- Thể chất: Bột kết tinh màu trắng
Phụ tử sấy khô (2,8kg), xay thô (5-10mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96% (6l x 3 lần)
Dịch chiết EtOH
Cao chiết EtOH (300,8g)
Cao chiết n-hexan (45,73g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (3 lần x 750ml/lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0,04- 0,063mm. Hệ dung môi là: n-hexan và EtOAc (tỉ lệ EtOAc tăng từ 0-85%) PĐ A (3,19g) PĐE (4,22g) PĐC (1,6g) PĐ B (2,09g) PĐD (3,81g) PĐ F (1,84g) SK điều chế OD7 17mg OD8 16mg
- Nhiệt độ nóng chảy: 379oC
- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển CH2Cl2- MeOH (95:5).
- Phổ IR: (KI, cm-1) 3334 (OH), 2944, 2831 (C-H), 1711 (C=O), 1641 (C-N), 1455 (C-H), 1289 (C-N), 1100 (C-O-C), 719 (C-H benzen thế mono).
- Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z [M+H]+ = 590,1 tương ứng công thức phân tử C31H43NO10. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR(500MHz) và 13C-NMR(125MHz) của chất OD7 Vị trí δH δC 1 4.25 m 82.8 2 2A: 1.60 m 2B: 2.33 m 30.3 3 4.61 m 79.0 4 - 43.4 5 2.42 m 44.5 6 4.20 m 81.6 7 2.60 dd (5.5, 7.0) 45.1 8 - 79.2 9 2.59 brd 41.5 10 2.47 m 41.9 11 - 51.7 12 12A: 1.86 dd (5.0, 16.0) 12B: 2.30 d (1.5) 36.9
13 - 78.0 14 3.58 d (8.5) 80.4 15 5.02 d (5.0) 81.1 16 3.24 d (6.5) 93.2 17 3.32 s 68.0 18 18A: 3.38 brm 18B: 3.50 brm 52.8 19 19A: 3.51 d (8.5) 19B: 3.60 d (4.5) 75.9 N-CH3 2.97 s 55.5 1-O-CH3 3.35 s 58.5 6-O-CH3 3.43 s 59.4 16-O-CH3 3.75 s 62.2 18-O-CH3 70.4 2CH-Phenyl 7.49 t (8.0) 129.3 2CH-Phenyl 8.12 d (8.0) 130.8 1CH-Phenyl 7.63m 134.1 C-Phenyl - 131.2 C=O - 167.5
Ghi chú : a Đo trong CDCl3 , b500 MHz, c125 MHz Kết quả thực nghiệm cho thấy:
OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorffnên dự kiến chất OD7 thuộc nhóm alcaloid.
Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở v*max 3334 cm-1đặc trưng cho nhóm O-H; đỉnh ở v*max 2944, 2831 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của
liên kết C-H; đỉnh ở v*max 1641, 1455 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N; đỉnh ở
v*max 1100 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-C.
Phổ khối ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 589 phù hợp với công thức phân tử C31H43NO10.
Phổ 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của 31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 5 nhóm methoxy, 6 C trong vòng benzen thế, 3 nhóm methylen, 11nhóm methyl bão hòa, 3 carbon bậc 4 và 2 carbon C-OH. Các nhóm này đặc trưng cho hợp chất có khung cấu trúc C19-diterpenoid alcaloid .
Mặt khác, căn cứ sự có mặt của các nhóm trên, khẳng định chất OD7 có chứa 31 carbon, 43 hydro và 10 oxy ứng với số khối là 575. Phổ khối đã cho biết hợp chất OD7 có khối lượng phân tử M= 589, như vậy phân tử OD7 phải chứa số lẻ nguyên tử nitơ. Ở đây số khối dư là 589-575 = 14, hoàn toàn phù hợp với số khối của nguyên tử nitơ. Từ phân tích nêu trên khẳng định công thức phân tử của chất OD7 là C31H43NO10.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho hợp chất 43 nguyên tử hidro, với các tín hiệu đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH3), 3.32 (s, 1H, H-17), các tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho 5 nhóm methoxy, 7.49 (t, J=8.0 Hz, 2H) 8.12 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.63 (m, 1H) đặc trưng cho nhóm benzoyl. Tín hiệu cộng hưởng được quy kết chính xác nhờ hỗ trợ của phần mềm dự đoán phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC).
Từ các kết quả trên đối chiếu với dữ liệu đã công bố của hợp chất benzoylmesaconitin [36], hợp chất OD7 được xác định là: benzoylmesaconitin. Cấu trúc benzoylmesaconitin được trình bày ở hình 3.13.
N H3C H3CO OCH3 HO H3CO OH H H OCH3 OH OCOC6H5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19 OH
Hình 3.13. Cấu trúc của chất hợp OD7: Benzoylmesaconitin 3.4.2. Alcaloid OD8
- Nhiệt độ nóng chảy: 214-216oC
- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triểnCH2Cl2/MeOH: 95/5, Rf=0,52.
- Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z [M+H]+ =454.6 tương ứng với công thức phân tử C24H39NO7, M= 453.5.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất OD8
Vị trí δHa,b (ppm), J ( Hz) δC a,c (ppm) 1 3.14 (6.0) t 49.2 2 2A: 2.0 m 2B: 2.69 m 29.4
3 3A: 1.76 m 3B: 185 m 78.5 4 - 40.5 5 - 43.5 6 - 62.5 7 2.12 (6.0)t 44.0 8 4.40 (7.0) d 79.0 9 3.14 (6.0) t 30.6 10 1.51 m 38.0 11 - 46.6 12 12A: 189 m 29.9 13 - 75.5 14 2.40-2.44 m 80.0 15 4.08 (4.5) t 84.3 16 - 90.5 17 2.17 (6.0) d 59.0 18 18B: 2.68 (10.0) d 48.3 19 19A: 3.66 (5.5) d 19B: 4.12 (6.5) d 72.0 N- CH2–CH3 1.56 (7.0) t 48.4
N – CH2 – CH3 1.11 (7.0) d 13.0
6 – Ome 3.33 s 56.6
16 - O-Me 3.34 s 57.3
19 - O-Me 3.45 s 57.9
Ghi chú : a Đo trong CDCl3 , b500 MHz, c125 MHz
Chất OD8 hiện màu với thuốc thử Dragendorff và so sánh phổ NMR của chất OD8 với OD7 thấy rất giống nhau nên dự kiến chất OD8 thuộc nhóm C19-diterpenoid alcaloid.
Các vị trí có sự khác nhau trong cấu trúc của chất OD7 và OD8 được thấy rõ qua các tín hiệu đặc trưng: Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu ở δ = 13.3 ppm đặc trưng cho N-CH2CH3, tín hiệu ở 48.4 đặc trưng cho N-CH2CH3 như vậy OD8 có nhóm -CH2CH3 gắn vào nguyên tử nitơ, trong khi OD7 tương ứng có tín hiệu đặc trưng cho nhóm N-CH3. Ở OD8 có tín hiệu ở 80.0và 80.1 đặc trưng cho C-OH tại vị trí C-1 và C-14. Trên phổ 1
H-NMR và 13C-NMR của OD8 không thấy có tín hiệu đặc trưng của nhóm benzoyl như ở OD7 mà xuất hiện tín hiệu 1.76, 185 (m, 2H) đặc trưng cho 2 proton tại C-3, tín hiệu 2.33 dd (7.4, 5.1) đặc trưng cho proton tại C-13 mà OD7 không có. Như vậy tại C-3 của chất OD8, 2 nguyên tử hydro chưa bị thế, C-13 còn 1 nguyên tử hydro chưa bị thế như ở OD7.
Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z 454 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 453.
Qua các số liệu đặc trưng trên các phổ, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất fuzilin đã công bố khẳng định hợp chất OD8 là: fuzilin [37]. Cấu trúc Fuzilin được trình bày ở hình 3.14.
N H3CH2C OCH3 OH HO OH OH OCH3 H H 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 4 H3CO
Hình 3.14: Cấu trúc của Chất OD8: Fuzilin 3.5. Bàn luận
3.5.1. Về tên khoa học của mẫu nghiên cứu
Trong một một số tài liệu, Ô đầu Việt Nam có tên khoa học là
Aconitum fortunei Hemsl, [1],[3]. Kết quả của các nghiên cứu trước đây thì Ô đầu ở Sa Pa, Lào Cai có tên khoa học là Aconitum carmichaeli Debx. var.
carmichaelii., [8].Vì vậy, trước khi nghiên cứu thành phần hóa học của Ô đầu ở Hà Giang cần xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
Từ kết quả phân tích đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu, so sánh với các tiêu bản về cây Ô đầu thu thập trước đây đang được lưu tại Viện Dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật có thể khẳng định được Ô đầu trồng tại Hà Giang vẫn là cùng một loài Aconitum carmichaeli Debx.với Ô đầu Sa pa, Lào Cai. Mẫu nghiên cứu cũng được các chuyên gia thực vật kiểm tra và giám định tên khoa học đúng là Aconitum carmichaeli Debx.
3.5.2. Về định tính alcaloid
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy: dịch chiết dược liệu cho phản ứng rất rõ ràng với thuốc thử của alcaloid. Có thể kết luận sơ bộ trong Ô đầu Hà Giang cũng có thành phần chủ yếu là alcaloid.
Để khẳng định rõ hơn về thành phần alcaloid trong mẫu nghiên cứu, tiến hành sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần với 3 hệ dung môi khác nhau thấy hệ Cloroform-Methanol (9:1) theo Dược điển Việt Nam IV không tách được vết, hệ dung môi Cloroform-Methanol-Amoniac(50:9:1) cho sắc ký đồ tách rõ và tách rất nhiều vết alcaloid bắt màu với thuốc thử Dragendorff. Tuy nhiên, hệ dung môi này có nhược điểm là chứa NH3 bay hơi mạnh nên gây khó khăn trong quá trình khai triển sắc ký, khi triển khai sắc ký cần bão hòa đủ lâu, bình sắc ký đảm bảo độ kín. Hệ dung môi Cloroform-Aceton-Aacid formic cho sắc ký đồ tách rõ nhiều vết nhưng khoảng cách giữa các vết không rõ bằng hệ Cloroform-Methanol-amoniac (50:9:1), dung môi độc hơn nhưng hệ ổn định hơn ít bị ảnh hưởng trong quá trình khai triển sắc ký.
Các kết quả định tính này phù hợp với tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV, dược điển Trung Quốc về Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) [35], có thể khẳng định trong dịch chiết toàn phần thân rễ cây Ô đầu có alcaloid và có Aconitin.
3.5.3. Về chiết xuất phân lậpmột số Alcaloid từAconitum
carmichaeliDebx. ở Hà giang.
Trên thế giới có khoảng 400 alcaloid được phân lập từ 80 loài thuộc chi
Aconitum L.Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về phân lập alcaloid từ Ô đầu và chưa có nghiên cứu nào về chiết xuất và phân lập alcaloid từ Ô đầu ở Hà giang, đa sốnghiên cứu về phương pháp chế biến, tác dụng dược lý.
Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành chiết xuất alcaloid trong Ô đầu bằng EtOH. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng dung môi cồn chiết xuất được nhiều alcaloid toàn phần, ít độc hại hơn chiết xuất bằng dung môi hữu cơ khác ( MeOH, Cloroform-Ether,...), rẻ tiền, dễ kiếm hơn...
Sử dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký điều chế chúng tôi đã phân lập được 2 alcaloid. Dựa vào tính chất lý hóa, phổ khối (ESI – MS) và phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C-NMR cùng với phổ chuẩn của 2 alcaloid Fuzilin và Benzoylmesaconitin chúng tôi nhận dạng được 2 alcaloid OD7 và OD8 là Benzoylmesaconitin và Fuzilin. Đây là 2 C19-diterpenoid lần đầu tiên được phân lập từ Ô đầu ở nước ta.
Fuzilin đãđược phân lập và nghiên cứu tác dụng từ loài Aconitum carmichaeli Debx ởTrung Quốc, Fuzilin làm giảm tác dụng của Natri pentobarbital trên tế bào cơ tim, làm tăng hoạt động của tế bào cơ tim [30].
Benzoylmesaconitin đã được phân lập từ nhiều loài và nhiều nơi trên thế giới. Chất này có tác dụng chống viêm tốt.
Quá trình phân lập 2 alcaloid rất khó khăn do có nhiều tạp chất và dịch chiết chứa rất nhiều loại alcaloid khác nhau. Lượng 2 chất phân lập được trong cây không nhiều nên trong quá trình phân lập phải làm giàu nhiều lần.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Sau quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau: - Đã xác định được tên khoa học của Ô đầu trồng tại Hà Giang là Aconitum carmichaeli Debx. Họ Hoàng liên (Ranunculaceae).
- Đã tiến hành định tính được alcaloid trong dich chiết toàn phần củ từ thân rễ Ô đầu bằng phương pháp hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng.
- Bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký điều chế đã chiết xuất và phân lập được 2 alcaloid từ thân rễ cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) là Benzoylmesaconitin và Fuzilin. Đây là 2 alcaloid lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc từ Ô đầu ở nước ta.
- Căn cứ vào tính chất vật lý, độ chảy, phổ ESI-MS, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C-NMR nhận dạng OD7 là Benzoylmesaconitin.
- Căn cứ vào độ chảy, phổ ESI-MS, phổ cộng hưởng từ 1H-NMR và 13C- NMRvà so sánh với OD7 nhận dạng OD8 là fuzilin.
Đề nghị
Chúng tôi đề nghị tiếp tục có các đề tài nghiên cứu về Ô đầu trồng tại Hà Giang:
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) -(2013), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, tập II, tr. 140-152.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở
Việt Nam tập II, Nxb. Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.490-495.
3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nxb. Y học, tr.85-858, 860-862. 4. Bộ Y Tế (2009), Dược học cổ truyền, Nxb. Y học, Hà Nội.
5. Bộ Y Tế (2007), dược liệu học tập 2, Nxb. Y học, Hà Nội, tr.163-170. 6. Bộ Y Tế (2007), Thực vật học, Nxb. Y học, Hà Nội, tr.226-238.
7. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội, tr.95-97, 326-327, 385-386, 388-389, 895-896, 1439.
8. Bùi Hồng Cường, Phùng Hòa Bình, Nguyễn Trọng Thông (2006), “Nghiên cứu bào chế, thành phần alcaloid và một số tác dụng sinh học của cao đặc phụ tử Sa Pa”,
tạp chí dược học, (7), 4-7.
9. Bùi Hồng Cường, Phùng Hoà Bình, Nguyễn Trọng Thông (2010), Phụ tử vị thuốc quý và phương pháp chế biến an toàn hiệu quả, Nxb. Khoa học và kỹ thuật.
10. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, quyển I, Nxb.Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, tr.325.
11. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Cảnh, Phùng Hòa Bình, Nguyễn Danh Mậu (1990), “Góp phần nghiên cứu cây Ô đầu Việt Nam”, tạp chí Dược học, tập 4 số
201, tr.10-15.
12. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học Hà Nội, tr.241-242, 512-514, 779 -782.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13. A. E. Goncharov, A. A. Politov, N. A. Pankrushina and O. I. Lomovski (2006), “Isolation of lappaconitine from Aconitum septentrionale roots by adsortion”, Chemistry of Natural Compounds, 42(3), 367-371.
14. A. S. Gromova,O. V. Neretina, I. A. Ushakov, Ts. Zhapova, V. I. Lutskii, A. L. Vereshchagin, A. A. Semenov and V. K. Voronov (2007), “Leucostinine A from
Aconitum barbatum”, Chemistry of Natural Compounds, 43(1), 46-48.
15. Bei-Ni Xing, Si-Si Jin, Hao Wang, Qing-Fa Tang, Jing-Han Liu, Rui-Yang Li, Jing-Yu Liang, Yi-Qun Tang, Chun-Hua Yang (2014), “New diterpenoid alkaloids from Aconitum coreanum and their anti-arrhythmic effects on cardiac sodium
current”, Fitoterapia, 94, 120-126.
16. Bingya Jiang, Sheng Lin, Chenggen Zhu (2012), "Diterpenoid Alkaloids from the Lateral Root of Aconitum carmichaeli", Jounral of Natural Product, 75 (9),
1145−1159.
17. Dao-Ping Wang, Hua-Yong Lou, Lan Huang, Xiao-Jiang Hao, Guang-Yi Liang, Zai-Chang Yang, Wei-Dong Pan (2012), “A novel franchetine type norditerpenoid isolated from the roots of Aconitum carmichaeli Debx. with potential analgesic
activity and less toxicity”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 22(13),
18. Dacheng Hao, Xiaojie Gu, Peigen Xiao, Lijia Xu, Yong Peng (2013), recent advances in the chemical and biological studies of Aconitum pharmaceutical
resources, Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 22 (3), 209–221.
19. Dr. Ainura Chodoeva, Jean-Jacques Bosc, Jacques Robert (2013), “Aconitum Alkaloids and Biological Activities”, Natural Products, 1503-1523.
20. E.G.Zinurova, T.V.Khakimova, L.V.Spirikhin (2001), “A new diterpenoid alkaloid acsonine from the root of aconitum kusnezoffi Reichb”, Russian chemical bulletin, 50(2), 311-312.
21. Eric Yarnell (2007), “Aconitum napellus L (aconite), Ranunculaceae and
related species”, Bastyr University, Department of Botanical Medicine, 1-17.
22. E. V. Burdelnaya, M. A. Zhunusova, A. Zh. Turmukhambetov, R. B. Seidakhmetova, E. E. Shults,Yu. V. Gatilov and S. M. Adekenov (2012), “Alkanoids from roots of Aconitum monticola”, Chemistry of Natural Compounds, 47(6), 421-423.
23. Farzana Shaheena, Manzoor Ahmada, Muhmud Tare Hassan Khana, Saima Jalila, Asma Ejaza, Mukhlis N. Sultankhodjaeva, Muhammad Arfan (2005), “Alkaloids of Aconitum laeve and their anti-inflammatory, antioxidant and tyrosinase inhibition activities”, Phytochemistry, 66(8), 935–940.
24. Feng-Peng Wang, Qiao-Hong Chen (2010), "The C19-Diterpenoid Alkaloids, The Alkaloids”, Chemistry and Biology, 69, 571-577.
25. Gajalakshmi S, Jeyanthi P, Vijayalakshmi S, Devi Rajeswari V (2011), “Phytochemical constituent of Aconitum species – A review”,International journal