NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI

Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi” được thực hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đạt các tiêu chí: quy trình thao tác đơn giản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID

SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT

ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN !

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm

ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, người đã trực tiếp hướng

dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Đình Luyện và toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp

Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành luận văn đúng thời

hạn

Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học

Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt

những tháng năm học tập tại trường

Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn

tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời

gian qua

Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 08 năm 2013

Học viên:

Phùng Thị Mỹ Hạnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ .1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây hồi 3

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 4

1.1.4 Thành phần hóa học và công dụng 5

1.1.5 Tinh dầu hồi 6

1.2 Tổng quan về acid shikimic 7

1.2.1 Công thức hóa học và tính chất 7

1.2.2 Kỹ thuật phân tích 8

1.2.3 Nguồn gốc acid shikimic 8

1.2.4 Vai trò acid shikimic 9

1.2.5 Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi 10

1.3 Nhận xét 11

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Lựa chọn phương pháp chiết xuất 15

2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước 16

2 3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp định lượng acid shikimic 16

2.3.2 Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu 18

2.3.3 Phương pháp tinh chế acid shikimic 19

2.3.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 19

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi 21

3.2 Khảo sát giai đoạn chiết xuất 22

3.2.1 Chiết xuất theo phương pháp A 22

3.2.2 Chiết xuất theo phương pháp B .25

3.2.3 Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất 29

3.3 Tinh chế acid shikimic 33

3.3.1 Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế 34

3.3.2 Bước đầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa acid shikimic bằng isopropanol 41

3.4 Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic và kiểm tra chất lượng sản phẩm 42

3.4.1 Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic 42

3.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 44

3.5 Mở rộng quy mô 48

3.5.1 Mô tả quy trình 48

3.5.2 Kết quả 50

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 51

4.1 Về giai đoạn chiết xuất 51

4.2 Về giai đoạn tinh chế 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AC : aceton

AS : acid shikimic

DD : dung dịch

DL : dược liệu EtOH : ethanol IPA : isopropanol MeOH : methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook f.)…… … 3 Bảng 3.1 Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A…… 24 Bảng 3.2 Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B….27 Bảng 3.3 Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B………….28 Bảng 3.4 Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp……….30 Bảng 3.5 Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp……… 31 Bảng 3.6 Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS

trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất……… 32

Bảng 3.7 Kết quả quá trình tinh chế

sử dụng các dung môi tinh chế khác nhau……… 37

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát liên quan tới hàm ẩm của

cao trong nước đem tinh chế……… 42

Bảng 3.9 Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại………… 45 Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ

cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) ……… 46

Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) …….47 Bảng 3.12 Các thông số của quá trình chiết tách và phân lập

acid shikimic với cỡ mẻ 2kg……….….48

Bảng 3.13 Kết quả chiết xuất acid shikimic với cỡ mẻ 2kg đại hồi….….….50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu dược liệu ……… … …21

Hình 3.2 Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn……… ………… …21

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A……… ……….… …23

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu theo PP B……… ……… ………….…………26

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn nồng độ acid shikimic theo thời gian của PP B 27

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp 29

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp……… 30

Hình 3.8 Sơ đồ quy trình tinh chế acid shikimic sử dụng các loại dung môi……… 35

Hình 3.9 Hình ảnh sản phẩm thô và sản phẩm tinh chế…… ……… 38

Hình 3.10 Sơ đồ tinh chế acid shikimic……… …… 43

Hình 3.11 Sản phẩm acid shikimic……… ……… …… 50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây hồi (còn gọi là cây đại hồi, hồi hương, …), tên khoa học Illicium

verum Hook f là một loài cây phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và khu vực

Đông Bắc Việt Nam Quả chín phơi khô của cây hồi (đại hồi) được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực Trung Hoa, là hương liệu trong sản xuất rượu mùi và nướng bánh ở các nước phương Tây, là một gia vị trong món phở của Việt Nam,… Trong Đông y, dược liệu này chủ trị đau bụng, nôn mửa, đau nhức cơ-khớp do lạnh [4], [5] Đại hồi còn được biết đến là nguồn nguyên liệu sản xuất acid shikimic, thành phần quan trọng trong bán tổng hợp sản xuất thuốc chống virus điều trị cúm gia cầm type A và type B oseltamivir phosphat (tên thương mại là Tamiflu) [7], [14] Tamiflu đang được coi là dược phẩm có triển vọng nhất để làm giảm tác hại của bệnh cúm gia cầm – loại bệnh vẫn đang là mối lo ngại và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát thành đại dịch cúm đối với con người

Ở Việt Nam và trên thế giới, nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic

từ đại hồi bằng dung môi ethanol, methanol, nước… cho hiệu suất khá cao nhưng thao tác thực hiện phức tạp, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ qua vấn đề khai thác tinh dầu [6], [8], [10], [12], [22], [24], [25] Giá trị của đại hồi bị giảm đáng kể vì được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua acid shikimic Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu

mà chưa tận thu được hoạt chất này Trong khi đó, acid shikimic do Việt Nam sản xuất lại có giá thành cao hơn acid shikimic do Ấn Độ sản xuất – quốc gia phải nhập đại hồi Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn acid shikimic từ các phương pháp tổng hợp hóa học hay lên men vi sinh,… tuy nhiên hiệu suất không cao và giá cả không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ dược liệu [8], [15], [16]

Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi” được thực

hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đạt các tiêu chí: quy trình thao tác đơn giản, an toàn, chi phí thấp và kết hợp thu tinh dầu; từ đó có thể triển khai áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam ở quy mô lớn hơn Mục tiêu nghiên cứu đặt ra gồm có:

1 Khảo sát và lựa chọn được phương pháp chiết xuất acid shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước

2 Xây dựng được phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây hồi

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium

verum Hook f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới

đây [1], [9]

Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook f.)

Giới Thực vật - Plantae

Không phân hạng Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae

Bộ Mộc lan dây - Austrobaileyales

Họ Hồi - Illiciaceae

Chi Hồi - Illicium

Loài I verum

Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông

Nam Á, Đông Á và Bắc Mỹ Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [8] Cây hồi

(Illicium verum Hook f.) là một loại cây xanh quanh năm, phần lớn ở Trung

Quốc và Đông Bắc Việt Nam Nó còn có tên gọi khác là cây đại hồi, bát giác hồi hương, hồi hương, hồi sao, mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),… [2]

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 2-3 cái ở kẽ lá; đài 5 răng, dễ rụng, mép viền hồng, cánh hoa 5-6, đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ nhị rộng, mập, trung đới dày [1], [2]

Quả thường cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau, có khi 9-12 đại (nhưng hiếm), các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa, khi non màu lục sau chuyển sang màu nâu sẫm, phần đính vào cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn, ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên; hạt hình trứng nhẵn bóng, màu nâu Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm [1], [2]

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến

1.1.3.1 Bộ phận dùng

Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây hồi - Illicium verum Hook f (họ Hồi – Illiciaceae)

Mô tả: Quả phức, thường gồm 8 đại, đôi khi nhiều đại hơn, màu nâu đỏ

đến nâu sẫm, xếp thành hình sao xung quanh một trụ trung tâm Mỗi đại hình lòng thuyền dài 1-2cm, rộng 0,5cm, cao 0,7-1cm Bờ trên gần như thẳng, nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt Bờ dưới hơi tròn và sần sùi Hai mặt bên nhăn nheo, tận cùng bởi 1 chỏm tù, ở 1 góc có khoảng nhẵn hơn (nơi đính giữa các đại) Mặt trong màu vàng nhạt hơn và nhẵn bóng Cuống quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả Hạt hình trái xoan, màu vàng nâu, nhẵn bóng Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt [5]

1.1.3.2 Thu hái và chế biến

Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý) Vụ muộn cho năng suất thấp hơn Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất tương đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [2]

Vào vụ thu hoạch, hái lấy quả từ màu lục biến thành vàng, nhúng qua nước sôi, sấy nhẹ hoặc phơi trong bóng râm khoảng 5-6 ngày cho khô [5]

Trên thị trường, sản phẩm quả hồi khô được chia thành 3 loại:

- Loại 1 (hồi đại hồng): quả đủ 8 cánh to, đồng đều, không bị lép, màu

đỏ nâu, cuống ngắn (3-5 mm), không mốc Đây là loại có phẩm cấp tốt nhất

- Loại 2 (hồi xô): quả có cánh không đều, màu cánh gián, một số cánh

- Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [2], [8]

- Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen, sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa trong hạt [4], [8]

Quả hồi và tinh dầu hồi được dùng làm gia vị và hương liệu cho rất nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm từ thịt [4]

1.1.5 Tinh dầu hồi

Tên thương phẩm: Star Anis Essential Oil, Anise Star,…

trans-1.1.5.3 Công dụng

Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự dược liệu, thường được phối hợp trong nhiều thuốc khác Ngoài ra tinh dầu còn dùng để tổng hợp các hormon oestrogen (diethyl stilbestrol, diethyl stilbestrol propionat) Tinh dầu hồi được dùng làm gia vị và hương liệu cho rất nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm của thịt Hàm lượng tinh dầu tối đa được phép đưa vào thực phẩm là 0,07% Ngoài ra tinh dầu còn được dùng trong kỹ nghệ sản xuất xà phòng, kem đánh răng, thuốc lá…[4]

1.1.5.4 Chiết xuất tinh dầu từ đại hồi

Có thể cất tinh dầu khi quả còn tươi hay đã phơi khô Đồng bào các dân tộc ở Lạng Sơn thường cất tinh dầu hồi bằng các nồi cất thủ công, đơn giản,

tương tự như cất rượu Thời gian cất có thể kéo dài từ 18-24 giờ Để có hiệu suất và chất lượng tinh dầu cao, cần sử dụng các thiết bị chưng cất liên tục bằng hơi nước có hồi lưu với nồi hơi riêng Bã còn lại sau khi cất tinh dầu có thể dùng làm nhiên liệu để đun hoặc ủ trộn với phân súc vật để bón cho cây trồng

1.2 Tổng quan về acid shikimic

1.2.1 Công thức hóa học và tính chất

Acid shikimic có công thức hoá học và các tính chất cụ thể như sau [21], [26]:

Công thức cấu tạo:

Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước

(18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa

Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở

213 nm

1.2.2 Kỹ thuật phân tích

Denis V Bochkov và cs đã trình bày các kỹ thuật phân tích acid shikimic trong bài tổng quan về hợp chất này [17] Các kỹ thuật được nêu ra gồm có:

- Sắc ký giấy

- Phản ứng màu

- Kỹ thuật phân tích định lượng

- Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo

- Một số kỹ thuật phân tích khác

1.2.3 Nguồn gốc acid shikimic

Acid shikimic được Eykman F và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào

năm 1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum) Đến 50 năm sau cấu

trúc hóa học của acid shikimic mới được xác định [23] Acid shikimic có

trong nhiều loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko

biloba), quyển bá trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae),

kha tử (Terminalia chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương (Heliantus annus), tiểu hồi (Foeniculum vulgare)… [27] Nhưng hiện nay đại

hồi vẫn là nguyên liệu quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic trong quả hồi tương đối cao (5%-10%) [8]

Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien-1,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Alder Grewe (1964) và cộng

sự tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [15]

Giáo sư Frost, trường đại học Michigan, đã nghiên cứu công nghệ sản xuất acid shikimic bằng con đường lên men vi sinh sử dụng chủng

Escherichia coli tái tổ hợp, sau đó chiết xuất acid shikimic từ dịch lên men và

tinh chế Tuy nhiên hiệu suất không cao và giá thành không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ đại hồi [16]

1.2.4 Vai trò acid shikimic

 Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan, tyrosin; các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [28] Nó là chất trung gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa trong thực vật và

vi sinh vật (con đường shikimat) [22], [23]

 Về tác dụng dược lý, acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau,

có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch do tác động của acid arachidonic [24] Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, kìm hãm phát triển tế bào ung thư[2]

 Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, acid shikimic được biết đến là nguyên liệu tổng hợp (-)zeylenon, hoạt chất có hoạt tính kháng sinh, có tác dụng chống virus, chống ung thư và được sử dụng cho bệnh nhân ung thư trước khi tiến hành hóa trị liệu [18]

Đặc biệt trong những năm gần đây acid shikimic là nguyên liệu để bán tổng hợp oseltamivir phosphat – một chất có vai trò ức chế neuraminidase, một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ các tế bào bị nhiễm Oseltamivir phosphat có tác dụng trên virus cúm type A và type B, đặc biệt với chủng H5N1 Theo tổng hợp của Nguyễn Quyết Chiến [7]: Kim và cộng sự (1997) đã tìm ra con đường tổng hợp oseltamivir phosphat từ acid shikimic nhưng mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm; Sau đó Rohloff và cộng

sự đã xây dựng được phương pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở quy mô pilot, hiệu suất tổng thể của quá trình là 21% với 10 công đoạn phản ứng và vẫn qua công đoạn tạo azid, mặc dù được phép áp dụng trong sản xuất nhưng nó luôn tiềm ẩn những nguy cơ do các tác nhân và các hợp chất azid

trung gian có độc tính cao và có khả năng gây nổ Năm 2004, Harrington và cộng sự đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp oseltamivir phosphat và tránh được công đoạn tạo azid Phương pháp này được các tác giả gọi là “phương pháp thế hệ thứ 2”, hiệu suất tổng của phương pháp đạt 61% và được xem là phương pháp tối ưu nhất hiện nay[14]

1.2.5 Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi

Khi đại dịch cúm gia cầm xảy ra, hãng Roche và thế giới lo lắng vì không đủ acid shikimic để sản xuất Nhiều nhóm nghiên cứu đã cố gắng tìm

ra acid shikimic với các phương pháp và nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

Payne R và Edmonds M (2005) tiến hành chiết acid shikimic từ đại hồi bằng thiết bị Soxhlet với dung môi ethanol 95% Dịch chiết được cất loại ethanol Hòa tan cắn vào nước nóng, gạn bỏ lớp dầu Dung dịch được loại bớt tạp bằng formaldehyd và lọc Acid shikimic được tinh chế bằng phương pháp trao đổi ion (dùng nhựa Amberlit IRA-400) và kết tinh lại trong ethyl actetat-methanol Hiệu suất đạt 2,4-7,0 % [24] Nguyễn Quyết Chiến (2006) cũng tiến hành và tinh chế acid shikimic từ đại hồi theo phương pháp tương tự Hiệu suất quá trình đạt 5,4% Nhược điểm của phương pháp này là tinh chế bằng nhựa trao đổi ion phức tạp và chi phí cao [6]

Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2006) chiết Soxhlet bằng cồn 950, chiết bằng nước ở 60oC và chiết hồi lưu trong cồn 900 và 950, quy mô phòng thí nghiệm (50 và 100g quả hồi khô), loại tạp với formaldehyd, tinh chế trên cột anionit chứa 50g Amberlit và thu được acid shikimic với hiệu suất từ 5,0-6,8 % [12] Phương pháp này có cùng nhược điểm nêu trên

Iyer Sankar V (2007) công bố phương pháp chiết tách acid shikimic gồm các bước [25]:

- Chiết hồi lưu nguyên liệu đại hồi (400g) với 2x2L isopropanol 95%

- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được dịch chiết đậm đặc

- Dung dịch đậm đặc được pha loãng với 900mL nước

- Tiến hành loại tạp dung dịch nước lần lượt bằng ethyl acetat (1200mL), dung dịch formaldehyd 37% và than hoạt (60g)

- Cô đặc dung dịch nước Thêm 50mL methanol và cô đến cắn

- Hòa cắn vào 40mL methanol, đun hồi lưu 45 phút, để lạnh (0-50C) cho acid shikimic kết tinh Hiệu suất quá trình 3,5-5%

Phương pháp của Iyer Sankar V có ưu điểm là bước tinh chế không sử dụng nhựa trao đổi ion Nhưng quá trình tinh chế qua nhiều công đoạn và khá phức tạp, tốn ethyl acetat và than hoạt; sử dụng formaldehyd 37% là dung môi độc hại để loại tạp và hiệu suất thấp

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Hiroki Ohira (2009) - Trường Đại học Tohoku, Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn (Research Center of Supereritical Fluid Tecnhnology) đã nghiên cứu chiết xuất nhanh acid shikimic bằng nước nóng ở nhiệt độ 120oC trong 5 phút với 0,5g hồi có hiệu suất 8% [22] Hiệu suất chiết cao, thời gian chiết nhanh nhưng kỹ thuật khá phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại

Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2010) đã chiết xuất được acid shikimic từ lá và quả đại hồi thu hoạch ở các tỉnh khác nhau ở Việt Nam bằng dung môi nước và methanol, tinh chế bằng hỗn hợp ethyl acetat-methanol (3:1) cho hiệu suất 0,985-1,33% trong lá và 4,47% trong quả [8]

Đỗ Thị Loan (2011) chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước theo phương pháp chiết nóng với nước ở 1000C, tinh chế bằng hỗn hợp dung môi methanol-aceton cho hiệu suất cả quá trình đạt 6,61% [10]

1.3 Nhận xét

Cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào ở nước ta và các nước khác trên thế giới Chủ động nguồn nguyên liệu acid

shikimic để bán tổng hợp oseltamivir (hoạt chất có tác đụng chống cúm gia cầm hiệu quả hiện nay) có ý nghĩa hết sức to lớn Chiết xuất acid shikimic từ đại hồi là phương pháp hiệu quả nhất tính đến thời điểm hiện tại để thu được hoạt chất này Giá trị kinh tế của đại hồi bị giảm đáng kể, do được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua hoạt chất acid shikimic Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu mà chưa tận thu được acid shikimic Các phương pháp chiết xuất hoạt chất này đã được công bố trước đây thường phức tạp, khá tốn kém, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ qua vấn đề khai thác tinh dầu Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi sử dụng dung môi chiết xuất là nước và kết hợp chưng cất tinh dầu nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi có thể áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Nguồn gốc

Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn

Mô tả nguyên liệu

Quả phức, thường gồm 8 đại, màu nâu đỏ, xếp thành hình sao xung quanh một trụ trung tâm Mỗi đại hình lòng thuyền dài 1-2cm, cao dưới 1cm

Bờ trên gần như thẳng, nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt Bờ dưới hơi tròn và sần sùi, hai mặt bên nhăn nheo, mặt trong màu vàng nhạt hơn

và nhẵn bóng Cuống quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả Hạt hình trái xoan, màu vàng nâu, nhẵn bóng Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt Đặc điểm nguyên liệu phù hợp với mô tả trong Dược điển Việt Nam IV [5]

TT Tên hóa chất Tiêu chuẩn, nguồn gốc

1 Ethanol 96% Việt Nam

3 Methanol P, Trung Quốc

6 H2SO4 P, Trung Quốc

7 Isopropanol P, Trung Quốc

8 NaCl công nghiệp Việt Nam

9 Acid shikimic chuẩn 99,0%, Merck

 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức)

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ)

 Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

 Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức)

 Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc)

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gồm: bộ phân loại khí DGU – 14A, bơm cao áp LC – 10ADVP, buồng chứa cột CTO – 10AVP, bộ điều khiển SCL – 10AVP, detector dãy diod quang SPD – M10AVP và phần mềm Class vp 6.14

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt (Mỹ)

 Phân cực kế KRÜSS (Đức)

 Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer

 Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

 Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 Ms (Mỹ)

Dụng cụ

 Hệ thống cất tinh dầu: Bình cầu 2L, sinh hàn, bếp ôm bình cầu có bảo

ôn, bình chứa tinh dầu

 Sinh hàn hồi lưu

 Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Lựa chọn phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước (phương pháp A) và phương pháp ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau (phương pháp B) được khảo sát Nội dung này nhằm đánh giá tốc độ chiết hoạt chất, hiệu quả chiết xuất acid shikimic, tính chọn lọc và lượng tinh dầu thu được Từ đó có dữ liệu để

so sánh và lựa chọn phương pháp ưu việt hơn

2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước

- Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế Các dung môi nghiên cứu gồm có: methanol, hỗn hợp methanol-isopropanol, hỗn hợp methanol-aceton, isopropanol

- Bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế sử dụng dung môi đã lựa chọn

- Đề xuất quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi Quy trình này được áp dụng với cỡ mẻ lớn hơn nhằm nâng cao tính thực tiễn của đề tài và sơ

bộ đánh giá hiệu quả của quy trình khi mở rộng quy mô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng acid shikimic

Xác định hàm lượng acid shikimic trong dược liệu, trong dịch chiết và sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 25mg acid shikimic chuẩn vào bình

định mức 50mL, thêm nước cất, lắc hòa tan hoàn toàn Thêm nước vừa đủ đến vạch Hút chính xác 5mL, cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch,

lắc đều Lọc qua màng 0,45µm Dung dịch chuẩn có nồng độ 100µg/mL

- Mẫu thử là dược liệu: Cân chính xác 250mg bột dược liệu, gói vào

giấy lọc, cho vào bình nón 100mL, thêm 50ml nước, ngâm trong 1 giờ cho trương nở hoàn toàn Siêu âm trong 30 phút Gạn lấy dịch chiết, bã tiến hành chiết lần 2, lần 3, mỗi lần 20mL nước, tiến hành như lần 1 Gộp dịch chiết cho vào bình định mức 100mL, thêm nước đến vạch, lắc đều Hút chính xác 10mL cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch, lắc đều Lọc qua màng 0,45µm

- Mẫu thử là dịch chiết: Pha loãng dịch chiết đến nồng độ acid shikimic

trong khoảng 50 – 150µg/mL, lọc qua màng 0,45µm

2.3.1.3 Công thức tính

 Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi:

  1 100%

C

.S C

.f C

.V T m

T

.S T

.f T

.a.V C

m

Trong đó:

X%: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi

mC: Khối lượng acid shikimic chuẩn

m : Khối lượng đại hồi đem chiết

SC: Diện tích peak mẫu chuẩn

ST: Diện tích peak mẫu thử

fC, fT: Hệ số pha loãng của mẫu chuẩn và mẫu thử

VC, VT: Thể tích của dung dịch chuẩn và dung dịch thử

a: hàm lượng acid shikimic trong mẫu chuẩn

 Hiệu suất chiết xuất:

Trong đó:

HC%: hiệu suất chiết xuất

HLA/dc: hàm lượng acid shikimic trong dịch chiết

HLA/dl: hàm lượng acid shikimic trong dược liệu

 Hiệu suất cả quá trình:

Trong đó: H%: hiệu suất cả quá trình

mSP: khối lượng sản phẩm

mT: khối lượng acid shikimic có trong dược liệu đem chiết

2.3.2 Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu

 Phương pháp A: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo

hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic

 Phương pháp B: Chiết acid shikimic bằng phương pháp ngâm lạnh có

khuấy trộn, bã dược liệu được cất lấy tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước

 Sử dụng phương pháp cất kéo hơi nước để thu tinh dầu hồi Muối ăn được sử dụng để tách tinh dầu từ dịch cất nước Tiến hành để phân lớp trong

  2 100%

m

m

% H

T

SP





bình gạn Khi dịch cất tách lớp hoàn toàn, gạn bỏ lớp nước bên dưới thu được tinh dầu

2.3.3 Phương pháp tinh chế acid shikimic

Các giai đoạn tinh chế gồm có:

- Dịch chiết nước được để lắng, lọc qua giấy lọc để loại tạp cơ học Dịch lọc được cô đến cao đặc

- Loại bớt tạp chất và giảm hàm ẩm trong cao tinh chế bằng ethanol 96%

- Sử dụng các loại dung môi sau: methanol, hỗn hợp methanol - isopropanol, hỗn hợp methanol - aceton và isopropanol để kết tủa hoạt chất thu sản phẩm thô

- Sử dụng than hoạt và kết tinh lại trong isopropanol thu sản phẩm

2.3.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm

Sản phẩm của quy trình được kiểm tra chất lượng theo các phương pháp sau:

- Đo nhiệt độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy trên máy máy đo nhiệt độ nóng chảy Ez-Melt (Mỹ) tại Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo năng suất quay cực: Tiến hành trên phân cực kế KRÜSS (Đức) với c = 4,03% trong nước tại Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Đo phổ hồng ngoại (IR): Mẫu được nghiền với KBr và phổ hồng ngoại (IR) của sản phẩm được xác định trên máy Perkin Elmer đo trong vùng bước sóng 4000-400 cm-1 tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Đo phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng của sản phẩm được xác định bằng máy Varian 320 Ms (Mỹ), nguồn ion hoá ESI tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO) của sản phẩm được xác định trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi

Xác định hàm lượng acid shikimic bằng phương pháp HPLC như chỉ dẫn ở mục 2.3.1 Hàm lượng acid shikimic có trong đại hồi xác định được là 10,8% ± 0,1% Sắc ký đồ của mẫu dược liệu và acid shikimic chuẩn được

Hình 3.1 Sắc ký đồ của mẫu dược liệu

Hình 3.2 Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn

Nhận xét: Hàm lượng acid shikimic trong dược liệu khá cao (10,8% ±

0,1%) Trên sắc ký đồ cho thấy ngoài peak của acid shikimic trong đại hồi hầu như không có peak của chất nào khác

3.2 Khảo sát giai đoạn chiết xuất

3.2.1 Chiết xuất theo phương pháp A

Phương pháp A là phương pháp gắn liền với thực tiễn chưng cất tinh dầu đại hồi Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, chúng tôi thực hiện khảo sát phương pháp A với các nội dung nghiên cứu gồm có: tốc độ chiết acid shikimic, hiệu quả cất tinh dầu đại hồi, hiệu suất chiết acid shikimic và tính chọn lọc

3.2.1.1 Khảo sát tốc độ chiết

Tiến hành: Cân 100g bột dược liệu cho vào bình cầu thể tích 2L có 2 cổ

có nút mài Một cổ lắp hệ thống cất thu hồi dung môi, một cổ có nút đậy để lấy mẫu định kỳ Thêm 700mL nước Đun sôi trong 5 giờ Lấy mẫu sau khi sôi, sau mỗi giờ lấy mẫu 1 lần

Các mẫu được pha loãng như sau: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1

Kết quả được thể hiện trong hình 3.3

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A

Nhận xét: Dựa trên đồ thị thấy, thời gian đạt đến cân bằng của phương

pháp A là khoảng 3giờ

3.2.1.2 Cất tinh dầu đại hồi

Tiến hành: Cho 100g nguyên liệu vào bình cầu 2L Cho thêm 1,5L

nước Lắp hệ thống cất kéo hơi nước Cất cho đến khi hết tinh dầu Dịch cất được cho thêm 50g muối NaCl, hòa tan muối rồi chuyển sang bình gạn 500mL Để dịch cất tách lớp hoàn toàn Gạn bỏ lớp nước bên dưới thu được

tinh dầu Thể tích tinh dầu được đong bằng ống đong thể tích 10mL

Kết quả: Thu được 9,5mL tinh dầu

Nhận xét: Thực nghiệm cho thấy: thời gian để cất hết tinh dầu là 5 giờ

Thể tích tinh dầu thu được khá cao 9,5% (9,5mL/100g dược liệu) Phương pháp cất kéo hơi nước tiến hành khá đơn giản

Hỗn hợp sau khi cất tinh dầu được đem xử lý chiết acid shikimic

3.2.1.3 Chiết xuất acid shikimic

Tiến hành: Hỗn hợp sau khi cất tinh dầu được lọc thu lấy dịch chiết Bã

còn lại được tiếp tục chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 700mL, thời gian đun sôi với mỗi lần là 1 giờ Lọc lấy dịch chiết Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC Tiến hành như sau:

Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi đem định lượng bằng phương pháp HPLC Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A

Lần chiết Thể tích

(mL)

Nồng độ (%)

Hiệu suất chiết (%)

Lần 1 700 ± 26 1,12 ± 0,07 72,5 Lần 2 680 ± 13 0,29 ± 0,01 18,2 Lần 3 640 ± 5 0,13 ± 0,01 7,7

Tổng hiệu suất chiết = 98,4%

Nhận xét: Hiệu suất chiết acid shikimic trong dịch chiết lần 1 là 72,5 %,

lần 2 là 18,2%, lần 3 là 7,7% Hiệu suất chiết acid shikimic sau 3 lần chiết là 98,4%

Kết quả cho thấy phương pháp chiết acid shikimic sau khi cất tinh dầu

có thể thu được gần như hoàn toàn lượng acid shikimic trong dược liệu với 3 lần chiết Như vậy trong quá trình cất tinh dầu acid shikimic hầu như không bị phân hủy

3.2.1.4 Khảo sát tính chọn lọc

Tiến hành: Dịch chiết của 3 lần chiết theo mục 3.2.1.3 được gộp lại

Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL Thêm nước vừa

đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều Xác định nồng độ acid shikimic bằng phương pháp HPLC Sau đó cô đến cắn, cân lượng cắn thu được

Hàm lượng acid shikimic trong cắn (S) được tính theo công thức:

3.2.2 Chiết xuất theo phương pháp B

Phương pháp ngâm lạnh có khuấy trộn tiến hành chiết acid shikimic trước, cất tinh dầu sau Quá trình được tóm tắt trong hình 3.4

Khảo sát phương pháp B về tốc độ chiết, hiệu suất chiết acid shikimic,

tính chọn lọc và thể tích tinh dầu thu được sau khi đã chiết acid shikimic Tiến

hành so sánh với phương pháp A, từ đó lựa chọn phương pháp chiết xuất acid

shikimic cho hiệu suất cao

3.2.2.1 Khảo sát tốc độ chiết

Khảo sát thời điểm cân bằng của phương pháp B trong dịch chiết lần 1

để so sánh tốc độ chiết với phương pháp A Phương pháp nào nhanh đạt đến

thời điểm cân bằng tức là có tốc độ chiết nhanh hơn

Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L

Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn Thêm 670 mL

nước Đậy kín Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng Khảo sát trong 22

giờ, lấy mẫu sau mỗi giờ Mẫu được xử lý trước khi đem định lượng bằng

Bột dược liệu (100g)

Nước (700ml) Khuấy liên tục 14 giờ

H2O (700ml)

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu theo PP B

 Mẫu lấy từ 1 giờ đến 5 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

 Mẫu lấy từ 6 giờ đến 22 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1

Kết quả: Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.5

Bảng 3.2 Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B

3.2.2.2 Xác định hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết cho biết sau mỗi lần chiết, lượng acid shikimic trong dược liệu đã được chiết kiệt hay chưa Tiến hành xác định hiệu suất chiết của phương pháp B để so sánh với phương pháp A, từ đó đánh giá hiệu quả của phương pháp

Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L

Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn Thêm 670 mL nước Đậy kín Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng Khuấy liên tục trong

14 giờ Lọc lấy dịch chiết lần 1 Tiến hành chiết thêm 2 lần như trên, mỗi lần 700mL nước, khuấy liên tục trong 14 giờ Lọc thu được dịch chiết lần 2 và 3 Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC:

Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100ml Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều

Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1 Hiệu suất chiết được tính theo công thức 2 mục 2.3.1.3 Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B

Lần chiết

Thể tích (ml)

Nồng độ (%)

Hiệu suất chiết (%)

Lần 1 630 ± 9 1,23 ± 0,06 71,5 Lần 2 620 ± 13 0,30 ± 0,02 17,2 Lần 3 610 ± 10 0,09 ± 0,01 5,0

Tổng hiệu suất chiết = 93,7%