- Thiết bị để nghiên cứu về thực vật:
Quan sát phân tích đặc điểm lá, thân, rễ củ, hoa và chụp ảnh
- Thiết bị nghiên cứu thành phần hoá học và xác định cấu trúc các chất: - Máy cất quay BUCHI waterbath B480-Đức.
- Máy siêu âm.
- Bình gạn thủy tinh 250ml.
- Bình nón 250ml, bình cầu 100ml. - Cột sắc ký thủy tinh các loại.
- Đo điểm chảy trên máy Kofler micro-hotstage, Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam.
- Phổ hồng ngoại được đo đưới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 Nicolet tại Viện Hoá Học, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam.
- Phổkhối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học,Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D- NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR của Viện Hoá học,Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Nghiên cứu thực vật
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa.
- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
- Thẩm định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với các khoá phân loại thực vật [1], [2], [6], [7], [10], [29] tham khảo ý kiến chuyên gia về phân loại thực vật .
2.4.2.Nghiên cứu thành phần hoá học 2.4.2.1. Định tính alcaloid
- Định tính alcaloid toàn phần trong dược liệu bằng phản ứng hóa học với thuốc thử chung của alcaloid: Thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff... - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng Silicagel GF254-Merck, hệ dung môi khai triển cloroform-Methanol (9:1), Cloroform-Methanol- Amoniac (50:9:1) và Cloroform-Aceton-Acid formic (5:2:1), hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff.
2.4.2.2 Chiết xuất và phân lập alcaloid
Phương pháp
- Chiết xuất: sử dụng dung môi cồn để chiết xuất các alcaloid, sau đó kiềm hóa bằng NH3 đặc để chuyển các alcaloid sang dạng muối, tiếp tục chiết bằng dung môi n-hexan để làm giàu các alcaloid.
- Phân lập các hợp chất trong Ô đầu, Phụ tử bằng sắc ký cột và SKLM điều chế .
+ Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 4cm, chiều dài 35 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng. + Chất nhồi cột:Silicagel pha thuận (0,040-0,063mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), được ngâm trong dung môi khai triển 8-12 giờ.
+ Dung môi rửa giải: n-Hexan-EtOAc gradient.
+ Nhồi cột: Cho ít bông vào đáy cột, đổ silicagel trong dung môi vào cột, đổ thành dòng từ từ vào cột vừa đổ vừa gõ nhẹ để tránh bọt khí lọt vào cột. Để 30phút cho silicagel lắng xuống dưới ở mức không đổi.Rút bớt dung môi trong cột đến khi bề mặt dung môi cách khoảng 1-2 mm so với mặt lớp silicagel.
+ Đưa cắn lên cột:Hòa tan cắn alcaloid bằng một lượng tối thiểu dung môi rửa giải, nhỏ từ từ dung dịch chất vào trên cột, tránh xáo trộn lớp silicagel trên bề mặt.
+ Rửa giải: Mở khóa cho dung môi nhỏ giọt xuống, để 1 thời gian cho chất hấp phụ lên silicagel, thêm ít dung môi để đảm bảo silicagel luôn ngập trong dung môi.
- Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM:
+ SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60GF254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
+ SKLM điều chế thực hiện trên bản mỏng như SKLM ở trên sau đó cắt phần ngoài bản mỏng, phun thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol và hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó
cạo lớp silica gel có chất, phản hấp phụ và tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp.
2.4.2.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc
+ Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật
Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 0,6- 2m hoặc hơn, phần thân trên mặt đất lụi hàng năm. Rễ củ gồm củ mẹ ở giữa và các củ con mọc xung quanh, có hình con quay, hình nón thuôn, đường kính 1-4cm, dài 3-9cm. Thân khí sinh mọc thẳng ít phân cành, phần thân non và ngọn có lông đơn bào cong.
Lá đơn, mọc so le, phiến lá có dạng gần hình tim tròn hoặc xẻ 3 thùy sâu, hai thùy bên xẻ tiếp thành 5 thùy không đều nhau, mép khía răng cưa to, gân lá hình chân vịt, cuống lá, mặt trên có lông tơ.
Cụm hoa dạng chùm đơn, mọc ở ngọn thân và kẽ lá, dài 10-30 cm gồm nhiều hoa màu xanh tím. Cuống hoa dài 2-6 cm, cuống hoa và cụm hoa có lông tơ dày cong, các lá bắc ở phần dưới cụm hoa chia 3 thùy hình mác, 2 lá bắc con nhỏ dài 4-8mm, rộng 1-2,5mm, 2 mặt có lông tơ. Hoa không đều lưỡng tính, 5 lá đài mặt ngoài có lông tơ ngắn, lá đài trên hình mũ cao, hơi dẹt trùm lên 2 lá đài bên và 2 cánh hoa dài 2-3cm, rộng 1,8-2,5cm. Hai lá đài bên hình trứng dài 1,7-2,2 cm, rộng 1,8-2,6cm. Hai lá đài dưới thuôn dài 1,3-2cm, rộng không đều nhau. Tràng hoa gồm 2 cánh hoa tiêu giảm, nhẵn, dài 1,8- 2,1cm nằm trong lá đài trên, hai bên cuộn vào thành hình trụ. Nhị nhiều (40- 46) không có lông, dài 9-12mm, chỉ nhị rộng có cánh ở dưới, bao phấn 2 ô đính gốc hình cầu hoặc elip nứt dọc. Bầu trên dài 5-12mm, có lông nhỏ rải rác. Lá noãn 5, rời, mỗi lá noãn có nhiều noãn, đính bên. Vòi nhụy ngắn hơn bầu nhụy.
Quả gồm 5 đại hình elip dài 1,5-2,5cm, đường kính 0,5cm, có mỏ ngắn, đài không tồn tại. Trong mỗi đại chứa 10-20 hạt dẹt, dài 4-5mm, rộng 2-3mm, có cánh mỏng.
Hình 3.1. Cành Ô đầu có hoa, quả Hình 3.2. Tiêu bản cây Ô đầu
Hình 3.5. Hoa của Ô đầu Hình 3.6. Các bộ phận hoa Ô đầu
Hình 3.7. Nhụy hoa Hình 3.8. Nhị hoa
3.1.2. Xác định tên khoa học
Sau khi tiến hành quan sát và phân tích các bộ phận của mẫu cây Ô đầu thu hái tại Hà Giang, căn cứ vào khóa phân loại trong cuốn Thực vật chí Trung Quốc (2001) [29], đồng thời đối chiếu với các tài liệu tham khảo như Danh lục các loài thực vật Việt Nam [1], Cây cỏ Việt Nam[10], so sánh với các tiêu bản về cây Ô đầu thu thập trước đây đang được lưu tại Viện Dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, mẫu nghiên cứu đã được chuyên gia về thực vật học xác định tên khoa học là:
Aconitum carmichaeli Debx., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae). (Mẫu giám định chi tiết tên khoa học của mẫu cây Ô đầu được ghi trong phần phụ lục 1)
3.2. Định tính alcaloid trong Ô đầu trồng tại Hà giang
Định tính alcaloid bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị dịch chiết: Cân khoảng 5g bột dược liệucho vào cốc có mỏ 100ml, thêm 40ml MeOH, siêu âm 20 phút trong bể siêu âm, lọc lấy dịch lọc. Dịch lọc được cất quay đến 10ml rồi thêm 5ml dd H2SO4 10% để chiết. Thêm 10ml CHCl3 vào lắc đều chiết lấy lớp nước, làm 3 lần mỗi lần x10ml CHCl3. Tiếp theo cho dd NaOH 5% vào đến khi pH=12, lắc với CHCl3 chiết lấy lớp dung môi hữu cơ, 3 lần x 10ml, gộp dịch chiết lại cất thu hồi dung môi, cắn dùng để làm các phản ứng định tính và SKLM [26].
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học - Cách tiến hành: - Cách tiến hành:
Lấy một ít cắn cho vào ống nghiệm, hòa tan cắn bằng 2-3 ml H2SO4 1N, chia dịch chiết này vào 3 ống nghiệm:
Ống 2: Cho 1-2 giọt thuốc thử Bouchardat. Ống 3: Cho 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff. - Kết quả định tính được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Kết quả định tính alcaloid trong Ô đầu Hà Giang bằng phản ứng hóa học Phản ứng Kết quả Đánh giá TT Mayer +++ Có TT Bouchardat +++ TT Dragendorff +++ Chú thích:
+++ Phản ứng tủa nhiều ++ Phản ứng có tủa +Phản ứng ít tủa
Nhận xét: Qua thực nghiệm sơ bộ xác định được trong dịch chiết Ô đầu có alcaloid.
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
- Dịch chiết toàn phần rễ củ Ô đầu: Hòa tan cắn bằng 1-2 ml EtOH.
- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 20mg Aconitin (latoxan-pháp) trong 10 ml MeOH.
- Bản mỏng Silicagel GF245: Hoạt hóaở 110oC trong 1 giờ.
- Khai triển sắc ký: Tiến hành chấm riêng biệt dịch chiết dược liệu và dịch Aconitin đối chiếu lên bản mỏng, khai triển sắc ký với 3 hệ dung môi sau:
Hệ I: Cloroform-Methanol (9:1), [3]
Hệ II: Cloroform-Methanol-Amoniac(50:9:1) Hệ III: Cloroform-Aceton-Acid formic (5:2:1)
- Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô, quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm. Hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff.
- Sắc ký đồ cho thấy với hệ I các vết dính nhau không tách, cả 2 hệ II và III đều tách vết rõ, số lượng vết nhiều tuy nhiên hệ II không ổn định bằng hệ III do có Amoniac trong hệ bay hơi mạnh ảnh dễ hưởng đến vết sắc ký.
- Kết quả sắc ký lớp mỏng khai triển với hệ dung môi III: Cloroform-Aceton- Acid formic (5:2:1), sau khi hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff được trình bày ở sắc ký đồ (hình 3.11).
UV 366 UV 254 TT Dragendorff Chú thích:
DL: Dịch chiết toàn phần rễ củ Ô đầu ĐC: Dịch Chiết Aconitin đối chiếu
UV 366: Sắc ký đồ chụp ở bước sóng UV 366nm UV 254: Sắc ký đồ chụp ở bước sóng UV 254nm
TT: Sắc ký đồ chụp sau khi hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff.
Hình 3.11. Ảnh chụp sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần từ củ Ô đầu Hà Giang.
Nhận xét: Trên hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết toàn phần rễcủ Ô đầusau khi phun thuốc thử Dragendorff có 10 vết alcaloid tách rõ và trên sắc ký đồ cũng có vết tương ứng cùng màu và cùng giá trị Rf với vết Aconitin chuẩn
của dung dịch đối chiếu. Như vậy, trong dịch chiết toàn phần của Ô đầu có Aconitin.
3.3. Chiết xuất phân lập alcaloid từ phụ tử
- Bột phụ tử (2,8kg) đã xay thô, sấy khô ở nhiệt độ 600C được ngâm chiết bằng ethanol 96% (6l x 3 lần). Dịch chiết tổng được loại cặn bằng cách lọc qua giấy lọc sau đó đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết ethanol (300,8g). Cắn ethanol được phân tán vào nước, kiềm hóa bằng NH 3 đặc rồi lắc phân đoạn với n-Hexan (3 lần x 750ml/lần), gộp dịch chiết phân đoạn n-Hexan và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết n-Hexan (130,6g), tiếp tục cô trên bếp cách thủy đến cắn (45,73g).
- Chuẩn bị cột silicagel cỡ hạt 0,04-0,063mm.
- Cao chiết n-Hexan được hòa tan bằng dung môi rửa giải, nhỏ từ từ dịch lên cột tránh làm xáo trộn lớp Silicagel.
- Rửa giảivới hệ dung môi rửa giải là n-Hexan:EtOAc có độ phân cực tăng dần (100:0, 80:20, 50:50, 35:65, 25:75, 15:85) thu được 6 phân đoạn lớn có kí hiệu từ A đến F.
- Bằng phản ứng hóa học thấy phân đoạn D có phản ứng dương tính rõ với thuốc thử chung của alcaloid, tiến hành quá trình phân lập tiếp phân đoạn này.
- Phân lập tiếp phân đoạn D (3,81g) dùng sắc ký lớp mỏng điều chế, chế hóa nhiều lần bằng hệ dung môi Dicloromethan-Methanol (95:5) thu được chất OD7 (17mg) và OD8 (16mg)
Quy trình chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ ở hình 3.12
Hình 3.12. Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ Phụ tử 3.4. Xác định cấu trúc của alcaloid phân lập đƣợc
3.4.1. Alcaloid OD7
- Thể chất: Bột kết tinh màu trắng
Phụ tử sấy khô (2,8kg), xay thô (5-10mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96% (6l x 3 lần)
Dịch chiết EtOH
Cao chiết EtOH (300,8g)
Cao chiết n-hexan (45,73g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (3 lần x 750ml/lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0,04- 0,063mm. Hệ dung môi là: n-hexan và EtOAc (tỉ lệ EtOAc tăng từ 0-85%) PĐ A (3,19g) PĐE (4,22g) PĐC (1,6g) PĐ B (2,09g) PĐD (3,81g) PĐ F (1,84g) SK điều chế OD7 17mg OD8 16mg
- Nhiệt độ nóng chảy: 379oC
- Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển CH2Cl2- MeOH (95:5).
- Phổ IR: (KI, cm-1) 3334 (OH), 2944, 2831 (C-H), 1711 (C=O), 1641 (C-N), 1455 (C-H), 1289 (C-N), 1100 (C-O-C), 719 (C-H benzen thế mono).
- Phổ ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z [M+H]+ = 590,1 tương ứng công thức phân tử C31H43NO10. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR(500MHz) và 13C-NMR(125MHz) của chất OD7 Vị trí δH δC 1 4.25 m 82.8 2 2A: 1.60 m 2B: 2.33 m 30.3 3 4.61 m 79.0 4 - 43.4 5 2.42 m 44.5 6 4.20 m 81.6 7 2.60 dd (5.5, 7.0) 45.1 8 - 79.2 9 2.59 brd 41.5 10 2.47 m 41.9 11 - 51.7 12 12A: 1.86 dd (5.0, 16.0) 12B: 2.30 d (1.5) 36.9
13 - 78.0 14 3.58 d (8.5) 80.4 15 5.02 d (5.0) 81.1 16 3.24 d (6.5) 93.2 17 3.32 s 68.0 18 18A: 3.38 brm 18B: 3.50 brm 52.8 19 19A: 3.51 d (8.5) 19B: 3.60 d (4.5) 75.9 N-CH3 2.97 s 55.5 1-O-CH3 3.35 s 58.5 6-O-CH3 3.43 s 59.4 16-O-CH3 3.75 s 62.2 18-O-CH3 70.4 2CH-Phenyl 7.49 t (8.0) 129.3 2CH-Phenyl 8.12 d (8.0) 130.8 1CH-Phenyl 7.63m 134.1 C-Phenyl - 131.2 C=O - 167.5
Ghi chú : a Đo trong CDCl3 , b500 MHz, c125 MHz Kết quả thực nghiệm cho thấy:
OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorffnên dự kiến chất OD7 thuộc nhóm alcaloid.
Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở v*max 3334 cm-1đặc trưng cho nhóm O-H; đỉnh ở v*max 2944, 2831 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của
liên kết C-H; đỉnh ở v*max 1641, 1455 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-N; đỉnh ở
v*max 1100 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-C.
Phổ khối ESI-MS của hợp chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H]+ tương ứng với khối lượng phân tử M= 589 phù hợp với công thức phân tử C31H43NO10.
Phổ 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của 31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 5 nhóm methoxy, 6 C trong vòng benzen thế, 3 nhóm methylen, 11nhóm methyl bão hòa, 3 carbon bậc 4 và 2 carbon C-OH. Các nhóm này đặc trưng cho hợp chất có khung cấu trúc C19-diterpenoid alcaloid .
Mặt khác, căn cứ sự có mặt của các nhóm trên, khẳng định chất OD7 có chứa 31 carbon, 43 hydro và 10 oxy ứng với số khối là 575. Phổ khối đã cho biết hợp chất OD7 có khối lượng phân tử M= 589, như vậy phân tử OD7 phải chứa số lẻ nguyên tử nitơ. Ở đây số khối dư là 589-575 = 14, hoàn toàn phù hợp với số khối của nguyên tử nitơ. Từ phân tích nêu trên khẳng định công thức phân tử của chất OD7 là C31H43NO10.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho hợp chất 43 nguyên tử hidro, với các tín hiệu đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH3), 3.32 (s, 1H, H-17), các tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho 5 nhóm methoxy, 7.49 (t, J=8.0 Hz, 2H) 8.12 (t, J = 8.0