* Cách tiến hành:
- Dịch chấm sắc ký : Mẫu phân tích hòa tan trong methanol.
- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck). Bản mỏng được hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ. Để nguội.
- Pha động :
+ Ethylacetat-acid acetic-acid formic-nước (10:1:1:2) + Toluen-ethylacetat-aceton-acid formic (5:5:2:1). - Triển khai sắc ký:
- Hiện màu với thuốc thử AlCl3 trong ethanol, quan sát dưới ánh sáng thường - Tiến hành: Chấm dịch chiết lên trên bản mỏng, sấy nh cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nh cho bay hết dung môi. Phát hiện vết ở ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử là dung dịch AlCl3 trong cồn 96% lên bản mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 1100C rồi quan sát dưới ánh sáng thường.
2.3.2. Chiết xuất, phân lập hợp chất trong lá cây Ô đầu + Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột [1] + Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột [1]
- Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0.040-0.063mm, 0.063-0.200mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30- 50m, FuJisilisa Chemical Ltd).
- Dịch chiết phân lập: Hòa tan cắn etylacetat với một lượng tối thiểu MeOH để tiến hành phân lập.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 3cm dài 60 cm, rửa sạch, để khô, cố định trên giá theo hướng thẳng đứng.
- Chất nhồi cột: 50g Silicagel (Merck, cỡ hạt 60 µm), được hóa ở 110oC trong 1h. - Dung môi rửa giải: dùng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan: EtOAc với nồng độ EtOAc tăng từ 0-100%, EtOAc : MeOH tăng từ 0-80%. - Nhồi cột: Nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt. Cho một lượng vừa đủ dung môi rửa giải vào silicagel đã hoạt hóa, phân tán đều silica gel trong cốc có mỏ, loại hết bọt khí rồi đổ từ từ thành dòng vào cột theo thành cột chảy xuống. Rửa thành cột bằng hỗn hợp dung môi rửa giải. Ổn định cột bằng cách mở khóa cho dung môi chảy vừa dùng bơm áp lực dồn dung môi xuống cho đến khi lượng silica-gel trong cột bị n n xuống đến mức không đổi. Cho dung môi rửa giải thêm vào cột ngập lớp silicagel 2cm, khóa cột và chuẩn bị nhồi cắn. - Đưa cắn lên cột: Lấy khoảng 10ml dịch chiết đã hòa tan trong MeOH, trộn đều với silica gel đã hoạt hóa, rồi đem bốc hơi dung môi đến khi thu được bột cắn đều khô tơi. Đem nghiền mịn hỗn hợp này bằng cối sứ, rồi rắc nh lên lớp silica gel trong cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt. Sau đó rắc một lớp cát sạch lên trên lớp cắn vừa rồi để ổn định lớp bột cắn trong cột. - Rửa giải: Trong quá trình rửa giải phải liên tục bổ sung dung môi rửa giải lên cột để bảo đảm dung môi trong cột luôn cao hơn lớp cát khoảng 5cm. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, khai triển với bản mỏng silica gel GF254 (Merck).
- Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM: [2], [3]
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm, dùng thuốc thử là AlCl3 trong ethanol để hiện màu vết flavonoid [1].
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều.
Hình 2.2. Quy trình chiết xuất, phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu
Phân đoạn C Phân đoạn E
Chất F3 Chất F6 Lá Ô đầu sấy khô, xay thô
(5-10mm)
Ngâm trong EtOH 96% (4 lần) Dịch chiết ethanol
Cao chiết ethanol
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Dịch lọc
Kiềm hóa bằng Na2CO3, lọc loại tạp
Dịch lọc được acid hóa
Acid hóa bằng dd HCl + dd NaCl bão hòa
Cao chiết EtOAC (15g)
Chiết 3 lần bằng ethylacetat, cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Định tính flavonoid trong lá cây Ô đầu
3 Đị h tí h bằ phả ứ hóa họ
Định tính flavonoid bằng các phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định sơ bộ sự có mặt flavonoid có trong dược liệu.
Bảng 3.1. Kết quả các phản ứng định tính:
STT Tên phản ứng Hiện tượng Kết luận 1 Phản ứng với FeCl3 Màu nâu + 2 Phản ứng với kiềm Màu vàng sáng + 3 Phản ứng cyanidin Màu đỏ thẫm +
Nhận x t : các phản ứng đều cho kết quả dương tính có thể kết luận sơ bộ có sự có mặt của flavonoid trong lá của cây ô đầu.
3 2 Đị h tí h bằ sắ ký lớp mỏ
Sau khi tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng như mục 2.3.1.2. thu được kết quả như sau:
Chú thích: 1 và 2: Dịch chiết methanol lá ô đầu. H1: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 254nm.
H2: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, trước khi phun thuốc thử H3: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, sau khi phun thuốc thử H4: Quan sát dưới ánh sáng thường, sau khi phun thuốc thử
H1 H2 H3 H4
Hình 3.1. Sắc ký lớp mỏng với dịch chiết methanol từ lá cây ô đầu với thuốc thử AlCl3
Chú thích:
1 và 2: Dịch chiết methanol lá ô đầu
H5: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, trước khi phun thuốc thử. H6: Quan sát dưới tia UV tại bước sóng 365nm, sau khi phun thuốc thử. Thuốc thử: acid boric/oxalic (2:1)
Nhận xét: Trên sắc ký đồ có các vết phát quang màu xanh da trời và các vết này đậm lên sau khi phun thuốc thử.
H5 H6
Hình 3.2. Sắc ký lớp mỏng với dịch chiết methanol từ lá cây ô đầu với thuốc thử acid boric/ oxalic (2:1)
Như vậy từ kết quả định tính và hình ảnh sắc ký lớp mỏng của dịch chiết methanol cho thấy trong lá ô đầu có mặt nhóm hợp chất flavonoid.