khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội, gia đình và bạn bè

Tôi xin được gửi tới lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Quốc Huy,

ThS Vũ Đức Lợi, các thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi tận tình trong quá trình

làm khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô Bộ môn Thực Vật, Trường ĐH Dược Hà Nội; Khoa Y Dược, ĐHQGHN đã luôn giúp

đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới DS Tạ Khắc Công, người đã giúp

đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện, và tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, những người đã động viên, khích lệ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 06 tháng 04 năm 2014

Sinh viên Nguyễn Thị Thủy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.2 Thành phần hóa học 3

1.2.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid 3

1.2.2 Một số flavonoid phân lập được từ chi Aconitum 6

1.3 TÁC DụNG SINH HọC CủA THÀNH PHầN FLAVONOID TRONG CHI ACONITUM 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 16

2.2.1 Thiết bị 16

2.2.2 Hóa chất 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Nghiên cứu định tính flavonoid trong lá cây Ô đầu 17

2.3.1.1 ĐịNH TÍNH FLAVONOID BằNG CÁC PHảN ứNG HOÁ HọC ĐặC TRƯNG 17

2.3.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất trong lá cây Ô đầu 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Định tính flavonoid trong lá cây Ô đầu 21

3.1.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 21

3.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 21

3.2 CHIếT XUấT, PHÂN LậP FLAVONOID Từ LÁ CÂY Ô ĐầU 23

3.3 XÁC ĐịNH CấU TRÚC FLAVONOID PHÂN LậP ĐƯợC 24

BÀN LUẬN 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình chiết xuất, phân lập flavonoid từ loài A.burnatii,

A.variegatum……… 4

Hình 1.2 Quy trình chiết xuất, phân lập flavonoid từ loài A.angustifoliu… 5

Hình 2.1 Mẫu tiêu bản giám định tên khoa học……… 15 Hình 2.2 Quy trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu… …19 Hình 3.1 Sắc ký lớp mỏng dịch chiết methanol từ lá cây ô đầu với thuốc thử AlCl3 21 Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng dịch chiết methanol từ lá cây ô đầu với thuốc thử acid boric/ oxalic (2:1) 22 Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất F3 23 Hình 3.4 Cấu trúc của hợp chất F6 26

H-NMR(500MHz) và 13C-NMR(125MHz) của chất F3 24 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1

H-NMR(500MHz) và 13C-NMR(125MHz) của chất F6

27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ô đầu là cây thuốc quý được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền Trung Quốc và Việt Nam, dùng chữa các bệnh như đau lưng, đau nhức xương khớp, chế biến thành món ăn: cháo ấu tầu – đặc sản Hà Giang, bồi bổ cơ thể, tăng cường thể lực Thành phần hóa học chủ yếu của ô đầu là alcaloid Tuy nhiên trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần flavonoid trong cây ô đầu, chủ yếu là dẫn chất của quercetin và kaempferol Chúng có hoạt tính sinh học mạnh, tăng cường sức đề kháng, giảm tính thấm của mao mạch, hồi phục tính đàn hồi của mao mạch đã bị tổn thương, có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO*

, ROO*, giãn mạch vành, cải thiện tuần hoàn tim, ức chế khối u, chống kết tập tiểu cầu, ngoài ra nó còn

có tác dụng chống phù nề, chống co thắt, kháng histamin, kháng khuẩn, kháng nấm, ngăn ngừa tình trạng tổn thương các nơ-ron vận động của tủy xương [9] Hiện nay, việc nghiên cứu cây ô đầu ở Việt Nam mới nghiên cứu thành phần alcaloid và phương pháp chế biến- sử dụng an toàn nguồn dược liệu Ô đầu, chưa có nghiên cứu về flavonoid Nước ta hiện nay, cây Ô đầu trồng ở các tỉnh: Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu Tuy nhiên, đến nay mới có một số công

bố về cây ô đầu ở Sapa – Lào Cai Với những lý do nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số flavonoid từ lá cây Ô đầu trồng

ở tỉnh Hà Giang”

Với các mục tiêu :

1 Chiết xuất, phân lập một số flavonoid trong lá cây Ô đầu

2 Xác định cấu trúc hóa học của một số flavonoid phân lập được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật

Theo các tài liệu cây Ô đầu ở Việt Nam thuộc chi Aconitum L., vị trí của chi Aconitum L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau

[8]:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Bộ Hoàng liên (Ranunculales)

Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

Chi Aconitum L

Chi Aconitum là là một chi lớn, lần đầu tiên được nhà thực vật học Carl Linaeus xác nhận vào năm 1753 Chi Aconitum L được chia thành 3 phân chi

(subgenera) là [10], [5]:

- Phân chi Aconitum L

- Phân chi Lycotonum (DC.) Petermann

- Phân chi Gymnaconitum (Stapf.) Rapaics

Các loài thuộc chi Aconitum phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới, bắc bán

cầu, ở độ cao khoảng trên 1200m, nơi khí hậu lạnh, mát quanh năm [9]

Cây Ô đầu đã được đưa vào trồng ở Việt Nam từ những năm 1970 Nguồn

gốc của cây Ô đầu đang trồng ở Việt Nam hiện nay gồm :

- Nguồn thứ nhất do ngành Y tế Việt Nam chính thức nhập giống cây từ Trung Quốc về, được trồng ở Sapa, Bắc Hà - Lào Cai và Sìn Hồ - Lai Châu [5], [9]

- Nguồn thứ hai do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ, Đồng Văn,

Hà Giang tự động nhập giống cây Ô đầu từ bên kia biên giới về trồng ở vườn nhà và nương rẫy [5], [9]

Cây Ô đầu ở Việt Nam được biết đến với tên thường gọi là: Gấu tàu,

Ấu tàu, Cố y, Thảo ô, Xuyên ô, Co ú tàu [4], [6], [7] Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Hồng Cường thì cây Ô đầu trồng ở Sapa – Lào Cai có tên

khoa học là: A carmichaeli Debx [5]

1.2 Thành phần hóa học

Đến nay các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi

Aconitum L chủ yếu là về alcaloid Các alcaloid chủ yếu gồm:

Alcaloid diterpenoid: aconitin, lappaconin, ranaconin

Alcaloid không có cấu trúc diterpenoid: isoquinolin ( higenamin, corydin, )

và các amin (dopamin, N – methyladrenalin, tyramin, ), ngoài ra còn có flavonoid, polysaccharid, acid hữu cơ [2], [5] Hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào alcaloid Trên thế giới flavonoid mới được nghiên cứu từ khoảng 20 năm trở lại đây [11] Tại Việt Nam, vẫn chưa có nghiên cứu nào đề cập đến flavonoid

2 Chiết x ất, phâ lập flavo oid

Không có phương pháp chung để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi hữu cơ Phần lớn các flavonoid thường chiết được bằng cồn ở các nồng độ khác nhau và nước [1] Một số phương pháp chiết xuất, phân lập Flavonoid như sau :

Đối với loài A.burnatii, A.variegatum cùng quy trình chiết xuất thu được [16]

Bộ phận trên mặt đất

Phơi, sấy, nghiền Bột dược liệu

n-hexan Dược liệu đã loại chất b o

CHCl3, CHCl3 : MeOH (9:1)

MeOH Dịch chiết methanol

Rửa giải bằng sắc ký cột (MEOH)

(2) L-rhamnopyranoside

Quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-(3)

Quercetin-3-O-β-D-glucopyrano-side-7-O-(6-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranoside

(4) Kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-arabinopyranoside (5) Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside

(6) Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside

Đối với loài A.angustifolium [10]

Bộ phận trên mặt đất

Phơi, sấy, nghiền Bột dược liệu

n-hexan Dược liệu đã loại chất b o

CH2Cl2, CH2Cl2 : MeOH (9:1)

MeOH Dịch chiết methanol

Rửa giải bằng sắc ký cột(MEOH)

2 2 Một s flavo oid phâ lập đượ từ hi A o it m

Theo các nghiên cứu gần đây trên thế giới, một số flavonoid đã được

phân lập từ các bộ phận trên mặt đất của nhiều loài thuộc chi Aconitum, các

flavonoid phân lập được chủ yếu là dẫn chất của : Kaempferol và Quercetin Một số flavonoid thuộc 2 nhóm chất này được trình bày ở bảng 1.1 và 1.2

* Nhóm dẫn chất Quercetin

Các dẫn chất của Quercetin được phân lập từ chi Aconitum chủ yếu tồn

tại dưới dạng glycoside, có rất nhiều loài được nghiên cứu trong đó các loài

được nghiên cứu nhiều là A.vulparia L, A.napellus L

Bảng 1.1 Flavonoid thuộc nhóm dẫn chất quercetin phân lập từ chi

Các dẫn chất Kaempferol được phân lập từ rất nhiều chi Aconitum khác

nhau, cũng tồn tại ở dạng glycosid

Bảng 1.2 Flavonoid thuộc nhóm dẫn chất kaempferol phân lập từ chi

1.3 Tác dụng sinh học của thành phần flavonoid trong chi Aconitum

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về tác dụng của Flavonoid trong chi

Aconitum Một số tác dụng được tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Tác dụng sinh học của một số flavonoid phân lập được từ chi

tương đương với

rutin và cao hơn

nhiều so với acid

ascorbic

Aconitum napellus sp

Lusitanicum

2006 J.C.Luis

và cộng sự [21]

Tauricum,

Aconitum napellus subsp

Neomontanum,

Aconitum paniculatum, Aconitum vulparia

2010

Alessandra Braca và cộng sự

khuẩn : Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia

Aconitum

Ekta menghani

và cộng sự

[18]

coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella

sonnei, Trichophton rubrum, Candida albicans, Aspergillus

niger, Aspergillus flavus

Aconitum

Gabbriella Innocenti

và cộng sự

[14]

Ghi chú:

Chất (1): glucopyranoside-7-O-α-rhamnopyranoside

quercetin-3-O-(6-trans-caffeoyl)-β-glucopyranosyl-(1→2)-β-Chất (2): rhamnopyranoside-3-O-β-glucopyranoside

quercetin-7-O-(6-trans-caffeoyl)-β-glucopyranosyl-(1→3)-α-Chất (3):

kaempferol3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-arabinopyranoside

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu thực vật là cây Ô đầu còn tươi, có đủ thân, rễ, hoa, lá, quả, được thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

Mẫu đã được giám định tên khoa học là: Aconitum carmichaeli

Debeaux, họ Hoàng Liên - Ranunculaceae Được lưu mẫu tại Phòng tiêu bản cây thuốc trường Đại Học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản: HNIP/18057/14 do PGS.TS Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền giám định

Mẫu dùng cho nghiên cứu hóa học là lá cây Ô đầu, thu hái tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Lấy lá cây khi cây đã ra hoa (lá còn tươi) Nguyên liệu lá cây Ô đầu được loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo nước, thái nhỏ, sấy khô ở 600C, bảo quản trong túi polyetylen kín, khô ráo

Hình 2.1 Mẫu tiêu bản giám định tên khoa học

2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2 2 hiết bị

- Cân phân tích (Shimadzu AY220)

- Cân kỹ thuật (ED – Sartorius)

- Tủ sấy (Wise Ven)

- Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 365 nm

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy Sỹ)

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR-8201 PC (Shimadzu)

- Silica gel 60 dùng cho sắc ký cột (Merck)

- Các dụng cụ thông thường đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm

hòa, n-Hexan, EtOAc , CHCl3, MeOH

- Cồn thực phẩm 96% (Việt Nam)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu định tính flavonoid trong lá cây Ô đầu

2.3.1.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng hoá học đặc trưng [3]

* Nguyên tắc: Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng của nhóm chất flavonoid

để xác định sự có mặt của nhóm chất này trong nguyên liệu lá cây Ô đầu ở Hà Giang

* Cách tiến hành:

- Chuẩn bị dịch chiết:

Cân khoảng 5g bột nguyên liệu lá cây Ô đầu cho vào bình nón, thêm khoảng 30ml MeOH, đem siêu âm 30 phút, để nguội, lọc qua giấy lọc Dịch lọc được dùng để thực hiện các phản ứng định tính và sắc ký lớp mỏng

- Tiến hành các phản ứng:

+ Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt), để yên một vài phút

+ Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%

+ Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%

2.3.1.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng [3], [1]

* Cách tiến hành:

- Dịch chấm sắc ký : Mẫu phân tích hòa tan trong methanol

- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) Bản mỏng được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ Để nguội

- Pha động :

+ Ethylacetat-acid acetic-acid formic-nước (10:1:1:2)

+ Toluen-ethylacetat-aceton-acid formic (5:5:2:1)

- Triển khai sắc ký:

- Hiện màu với thuốc thử AlCl3 trong ethanol, quan sát dưới ánh sáng thường

- Tiến hành: Chấm dịch chiết lên trên bản mỏng, sấy nh cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nh cho bay hết dung môi Phát hiện vết ở ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử là dung dịch AlCl3 trong cồn 96% lên bản mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 1100C rồi quan sát dưới ánh sáng thường

2.3.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất trong lá cây Ô đầu

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 3cm dài

60 cm, rửa sạch, để khô, cố định trên giá theo hướng thẳng đứng

- Chất nhồi cột: 50g Silicagel (Merck, cỡ hạt 60 µm), được hóa ở 110oC trong 1h

- Dung môi rửa giải: dùng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan: EtOAc với nồng độ EtOAc tăng từ 0-100%, EtOAc : MeOH tăng từ 0-80%

- Nhồi cột: Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt Cho một lượng vừa đủ dung môi rửa giải vào silicagel đã hoạt hóa, phân tán đều silica gel trong cốc

có mỏ, loại hết bọt khí rồi đổ từ từ thành dòng vào cột theo thành cột chảy xuống Rửa thành cột bằng hỗn hợp dung môi rửa giải Ổn định cột bằng cách

mở khóa cho dung môi chảy vừa dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho đến khi lượng silica-gel trong cột bị n n xuống đến mức không đổi Cho dung môi rửa giải thêm vào cột ngập lớp silicagel 2cm, khóa cột và chuẩn bị nhồi cắn

- Đưa cắn lên cột: Lấy khoảng 10ml dịch chiết đã hòa tan trong MeOH, trộn đều với silica gel đã hoạt hóa, rồi đem bốc hơi dung môi đến khi thu được bột cắn đều khô tơi Đem nghiền mịn hỗn hợp này bằng cối sứ, rồi rắc nh lên lớp silica gel trong cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt Sau đó rắc một lớp cát sạch lên trên lớp cắn vừa rồi để ổn định lớp bột cắn trong cột

- Rửa giải: Trong quá trình rửa giải phải liên tục bổ sung dung môi rửa giải lên cột để bảo đảm dung môi trong cột luôn cao hơn lớp cát khoảng 5cm Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, khai triển với bản mỏng silica gel GF254 (Merck)

- Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM: [2], [3]

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm, dùng thuốc thử là AlCl3 trong ethanol để hiện màu vết flavonoid [1]

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều

Hình 2.2 Quy trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu

Phân đoạn C Phân đoạn E

Cao chiết ethanol

Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm

Dịch lọc

Kiềm hóa bằng Na2CO3, lọc loại tạp

Dịch lọc được acid hóa

Acid hóa bằng dd HCl + dd

NaCl bão hòa

Cao chiết EtOAC (15g)

Chiết 3 lần bằng ethylacetat, cất thu hồi DM dưới áp suất giảm

Rửa giải bằng sắc ký cột

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Định tính flavonoid trong lá cây Ô đầu

3 Đị h tí h bằ phả ứ hóa họ

Định tính flavonoid bằng các phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định sơ bộ

sự có mặt flavonoid có trong dược liệu

Nhận x t : các phản ứng đều cho kết quả dương tính có thể kết luận sơ bộ có

sự có mặt của flavonoid trong lá của cây ô đầu

3 2 Đị h tí h bằ sắ ký lớp mỏ

Sau khi tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng như mục 2.3.1.2 thu được kết quả như sau:

Chú thích: 1 và 2: Dịch chiết methanol lá ô đầu

H1: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 254nm

H2: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, trước khi phun thuốc thử H3: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, sau khi phun thuốc thử

H4: Quan sát dưới ánh sáng thường, sau khi phun thuốc thử

Thuốc thử: AlCl3 2%/ethanol

1 và 2: Dịch chiết methanol lá ô đầu

H5: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, trước khi phun thuốc thử H6: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, sau khi phun thuốc thử

Thuốc thử: acid boric/oxalic (2:1)

Nhận xét: Trên sắc ký đồ có các vết phát quang màu xanh da trời và các vết

này đậm lên sau khi phun thuốc thử

H5 H6

Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng với dịch chiết methanol từ lá cây ô đầu với

thuốc thử acid boric/ oxalic (2:1)

Như vậy từ kết quả định tính và hình ảnh sắc ký lớp mỏng của dịch chiết methanol cho thấy trong lá ô đầu có mặt nhóm hợp chất flavonoid

3.2 Chiết xuất, phân lập flavonoid từ lá cây Ô đầu

1,5 kg lá Ô đầu sau khi thu hái được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 600C

Lá Ô đầu sau đó được ngâm chiết trong ethanol (4 lần x 5lít/lần) Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết ethanol (40g)

Cao chiết ethanol được kiềm hóa bằng dung dịch K2CO3 10% (pH = 8), lọc loại tạp thu được dịch nước, acid hóa bằng acid HCl 10% (pH = 6) và muối ăn NaCl bão hòa Tiếp theo chiết lại bằng ethylacetat (3 lần x 300ml/lần)

và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 15g cao chiết ethylacetat

Cao chiết ethylacetat triển khai sắc ký trên cột silica gel, rửa giải bằng

các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (n-Hexan : EtOAc) với nồng độ

EtOAc tăng từ 0-100%, (EtOAc : MeOH) với nồng độ MeOH tăng từ 0-80%, thu được 130 phân đoạn nhỏ, trong một số phân đoạn kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng cho kết quả tương tự nhau được gộp lại thành các phân đoạn lớn hơn có kí hiệu là: C, E

Sơ đồ chiết xuất, phân lập đã được trình bày ở mục 2.3.2, hình 2.2

Phân đoạn C (4.2g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường cỡ hạt 0.040-0.063mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc:MeOH (80:20) thu

được chất F3 (16mg) Trong đó F3 là tinh thể vàng, R f = 0.45 (CHCl3:MeOH, 85:15) Chất F3 hiện màu với dung dịch FeCl3 5%

Phân đoạn E (1.1g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha đảo YMC

cỡ hạt 0.030-0.050mm, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH : EtOAc (90:10) thu được chất F6 (22mg) Chất F6 có màu vàng, Rf = 0.3 (CHCl3 : MeOH, 15:85))

3.3 Xác định cấu trúc flavonoid phân lập được

Hợp chất F3: Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid (quercitrin)

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất F3

Tinh thể màu vàng nhạt, CTPT: C21H20O11, M= 448, tnc=182-183oC; R f

= 0.45 (CHCl3:MeOH, 85:15); ESI-MS m/z: 448.9 [M+H]+ và 447.2 [M-H]- Phổ 1

H-NMR và 13 C-NMR (đo trong CDCl3) được trình bày ở bảng 3.2