3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật
Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 0,6- 2m hoặc hơn, phần thân trên mặt đất lụi hàng năm. Rễ củ gồm củ mẹ ở giữa và các củ con mọc xung quanh, có hình con quay, hình nón thuôn, đường kính 1-4cm, dài 3-9cm. Thân khí sinh mọc thẳng ít phân cành, phần thân non và ngọn có lông đơn bào cong.
Lá đơn, mọc so le, phiến lá có dạng gần hình tim tròn hoặc xẻ 3 thùy sâu, hai thùy bên xẻ tiếp thành 5 thùy không đều nhau, mép khía răng cưa to, gân lá hình chân vịt, cuống lá, mặt trên có lông tơ.
Cụm hoa dạng chùm đơn, mọc ở ngọn thân và kẽ lá, dài 10-30 cm gồm nhiều hoa màu xanh tím. Cuống hoa dài 2-6 cm, cuống hoa và cụm hoa có lông tơ dày cong, các lá bắc ở phần dưới cụm hoa chia 3 thùy hình mác, 2 lá bắc con nhỏ dài 4-8mm, rộng 1-2,5mm, 2 mặt có lông tơ. Hoa không đều lưỡng tính, 5 lá đài mặt ngoài có lông tơ ngắn, lá đài trên hình mũ cao, hơi dẹt trùm lên 2 lá đài bên và 2 cánh hoa dài 2-3cm, rộng 1,8-2,5cm. Hai lá đài bên hình trứng dài 1,7-2,2 cm, rộng 1,8-2,6cm. Hai lá đài dưới thuôn dài 1,3-2cm, rộng không đều nhau. Tràng hoa gồm 2 cánh hoa tiêu giảm, nhẵn, dài 1,8- 2,1cm nằm trong lá đài trên, hai bên cuộn vào thành hình trụ. Nhị nhiều (40- 46) không có lông, dài 9-12mm, chỉ nhị rộng có cánh ở dưới, bao phấn 2 ô đính gốc hình cầu hoặc elip nứt dọc. Bầu trên dài 5-12mm, có lông nhỏ rải rác. Lá noãn 5, rời, mỗi lá noãn có nhiều noãn, đính bên. Vòi nhụy ngắn hơn bầu nhụy.
Quả gồm 5 đại hình elip dài 1,5-2,5cm, đường kính 0,5cm, có mỏ ngắn, đài không tồn tại. Trong mỗi đại chứa 10-20 hạt dẹt, dài 4-5mm, rộng 2-3mm, có cánh mỏng.
Hình 3.1. Cành Ô đầu có hoa, quả Hình 3.2. Tiêu bản cây Ô đầu
Hình 3.5. Hoa của Ô đầu Hình 3.6. Các bộ phận hoa Ô đầu
Hình 3.7. Nhụy hoa Hình 3.8. Nhị hoa
3.1.2. Xác định tên khoa học
Sau khi tiến hành quan sát và phân tích các bộ phận của mẫu cây Ô đầu thu hái tại Hà Giang, căn cứ vào khóa phân loại trong cuốn Thực vật chí Trung Quốc (2001) [29], đồng thời đối chiếu với các tài liệu tham khảo như Danh lục các loài thực vật Việt Nam [1], Cây cỏ Việt Nam[10], so sánh với các tiêu bản về cây Ô đầu thu thập trước đây đang được lưu tại Viện Dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, mẫu nghiên cứu đã được chuyên gia về thực vật học xác định tên khoa học là:
Aconitum carmichaeli Debx., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae). (Mẫu giám định chi tiết tên khoa học của mẫu cây Ô đầu được ghi trong phần phụ lục 1)
3.2. Định tính alcaloid trong Ô đầu trồng tại Hà giang
Định tính alcaloid bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị dịch chiết: Cân khoảng 5g bột dược liệucho vào cốc có mỏ 100ml, thêm 40ml MeOH, siêu âm 20 phút trong bể siêu âm, lọc lấy dịch lọc. Dịch lọc được cất quay đến 10ml rồi thêm 5ml dd H2SO4 10% để chiết. Thêm 10ml CHCl3 vào lắc đều chiết lấy lớp nước, làm 3 lần mỗi lần x10ml CHCl3. Tiếp theo cho dd NaOH 5% vào đến khi pH=12, lắc với CHCl3 chiết lấy lớp dung môi hữu cơ, 3 lần x 10ml, gộp dịch chiết lại cất thu hồi dung môi, cắn dùng để làm các phản ứng định tính và SKLM [26].
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học - Cách tiến hành: - Cách tiến hành:
Lấy một ít cắn cho vào ống nghiệm, hòa tan cắn bằng 2-3 ml H2SO4 1N, chia dịch chiết này vào 3 ống nghiệm:
Ống 2: Cho 1-2 giọt thuốc thử Bouchardat. Ống 3: Cho 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff. - Kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Kết quả định tính alcaloid trong Ô đầu Hà Giang bằng phản ứng hóa học Phản ứng Kết quả Đánh giá TT Mayer +++ Có TT Bouchardat +++ TT Dragendorff +++ Chú thích:
+++ Phản ứng tủa nhiều ++ Phản ứng có tủa +Phản ứng ít tủa
Nhận xét: Qua thực nghiệm sơ bộ xác định được trong dịch chiết Ô đầu có alcaloid.
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Dịch chiết toàn phần rễ củ Ô đầu: Hòa tan cắn bằng 1-2 ml EtOH.
- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 20mg Aconitin (latoxan-pháp) trong 10 ml MeOH.
- Bản mỏng Silicagel GF245: Hoạt hóaở 110oC trong 1 giờ.
- Khai triển sắc ký: Tiến hành chấm riêng biệt dịch chiết dược liệu và dịch Aconitin đối chiếu lên bản mỏng, khai triển sắc ký với 3 hệ dung môi sau:
Hệ I: Cloroform-Methanol (9:1), [3]
Hệ II: Cloroform-Methanol-Amoniac(50:9:1) Hệ III: Cloroform-Aceton-Acid formic (5:2:1)
- Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm. Hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff.
- Sắc ký đồ cho thấy với hệ I các vết dính nhau không tách, cả 2 hệ II và III đều tách vết rõ, số lượng vết nhiều tuy nhiên hệ II không ổn định bằng hệ III do có Amoniac trong hệ bay hơi mạnh ảnh dễ hưởng đến vết sắc ký.
- Kết quả sắc ký lớp mỏng khai triển với hệ dung môi III: Cloroform-Aceton- Acid formic (5:2:1), sau khi hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff được trình bày ở sắc ký đồ (hình 3.11).
UV 366 UV 254 TT Dragendorff Chú thích: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DL: Dịch chiết toàn phần rễ củ Ô đầu ĐC: Dịch Chiết Aconitin đối chiếu
UV 366: Sắc ký đồ chụp ở bước sóng UV 366nm UV 254: Sắc ký đồ chụp ở bước sóng UV 254nm
TT: Sắc ký đồ chụp sau khi hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff.
Hình 3.11. Ảnh chụp sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần từ củ Ô đầu Hà Giang.
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết toàn phần rễcủ Ô đầusau khi phun thuốc thử Dragendorff có 10 vết alcaloid tách rõ và trên sắc ký đồ cũng có vết tương ứng cùng màu và cùng giá trị Rf với vết Aconitin chuẩn
của dung dịch đối chiếu. Như vậy, trong dịch chiết toàn phần của Ô đầu có Aconitin.
3.3. Chiết xuất phân lập alcaloid từ phụ tử
- Bột phụ tử (2,8kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 600C được ngâm chiết bằng ethanol 96% (6l x 3 lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc qua giấy lọc sau đó đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết ethanol (300,8g). Cắn ethanol được phân tán vào nước, kiềm hóa bằng NH 3 đặc rồi lắc phân đoạn với n-Hexan (3 lần x 750ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-Hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết n-Hexan (130,6g), tiếp tục cô trên bếp cách thủy đến cắn (45,73g).
- Chuẩn bị cột silicagel cỡ hạt 0,04-0,063mm.
- Cao chiết n-Hexan được hòa tan bằng dung môi rửa giải, nhỏ từ từ dịch lên cột tránh làm xáo trộn lớp Silicagel.
- Rửa giảivới hệ dung môi rửa giải là n-Hexan:EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn có kí hiệu từ A đến F.
- Bằng phản ứng hóa học thấy phân đoạn D có phản ứng dương tính rõ với thuốc thử chung của alcaloid, tiến hành quá trình phân lập tiếp phân đoạn này.
- Phân lập tiếp phân đoạn D (3,81g) dùng sắc ký lớp mỏng điều chế, chế hóa nhiều lần bằng hệ dung môi Dicloromethan-Methanol (95:5) thu được chất OD7 (17mg) và OD8 (16mg)
Quy trình chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ ở hình 3.12
Hình 3.12. Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ Phụ tử 3.4. Xác định cấu trúc của alcaloid phân lập đƣợc
3.4.1. Alcaloid OD7
- Thể chất: Bột kết tinh màu trắng
Phụ tử sấy khô (2,8kg), xay thô (5-10mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96% (6l x 3 lần)
Dịch chiết EtOH
Cao chiết EtOH (300,8g)
Cao chiết n-hexan (45,73g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (3 lần x 750ml/lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0,04- 0,063mm. Hệ dung môi là: n-hexan và EtOAc (tỉ lệ EtOAc tăng từ 0-85%) PĐ A (3,19g) PĐE (4,22g) PĐC (1,6g) PĐ B (2,09g) PĐD (3,81g) PĐ F (1,84g) SK điều chế OD7 17mg OD8 16mg
- Nhiệt độ nóng chảy: 379oC
- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển CH2Cl2- MeOH (95:5).
- Phổ IR: (KI, cm-1) 3334 (OH), 2944, 2831 (C-H), 1711 (C=O), 1641 (C-N), 1455 (C-H), 1289 (C-N), 1100 (C-O-C), 719 (C-H benzen thế mono).
- Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z [M+H]+ = 590,1 tương ứng công thức phân tử C31H43NO10. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR(500MHz) và 13C-NMR(125MHz) của chất OD7 Vị trí δH δC 1 4.25 m 82.8 2 2A: 1.60 m 2B: 2.33 m 30.3 3 4.61 m 79.0 4 - 43.4 5 2.42 m 44.5 6 4.20 m 81.6 7 2.60 dd (5.5, 7.0) 45.1 8 - 79.2 9 2.59 brd 41.5 10 2.47 m 41.9 11 - 51.7 12 12A: 1.86 dd (5.0, 16.0) 12B: 2.30 d (1.5) 36.9
13 - 78.0 14 3.58 d (8.5) 80.4 15 5.02 d (5.0) 81.1 16 3.24 d (6.5) 93.2 17 3.32 s 68.0 18 18A: 3.38 brm 18B: 3.50 brm 52.8 19 19A: 3.51 d (8.5) 19B: 3.60 d (4.5) 75.9 N-CH3 2.97 s 55.5 1-O-CH3 3.35 s 58.5 6-O-CH3 3.43 s 59.4 16-O-CH3 3.75 s 62.2 18-O-CH3 70.4 2CH-Phenyl 7.49 t (8.0) 129.3 2CH-Phenyl 8.12 d (8.0) 130.8 1CH-Phenyl 7.63m 134.1 C-Phenyl - 131.2 C=O - 167.5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú : a Đo trong CDCl3 , b500 MHz, c125 MHz Kết quả thực nghiệm cho thấy:
OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorffnên dự kiến chất OD7 thuộc nhóm alcaloid.
Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở v*max 3334 cm-1đặc trưng cho nhóm O-H; đỉnh ở v*max 2944, 2831 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của
liên kết C-H; đỉnh ở v*max 1641, 1455 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N; đỉnh ở
v*max 1100 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-C.
Phổ khối ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 589 phù hợp với công thức phân tử C31H43NO10.
Phổ 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của 31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 5 nhóm methoxy, 6 C trong vòng benzen thế, 3 nhóm methylen, 11nhóm methyl bão hòa, 3 carbon bậc 4 và 2 carbon C-OH. Các nhóm này đặc trưng cho hợp chất có khung cấu trúc C19-diterpenoid alcaloid .
Mặt khác, căn cứ sự có mặt của các nhóm trên, khẳng định chất OD7 có chứa 31 carbon, 43 hydro và 10 oxy ứng với số khối là 575. Phổ khối đã cho biết hợp chất OD7 có khối lượng phân tử M= 589, như vậy phân tử OD7 phải chứa số lẻ nguyên tử nitơ. Ở đây số khối dư là 589-575 = 14, hoàn toàn phù hợp với số khối của nguyên tử nitơ. Từ phân tích nêu trên khẳng định công thức phân tử của chất OD7 là C31H43NO10.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho hợp chất 43 nguyên tử hidro, với các tín hiệu đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH3), 3.32 (s, 1H, H-17), các tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho 5 nhóm methoxy, 7.49 (t, J=8.0 Hz, 2H) 8.12 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.63 (m, 1H) đặc trưng cho nhóm benzoyl. Tín hiệu cộng hưởng được quy kết chính xác nhờ hỗ trợ của phần mềm dự đoán phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC).
Từ các kết quả trên đối chiếu với dữ liệu đã công bố của hợp chất benzoylmesaconitin [36], hợp chất OD7 được xác định là: benzoylmesaconitin. Cấu trúc benzoylmesaconitin được trình bày ở hình 3.13.
N H3C H3CO OCH3 HO H3CO OH H H OCH3 OH OCOC6H5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 OH
Hình 3.13. Cấu trúc của chất hợp OD7: Benzoylmesaconitin 3.4.2. Alcaloid OD8
- Nhiệt độ nóng chảy: 214-216oC
- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triểnCH2Cl2/MeOH: 95/5, Rf=0,52.
- Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z [M+H]+ =454.6 tương ứng với công thức phân tử C24H39NO7, M= 453.5.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất OD8
Vị trí δHa,b (ppm), J ( Hz) δC a,c (ppm) 1 3.14 (6.0) t 49.2 2 2A: 2.0 m 2B: 2.69 m 29.4
3 3A: 1.76 m 3B: 185 m 78.5 4 - 40.5 5 - 43.5 6 - 62.5 7 2.12 (6.0)t 44.0 8 4.40 (7.0) d 79.0 9 3.14 (6.0) t 30.6 10 1.51 m 38.0 11 - 46.6 12 12A: 189 m 29.9 13 - 75.5 14 2.40-2.44 m 80.0 15 4.08 (4.5) t 84.3 16 - 90.5 17 2.17 (6.0) d 59.0 18 18B: 2.68 (10.0) d 48.3 19 19A: 3.66 (5.5) d 19B: 4.12 (6.5) d 72.0 N- CH2–CH3 1.56 (7.0) t 48.4
N – CH2 – CH3 1.11 (7.0) d 13.0
6 – Ome 3.33 s 56.6
16 - O-Me 3.34 s 57.3
19 - O-Me 3.45 s 57.9
Ghi chú : a Đo trong CDCl3 , b500 MHz, c125 MHz
Chất OD8 hiện màu với thuốc thử Dragendorff và so sánh phổ NMR của chất OD8 với OD7 thấy rất giống nhau nên dự kiến chất OD8 thuộc nhóm C19-diterpenoid alcaloid.
Các vị trí có sự khác nhau trong cấu trúc của chất OD7 và OD8 được thấy rõ qua các tín hiệu đặc trưng: Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu ở δ = 13.3 ppm đặc trưng cho N-CH2CH3, tín hiệu ở 48.4 đặc trưng cho N-CH2CH3 như vậy OD8 có nhóm -CH2CH3 gắn vào nguyên tử nitơ, trong khi OD7 tương ứng có tín hiệu đặc trưng cho nhóm N-CH3. Ở OD8 có tín hiệu ở 80.0và 80.1 đặc trưng cho C-OH tại vị trí C-1 và C-14. Trên phổ 1
H-NMR và 13C-NMR của OD8 không thấy có tín hiệu đặc trưng của nhóm benzoyl như ở OD7 mà xuất hiện tín hiệu 1.76, 185 (m, 2H) đặc trưng cho 2 proton tại C-3, tín hiệu 2.33 dd (7.4, 5.1) đặc trưng cho proton tại C-13 mà OD7 không có. Như vậy tại C-3 của chất OD8, 2 nguyên tử hydro chưa bị thế, C-13 còn 1 nguyên tử hydro chưa bị thế như ở OD7.
Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z 454 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 453.
Qua các số liệu đặc trưng trên các phổ, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất fuzilin đã công bố khẳng định hợp chất OD8 là: fuzilin [37]. Cấu trúc Fuzilin được trình bày ở hình 3.14.
N H3CH2C OCH3 OH HO OH OH OCH3 H H 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 4 H3CO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.14: Cấu trúc của Chất OD8: Fuzilin 3.5. Bàn luận
3.5.1. Về tên khoa học của mẫu nghiên cứu
Trong một một số tài liệu, Ô đầu Việt Nam có tên khoa học là
Aconitum fortunei Hemsl, [1],[3]. Kết quả của các nghiên cứu trước đây thì Ô đầu ở Sa Pa, Lào Cai có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx. var.
carmichaelii., [8].Vì vậy, trước khi nghiên cứu thành phần hóa học của Ô đầu ở Hà Giang cần xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
Từ kết quả phân tích đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu, so sánh với các tiêu bản về cây Ô đầu thu thập trước đây đang được lưu tại Viện Dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật có thể khẳng định được Ô đầu trồng tại Hà Giang vẫn là cùng một loài Aconitum carmichaeli Debx.với Ô đầu Sa pa, Lào Cai. Mẫu nghiên cứu cũng được các chuyên gia thực vật kiểm tra và giám định tên khoa học đúng là Aconitum carmichaeli Debx.
3.5.2. Về định tính alcaloid
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy: dịch chiết dược liệu cho phản ứng rất rõ ràng với thuốc thử của alcaloid. Có thể kết luận sơ bộ