Nghiên cứu chiết xuất phân lập alcaloid từ cây ô đầu ( aconitum sp ) trồng ở tỉnh hà giang

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ------ PHAN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU Aconitum sp... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THU HU

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

PHAN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU

(Aconitum sp.)

TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Tuấn – giảng viên bộ môn Dược Liệu, và ThS Vũ Đức Lợi - giảng viên khoa Y dược ĐH Quốc Gia Hà Nội, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bộ môn Dược Liệu ĐH Dược Hà Nội, Khoa Y Dược ĐH Quốc Gia Hà Nội, viện Dược Liệu đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn và tại khoa

Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận Cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng

hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Thu Huyền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Thực vật học 3

1.1.1.Vị trí phân loại chi Aconitum L [1], [6], [29] 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L 3

1.1.3 Số lượng và sự phân bố các loài thuộc chi Aconitum L 4

1.2.Thành phần hóa học các cây thuộc chi AconitumL 4

1.2.1 Phân loại alcaloid trong chi AconitumL 5

1.2.2 Một số quy trình chiết xuất phân lập alcaloid từ chi Aconitum L 13

1.3 Công dụng, tác dụng của cây ô đầu 15

1.3.1 Công dụng cây ô đầu 15

1.3.2 Tác dụng dược lý được nghiên cứu 16

1.4 Một số sản phẩm từ cây ô đầu 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1.Nguyên liệu 17

2.2 Hóa chất 17

2.3 Thiết bị 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Nghiên cứu thực vật 18

2.4.2.Nghiên cứu thành phần hoá học 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 22

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 22

3.1.2 Xác định tên khoa học 25

3.2 Định tính alcaloid trong Ô đầu trồng tại Hà giang 25

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 25

3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 26

3.3 Chiết xuất phân lập alcaloid từ phụ tử 29

3.4 Xác định cấu trúc của alcaloid phân lập được 30

3.4.1 Alcaloid OD7 30

3.4.2 Alcaloid OD8 34

3.5 Bàn luận 37

3.5.1 Về tên khoa học của mẫu nghiên cứu 37

3.5.2 Về định tính alcaloid 38

3.5.3 Về chiết xuất phân lậpmột số Alcaloid từAconitum carmichaeliDebx ở Hà giang 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

Kết luận 40

Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: Kết quả giám định mẫu nghiên cứu

PHỤ LỤC 2: Phổ OD7

PHỤ LỤC 3: Phổ OD8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

H-NMR : Hydro nuclear Magnetic Resonance

UV: Ultra Violet Spectroscopy

δ: Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính ppm)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số alcaloid khung cấu trúc C18- diterpenoid phân lập từ

Bảng 1.4 Một số alcaloid thuộc nhóm khác phân lập từ chi Aconitum

Bảng 3.1 Kết quả định tính alcaloid trong Ô đầu Hà Giang bằng phản

ứng hóa học Bảng 3.2 Số liệu phổ 1 H-NMR(500MHz) và 13 C-NMR(125MHz) của

chất OD7 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất OD8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Khung C18- diterpenoid alcaloid

Hình 1.2 Khung C19- diterpenoid alcaloid

Hình 1.3 Khung C20- diterpenoid alcaloid

Hình 1.4 Khung cấu trúc của nhóm Alcaloid bisditerpenoid

Hình 1.5 Quy trình chiết xuất, phân lập alcaloid theo Liang Xiong

Hình 1.6 Quy trình chiết xuất phân lập alcaloid theo Ning Xu

Hình 3.1 Cành Ô đầu có hoa, quả

Hình 3.2 Tiêu bản cây Ô đầu

Hình 3.3 Lá Ô đầu, mặt trên

Hình 3.4 Lá Ô đầu, mặt dưới

Hình 3.5 Hoa của Ô đầu

Hình 3.6 Các bộ phận của hoa Ô đầu

Hình 3.12 Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ Phụ tử

Hình 3.13 Cấu trúc của Chất OD7: Benzoylmesaconitin

Hình 3.14 Cấu trúc của hợp chất OD8: Fuzilin

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ô đầu, phụ tử là một trong những vị thuốc quý được sử dụng từ lâu đời

Những vị thuốc này lấy từ củ của một số loài thuộc chi Aconitum L (chi Ô

đầu) Trong y học cổ truyền nước ta và Trung Quốc thường sử dụng rễ củ của các loài đó với tên vị thuốc là Ô đầu (củ mẹ) và Phụ tử (củ con) [2], [6] Phụ

tử là một vị thuốc hồi dương cứu nghịch, khử phong hàn dùng chữa một số triệu chứng nguy cấp: trụy tim mạch, ra nhiều mồ hôi, chân tay giá lạnh, là một trong 4 vị thuốc quý: sâm, nhung, quế, phụ [2], [3], [4] Ngày nay các

loài thuộc chi Aconitum đã được các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng

trong điều trị nhiều bệnh: viêm khớp, tim mạch, đau, sung huyết [3], [9], [15], [23], [28] với các dạng bào chế hiện đại như dạng viên, ống nước, bột [9] Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu các loài thuộc chi

Aconitum để tìm ra các tác dụng mới cũng như các thuốc mới ứng dụng trong

Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng chủ yếu tại tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [2], [5] Tuy nhiên đến nay chưa có nghiên cứu nào về cây Ô đầu trồng tại tỉnh Hà Giang

Với những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu chiết

xuất phân lập alcaloid từ cây Ô đầu (Aconitum sp.) trồng ở tỉnh Hà

Giang " với các mục tiêu:

1.Giám định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang

2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số alcaloid phân lập được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học

1.1.1.Vị trí phân loại chi Aconitum L [1], [6], [29]

Cây Ô đầu ở Việt Nam thuộc chi Aconitum L., vị trí của chi Aconitum L

trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Bộ Hoàng liên (Ranunculales)

Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

Chi Aconitum L

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L

Các cây thuộc chi Aconitum có những đặc điểm chính như sau: Thân

thảo sống một năm hoặc nhiều năm Lá của các loài thuộc chi Aconitum có màu xanh đậm và không có lá kèm Lá hình bàn tay chia thùy hoặc thùy sâu với 5-7 phần Mỗi phần lại chia thành 3 thùy với hình răng cưa Lá có một sự sắp xếp xoắn ốc Lá ở dưới có cuống dài Hoa mọc thẳng đứng, có thể có màu: xanh đậm, tím, trắng, vàng, hồng với nhiều nhị hoa Hoa được phân biệt bởi có một trong năm đài hoa, hoa có hình mũ Hoa có 2-10 cánh hoa Hai cánh hoa trên to và đặt dưới các đài thân dài Hoa có túi rỗng ở đỉnh chứa mật hoa Những cánh hoa khác nhỏ hoặc không hình thành, có 3-5 lá noãn được

hợp nhất một phần Quả là một tổ hợp các nang, mỗi nang có chứa nhiều hạt[1],[2], [5], [7], [10], [11], [28]

1.1.3 Số lƣợng và sự phân bố các loài thuộc chi Aconitum L

Trên thế giới:

Trên thế giới có khoảng 400 loài thuộc chi Aconitum, phân bố ở khu

vực phía bắc ôn đới, khu vực lạnh ở bán cầu bắc, trong đó Trung Quốc có khoảng 211 loài [30] Phân bố chủ yếu ở vùng núi của Đông Á, Đông Nam Á, Trung Âu, một số cũng thấy ở phía Tây Bắc Mỹ và phía tây nước Mỹ [5],

[29]

Số loài thuộc chi Aconitum đã được ghi nhận đến nay trên thế giới là

948 loài tuy nhiên do có sự trùng lặp về cách đặt tên các loài tại các quốc gia, các vùng khác nhau nên thực chất chỉ có 331 loài được chấp nhận

Tại Việt Nam:

Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có nguồn gốc nhập nội từ 2 nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành Y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc được trồng đầu tiên ở Sapa- Lào Cai từ đầu những năm 70 của thế kỷ trước, sau còn được trồng ở Bắc Hà - Lào Cai và Sìn Hồ- Lai Châu Nguồn thứ 2 do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ, huyện Đồng Văn - Hà Giang tự nhập giống Ô đầu từ bên kia biên giới về trồng ở vườn nhà và nương rẫy Có tài liệu cho rằng cây Ô đầu Việt Nam mọc hoang ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [2],[5], [9]

1.2.Thành phần hóa học các cây thuộc chi AconitumL

Những loài thuộc chi Aconitum có 3 thành phần hóa học hay gặp nhất

đó là alcaloid, polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần

chính Trong các bộ phận của cây như: thân cây, rễ củ, lá cây, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất alcaloid, acid hữu cơ, đường tự do, acid amin Rễ củ có

thêm chất béo và sterol Thân cây có thêm carotenoid Lá và hoa có thêm carotenoid, sterol và flavonoid Hạt có thêm chất béo và carotenoid[5], [8],[9],

[28]

Trong đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu về thành phần alcaloid

1.2.1 Phân loại alcaloid trong chi AconitumL

Căn cứ vào cấu trúc của khung diterpenoid, số lượng nguyên tử C chia các alcaloid này thành các nhóm chính:

- Khung C18- diterpenoid alcaloid

- Khung C19- diterpenoid alcaloid

- Khung C20- diterpenoid alcaloid

- Nhóm Bisditerpenoid

- Nhóm alcaloid khác

Dựa vào số liên kết ester với khung diterpenoid, các nhóm chính này được chia thành 3 nhóm: alcaloid diester (aconitin, mesaconitin ), alcaloid monoester (benzoylaconin, benzoylmesaconin), alcaloid alkamin [9], [28]

1.2.1.1 Alcaloid C18-diterpenoid

Các C18-diterpen alcaloid có nguồn gốc từ các C19-diterpen alcaloid, khung carbon có chứa 18C do mất đi C18 Trong các hợp chất này, C4 được thay thế bởi 1 nguyên tử hydrogen, hoặc một nhóm ester hoặc nhóm 3,4-

epoxid Nhóm C18-diterpen alcaloid chia thành 2 nhóm là: lappaconin và ranaconin [28]

Hình 1.1 Khung C 18 - diterpenoid alcaloid

Đã có nhiều alcaloid C18-diterpenoid được phân lập từ chi Aconitum

Dưới đây là bảng thống kêmột số alcaloid đã phân lập

Bảng 1.1 Một số alcaloid khung cấu trúc C 18 -diterpenoid phân lập từ chi

3 4 5 6

78

9

1011

12

13

14

1516

R

H

12

3

78

910

11

12

1314

1516

17

Hình 1.2 Khung C 19 -diterpenoid alcaloid

Các alcaloid C19-diterpenoid được tìm thấy trong nhiều loài

Aconitumspp đã có trên 250 hợp chất được công bố Những hợp chất này có

thể chia làm 4 nhóm chính là: nhóm aconitin (aconitin, mesaconitin, hypaconitin ), nhóm lycoctonin (lycaconitin, lycoctonin ), nhóm pyrodelphinin (flaconitin, mithaconitin ), nhóm heteratisin (heteratisin, benzoylheteratisin ) [9], [28] Sau đây là một số chất điển hình:

Bảng 1.2 Một số alcaloid khung cấu trúc C 19 -diterpenoid phân lập từ chi

N R

H

1 2

8

9 10

Hình 1.3 Khung C 20 -diterpenoid alcaloid

Dưới đây là một số alcaloid C20-diterpenoid đã được phân lập từ các

loài thuộc chi Aconitum

Bảng 1.3:Một số alcaloid khung cấu trúc C 20 -diterpenoid phân lập từ chi

Hình 1.4 Khung cấu trúc của nhóm Alcaloid bisditerpenoid

Một số alcaloid thuộc nhóm bisditerpenoid được phân lập như:

trichocarpin A, trichocarpin B (A tanguticum) [28],piepunin (phân lập từ A

piepunense), pukeensin (phân lập từ A pukeense)

1.2.1.5 Alcaloid thuộc nhóm khác

Nhiều nghiên cứu còn tìm thấy các chất không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô đầu, bao gồm các isoquinolin và các amin

Bảng 1.4: Một số alcaloid thuộc nhóm khác phân lập từ chi Aconitum

1 Isoatisin A heterophyllum C22H33NO2 [32]

2 Aconicaramid A carmichaeli C11H14N2O3 [16]

1.2.2 Một số quy trình chiết xuất phân lập alcaloid từ chi Aconitum L

Trong các loài thuộc chi Aconitumchứa nhiều loại alcaloid với các dạng

tồn tại và độ phân cực khác nhau vì vậy có thể chiết xuất, phân lập alcaloid

từAconitum theo nhiều phương pháp với nhiều dung môi khác nhau Dưới đây

là một số quy trình chiết xuất phân lập alcaloid:

+Liang Xiong và các cộng sựđã chiết xuất một số alcaloid từ loài

Aconitum carmichaeli: aconicarmin (1), fuzilin (2), neolin (3),

N-ethylhokbusin B (4), aconicaramid (5), 5-hydroxymethylpyrrol-2-carbaldehyd (6), oleracein E (7) theo quy trình chiết xuất ở hình 1.5 [30]:

Hình 1.5 Quy trình chiết xuất, phân lập alcaloid theo Liang Xiong

+ Một số alcaloid trong Aconitum kusnezoffii Reichb đã được chiết

xuất và phân lập từ 5 kg bột củ con Chiết xuất theo quy trình ở hình 1.6 thu

SK Sephadex LH-20

Cao chiết ethanol (620g)

Cao chiết n-butanol (85g)

Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0,063-0,2mm Hệ dung môi là: CHCl3-MeOH (50:1-1:1)

Chiết bằng n-butanol (2,5l x 5 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

C

được các hợp chất 1,15-dimethoxy-3-hydroxy-14-benzoyl-16-ketoneolin (4.1 mg), benzoylaconin (5.2 mg) và aconitin (3.2 mg) [31]

Bb

Hình 1.6 Quy trình chiết xuất phân lập alcaloid theo Ning Xu

1.3 Công dụng, tác dụng của cây ô đầu

1.3.1 Công dụng cây ô đầu

Theo y học cổ truyền: cây ô đầu từ trước tới nay chủ yếu dùng phần củ mẹ (ô đầu) và củ con (phụ tử) [2], [4]

1.3.1.1 Ô đầu

- Công năng: Khu phong, trừ thấp tý, ôn kinh chỉ thống

- Chủ trị: Dùng trị đau khớp, tê mỏi cơ

Triển khai sắc ký cột silica gelDM ether dầu hỏa : EtOAc

Cao chiết ethanol

Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm

- Cách dùng liều lượng: Dùng ngoài xoa bóp dưới dạng thuốc ngâm rượu, không được uống[2], [4]

1.3.1.2 Phụ tử

- Công năng: Hồi dương cứu nghịch, bổ hoả trợ dương, tán hàn, chỉ thống

- Chủ trị: Chứng vong dương, thoát dương, chân tay lạnh, đau nhức xương khớp, lưng gối đau lạnh, chân tay phù nề

- Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng 4-12g dược liệu đã bào chế đạt tiêu chuẩn giới hạn aconitin, dạng thuốc sắc [2], [4]

1.3.2 Tác dụng dƣợc lý đƣợc nghiên cứu

Dịch chiết, chất phân lập được từ củ cây ô đầu đã được thử nghiệm có rất nhiều tác dụng như: tác dụng giảm đau, gây hạ đường huyết, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống tăng sinh tế bào, chống ung thư, trên hệ tim mạch, chống sốc, chống hạ thân nhiệt, chống viêm, hệ miễn dịch, chống động kinh [2], [8], [9]

1.4 Một số sản phẩm từ cây ô đầu

Trên thị trường cũng có nhiều sản phẩm làm từ cây ô đầu như:

- Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty Cổ phần Traphaco trị đau nhức xương khớp [38]

- Sản phẩm Vatsanabha của Ấn Độ: giảm đau, chống viêm khớp (15-30g bột/ngày)

- Sản phẩm khác chứa loài thuộc Aconitum với tác dụng tăng cường miễn

dịch, chống viêm, giảm đau, tim mạch như: Aconite 30C, Boiron, Hylands

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Nguyên liệu

Thu hái mẫu cây Ô đầu trồng và mọc hoang ở huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang Lấy củ mẹ, củ con của cây khi cây đã ra hoa và lụi Lấy lá cây khi cây

đã ra quả Nguyên liệu được sấy khô ở 600

C, bảo quản trong túi polyetylen kín, khô ráo Mẫu nghiên cứu về thành phần hóa học là củ của cây Ô đầu

Mẫu cây có hoa quả để định tên khoa học thu hái vào ngày 29/9/2012 tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Mẫu cây tươi được tiến hành làm tiêu bản

và lưu giữ tại:

+ Phòng tiêu bản Khoa tài nguyên cây thuốc, Viện Dược liệu, tiêu bản số:

9938

+ Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật, trường ĐH Dược Hà Nội, tiêu bản số: HNIP/1057/14

+ Bộ môn Dược liệu-Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia

Hà Nội, tiêu bản số: SMPIP/01/14

2.2 Hóa chất

- Dung môi, hóa chất sử dụng trong thực nghiệm đạt tiêu chuẩn phân tích + Chất đối chiếu Aconitin

+ Methanol, Cloroform, Aceton, Ethanol, n- Hexan

+ Acid sulfuric, Acid formic, Amoniac, NaOH

+ Silicagel sắc ký cột (Silicagel, Merck)

+ Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn

2.3 Thiết bị

- Thiết bị để nghiên cứu về thực vật:

Quan sát phân tích đặc điểm lá, thân, rễ củ, hoa và chụp ảnh

- Thiết bị nghiên cứu thành phần hoá học và xác định cấu trúc các chất:

- Máy cất quay BUCHI waterbath B480-Đức

- Máy siêu âm

- Bình gạn thủy tinh 250ml

- Bình nón 250ml, bình cầu 100ml

- Cột sắc ký thủy tinh các loại

- Đo điểm chảy trên máy Kofler micro-hotstage, Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

- Phổ hồng ngoại được đo đưới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 Nicolet tại Viện Hoá Học, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam

- Phổkhối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học,Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D- NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR của Viện Hoá học,Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu thực vật

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

- Thẩm định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với các khoá phân loại thực vật [1], [2], [6], [7], [10], [29] tham khảo ý kiến chuyên gia về phân loại thực vật

2.4.2.Nghiên cứu thành phần hoá học

Cloroform-Methanol-2.4.2.2 Chiết xuất và phân lập alcaloid

Phương pháp

- Chiết xuất: sử dụng dung môi cồn để chiết xuất các alcaloid, sau đó kiềm hóa bằng NH3 đặc để chuyển các alcaloid sang dạng muối, tiếp tục chiết bằng dung môi n-hexan để làm giàu các alcaloid

- Phân lập các hợp chất trong Ô đầu, Phụ tử bằng sắc ký cột và SKLM điều chế

- Tiến hành:

+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 4cm, chiều dài 35 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng + Chất nhồi cột:Silicagel pha thuận (0,040-0,063mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), được ngâm trong dung môi khai triển 8-12 giờ

+ Dung môi rửa giải: n-Hexan-EtOAc gradient

+ Nhồi cột: Cho ít bông vào đáy cột, đổ silicagel trong dung môi vào cột, đổ thành dòng từ từ vào cột vừa đổ vừa gõ nhẹ để tránh bọt khí lọt vào cột Để 30phút cho silicagel lắng xuống dưới ở mức không đổi.Rút bớt dung môi trong cột đến khi bề mặt dung môi cách khoảng 1-2 mm so với mặt lớp silicagel

+ Đưa cắn lên cột:Hòa tan cắn alcaloid bằng một lượng tối thiểu dung môi rửa giải, nhỏ từ từ dung dịch chất vào trên cột, tránh xáo trộn lớp silicagel trên bề mặt

+ Rửa giải: Mở khóa cho dung môi nhỏ giọt xuống, để 1 thời gian cho chất hấp phụ lên silicagel, thêm ít dung môi để đảm bảo silicagel luôn ngập trong dung môi

- Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM:

+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60GF254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO410% trong ethanol

+ SKLM điều chế thực hiện trên bản mỏng như SKLM ở trên sau đó cắt phần ngoài bản mỏng, phun thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó

cạo lớp silica gel có chất, phản hấp phụ và tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp

2.4.2.3 Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc

+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều