Nghiên cứu định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng HPLC

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI HÀ THỊ MAI TRANG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG ĐẠI HỒI BẰNG HPLC (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược s ĩ KHOÁ 2002-2007) Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Đình Luyện Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 3 - 5/2007 HÀ NỘI, THÁNG 5, 2007 £Ờã®cÀMƠQl ^ĩvưâe tiề n lở i rỉtìễt h àụ tú lòềtíị Uíiih ti'íịiiịf ÚỈL h ièí đ u ềứiẨ ẳiíe ĩtên : ®s, ^ìỉiịuụỉtr (Dìtih JIuịậỉ*l Qtụưèl (tã tản tình hưổitíị dẫn OỈL ạiứfL ĩtẵ tỏi tvGnụ. âiiiít ÍỊUÚ trình (kíiừ hiẽễt u t iú ú í tí í/ít ttùíẬ . &ỒÌ dùếL chân thàễih tủíH 0*1 £7/tc£. QtạuụẪễi (ĩỳàii / 7ôăiLf anh (J)haii &ỉêii £7fatinh eùểtụ eá e t k ẵ ụ eê tu i cáết h ê k ụ t h u ủ t OẨẻit h ê ễMÔii Q m iụ , Qflụhi$jfL nOưọe ĩt ũ ễ ih ìê t tìếih ụ ì ú p ít ổ tu i ta ú m ú i đ iề u Uiêễt t h i iã n l ú i eht) t ê ỉ h ú à ễ i t liù ỉt h U h ú /i Luâễt n a ụ . Q ỉài ìễt eủ tn ổ n e á e th ầ ụ ừê ụ ỉâ ú tvúễtụ ỈVUỔÌUẬ itũ e h i d ẫ n ờ/tí) t à i ivtìễtíị 3ít (ít th ú i ụlíiễt hjạa fậ p tạ i tvƯỔễiíỊ^. ũ í i ế i e ầ t u ị t ò i tXÙn eitỉễt ú’ễt h a u hè O íi ạ iu đ ìn h đ ã q u a n t ã tu ỉtộ n í} o Jê iif ( ỊỈú p ĩtở t ồ i tv ũ n ạ ẫ uôt t k đ i ụ ia t t q u a . 'Tỗă Qlội, ttíịùí^ 8 ikátUẶ 5 ễtủễn 2 0 0 7 Ẵitth oiên '7ÔĨL £7/f/ &VIUIII MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ Ể ......................................................................................... 1 PHẦN I: TỔNG QUAN......................................................................... 3 1.1. Đại h ồ i............................................................................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân b ố ................................................................... 3 1.1.2. Thành pỉĩần hoá h ọ c...................................................................3 1.1.3. Công dụng, tác dụng.................................................................. 4 1.2. Vài nét về acid shikỉmỉc...................................................................5 1.2.1. Nguồn g ốc...................................................................................5 1.2.2. Tính chất.....................................................................................5 1.2.3. Công dụng...................................................................................5 1.3. Một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại h ồ i................8 1.3.1. Chiết bằng thiết bị chiết Sohxlet với dung môi cồn 9 6 °............... 8 1.3.2. Chiết bằng phương pháp ngâm nóng ở 60 ‘U với dung.................8 môi nước 1.3.3. Chiết bằng cách hồi lưu trong cồn 9 5 °........................................8 1.3.4. Chiết bằng siêu â m ......................................................................9 1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)........................... 9 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp......................................................9 1.4.2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC..................................... 10 1.4.3. Một số thôngsố đặc trưng của HPLC.......................................... 12 1.4.4. Các phương pháp định lượngbằng HPLC....................................15 PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q UẢ.............................................19 2.1. Nguyên vật ỉiệu và phương pháp thực nghiệm................................. 19 2.1.1. Nguyên vật liệu và hoá chất......................................................... 19 2.1.2. Máy móc,thiết b ị ........................................................................... 19 2.1.3. Phương pháp thực nghiệm............................................................ 20 2.1.4. Phương pháp xử lý kết quả phân tích............................................ 21 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận x é t..................................................... 22 2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic bằng................. 22 HPLC 2.2.2. Khảo sát phương pháp và thời gian để chiết ìdệt acid...................29 shikimic trong đại hồi 2.2.3. Áp dụng phương pháp để định lượng dịch chiết đại h ồ i................ 32 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT.................................................... 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỂ Đại hồi từ lâu đã được biết đến và sử dụng để điều trị bệnh trong cả đông y và tây y. Hồi còn là một thành phần của ngũ vị hương - một loại gia vị truyền thống trong văn hoá ẩm thực Trung Hoa, Việt Nam và một số nước Đông Nam Á như Indonesia, Malaysia. Hồi thường chỉ trồng để lấy tinh dầu với giá tiị kinh tế không cao. Vài năm trở lại đây, cây hồi được biết đến với một vai trò hoàn toàn khác sau khi hãng dược phẩm Hoffmann La Roche của Thuỵ Sỹ mua bản quyền sản xuất và cung ứng thuốc Tamiílu của tập đoàn Gilead, Caliomia (Mỹ). Hiện nay, TamiAu là thuốc duy nhất có tác dụng điều trị và ngăn chặn bệnh cúm gia cầm do virus H5N1 và hoạt chất chính của thuốc là Oseltamivir được tổng hợp từ acid shikimic trong cây hồi. Ngoài đại hồi, acid shikimic còn có trong một số cây khác như: cây bạch quả (Gingko bilobà), quả sau sau (chi Liquidambar), bạch đàn (chi Eucalyptus)... Acid shikimic cũng có thể được sinh tổng hợp nhờ E.coli hay tổng hợp hoá học với các nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền hơn. Tuy nhiên, những phương pháp này hiện chưa được đưa vào sản xuất công nghiệp, do đó hồi vẫn là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Tamiílu, cung cấp cho Roche 2/3 lượng acid shikimic mỗi năm. Ở Việt Nam, đã có một vài cơ sở chiết xuất và tinh chế được acid shikimic trong đại hồi như phòng Tổng hợp hoá dược của bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, viện Dược liệu, viện Hoá học (Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam). TS. Nguyễn Quyết Chiến của viện Hoá học và các cộng sự cũng đã tổng hợp thành công Oseltamivir phosphate vào tháng 3/2006, mở ra khả năng tự sản xuất Tamiílu trong nước. Mặt khác nguồn hồi nguyên liệu của Việt Nam lại rất dồi dào, hoàn toàn có thể đáp ứng nhu cầu cho sản xuất thuốc 1 phòng chống cúm gia cầm trong nước và có thể xuất khẩu. Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có tài liệu nào công bố chính thức hàm lượng acid shikimic trong đại hồi, chỉ ước chừng từ 5-7% dựa theo các kết quả chiết xuất đã được công bố. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng acid shỉkỉmic trong đại hồi bằng HPLC” Với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng acid shỉkỉnức bằng HPLC. - ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng acỉd shikimic trong đại hồi Việt Nam bằng HPLC. 2 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại hồi - nguồn gốc, thành phần hoá học, tác dụng, công dụng: 1.1.1. Nguồn gốc, phân bố: Đại hồi còn gọi là bát giác hồi hương hay đại hồi hương là quả chín phơi khô của cây hồi (Ilỉicium verum Hook.f., Illiciaceae). Đại hồi chỉ mọc ở bốn tỉnh của Trung Quốc là Quảng Đông, Quảng Tây, Phúc Kiến, Vân Nam và hai tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn của Việt Nam. Các tỉnh như Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Thái Nguyên có trồng nhưng sản lượng không đáng kể. Hồi thu hái vào 2 vụ tháng 7-8 (hồi mùa) và 11-12 (hồi chiêm). Hồi mùa có hàm lượng và chất lượng tinh dầu tốt hơn hồi chiêm. Ngoài hai vụ chính, còn có một vụ quả lép rụng sớm vào tháng 3. Trên thị trường người ta chia hồi thành ba loại: Loại 1: có 8 cánh to đều nhau, màu nâu đỏ (hồi đại hồng). Loại 2: có 1-2 cánh bị lép, màu nâu đen. Loại 3: có 3 cánh trở lên bị lép, màu nâu đen. Hồi xô gồm lẫn lộn cả ba loại trên [3,7,9]. 1.1.2. Thành phần hoá học: Trong quả hồi, ngoài các chất như chất nhầy, đường, chủ yếu chứa tinh dầu từ 3-3,5% (tươi) hoặc 8-9% hay hơn (khô) và acid shikimic. Tinh dầu hổi có mùi đặc biệt, vị ngọt, kết tinh khi để lạnh với thành phần chính là trans-anethol (8590%), còn lại là terpen, a-pinen, A3-caren, dipenten, limonen, saírol, terpineola 3 v.v... Lá hồi cũng chứa tinh dầu với thành phần gần tương tự, hàm lượng từ 0,561,73% (80-90% trans-anethol) [3,4,7]. 33 CH3 Anethol 1.1.3. Công dụng, tác dụng [3,4,7]: Hồi là một vị thuốc được dùng trong cả đông y và tây y. Tây y dùng hồi làm thuốc trung tiện, giúp tiêu hoá, lợi sữa. Nó có tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ (dịu đau, giảm co bóp) được dùng trong đau dạ dày, đau ruột và co thắt dạ dày-raột. Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học đang nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của đại hồi sau khi có một vài trường hợp điều trị thành công ung thư phổi [23]. Theo Đông y, hồi có vị cay, tính ôn, quy kinh can, tỳ, thận, vị. Có tác dụng ôn trung khứ hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa nôn mửa, đau bụng, bụng đầy chướng, giải độc của thịt cá. Mỗi ngày dùng 4-8g dưới dạng thuốc sắc. Những người âm hư hoả vượng không được dùng. Hồi ngâm rượu dùng ngoài để xoa bóp chữa đau nhức, tê thấp. Ngoài ra, hồi còn được dùng làm gia vị, chế húng lìu, nấu thịt bò và các thịt khác. Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự quả. Tinh dầu là hương liệu dùng trong thực phẩm và chế rượu mùi. Anethol dùng để tổng hợp hormon. 4 Cần đặc biệt lưu ý phân biệt đại hồi với cây hồi Nhật Bản Illicium anisatum Lour. và cây hồi núi Illicium grỉjfưhiỉ vì chúng trông tương tự như đại hồi nhưng quả của chúng có độc tính cao [3,9]. 1.2. Vài nét về acid Shikimic: 1.2.1. Nguồn gốc: Acid shikimic là một acid alcol mạch vòng, thường được biết đến nhiều hơn ở dạng anion shikimat, lần đầu tiên được J.F. Eykman chiết xuất từ Illicium religlosium, một giống hồi Nhật Bản, vào năm 1885. Tên gọi của nó xuất phát từ từ Shikimi-no-ki trong tiếng Nhật, có nghĩa là cây hồi [9,20]. 1.2.1. Tính chất [18]: Acid Shikimic có tên khoa học: acỉd (3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxy-lcyclohexen-1 -carboxylic (QHịoOs), trọng lượng phân tử 174,15. Nó có công thức cấu tạo như sau: COOH OH Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước (18%), tan trong methanol, ethanol tuyệt đối (2,25%), không tan trong ethylacetat, aceton, chloroíorm, benzen, ether dầu hoả. Nhiệt độ nóng chảy của acid này là 183-184,5°c. Năng suất quay cực [a]18= -183,8° (C=4,03/ H20). 5 Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213nm. 1.2.2. Công dụng: Acid shikimic có trong nhiều loại cây và cũng là một chất hoá-sinh học trung gian quan trọng trong thực vật và vi sinh vật. Nó là nguyên liệu cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp acid amin thơm như phenylalanin, tyrosin và tryptophan, hay các chất có nhân thơm trong cây (ílavonoid, coumarin), indol và các dẫn chất, một số alkaloid, tannin, lignin, acid p-aminobenzoic thông qua con đường shikimat. Con đường này cùng với con đường quinic là hai cách chính tổng hợp các hợp chất thơm trong cây. Con đường shikimat đi từ glucose để tạo ra các hợp chất thơm đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu kĩ và có thể tóm lược theo sơ đồ sau [13,16]: D-glucose — »Erythrose-4-phosphate -» 3-desoxy-arabino heptulosonate-7phosphate —>• 3-dehydroquinate [...]... chiral Ytrium [8] Các nghiên cứu về acid shikimic vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm đảm bảo có đủ acid shikimic để sản xuất Oseltamivir, đáp ứng nhu cầu thuốc phòng chống cúm gia cầm trong trường hợp có đại dịch xảy ra 1.3 Một số phương pháp chiết xuất acid shỉkimic từ đại hồi: Muốn định lượng được hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu nói chung và định lượng acid shikimic trong đại hồi nói riêng, vấn... |nm - Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống đong, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm 2.1.3 Phương pháp thực nghiệm: *** Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic trong quả hồi: - Hiện chưa có tài liệu nào công bố phương pháp định lượng acid shikimic trong đại hồi, do đó chúng tôi căn cứ vào phương pháp định lượng acid shikimic trong rượu vang bằng HPLC của Federico Castellucci... ký theo các điều kiện đã nêu Hàm lượng phần trăm acid shikimic trong đại hồi được tính theo công thức: in a v.f s x% = -c T T T X100% m T Vc fc s c Trong đó: x%: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi mc: khối lượng acid shikimic chuẩn mT: khối lượng đại hồi đem chiết sc, Sp diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu thử a: hàm lượng acid shikimic chuẩn v c, VT: thể tích của dung dịch chuẩn và thử: v c=100,00ml;... được với nồng độ acid shikimic trong khoảng khảo sát cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng acid shikimic trong dịch chiết đại hồi 2.2.2 Khảo sát phương pháp và thời gian để chiết kiệt acid shikừmc trong đại hồi: 2.22.1 Khảo sát phương pháp chiết bằng siêu âm: Cân chính xác khoảng 25,Og quả hồi khô cho vào cốc có mỏ, thêm lOOml cồn 96° cho ngập dược liệu, lắc siêu âm trong 40 phút Gạn... khi chiết bằng thiết bị Soxhlet trong 13 giờ sẽ chiết kiệt được hoạt chất phân tích trong đại hồi Mặt khác, acid shikimic là một chất bền với nhiệt, nên nhiệt độ chiết cách thuỷ và thời gian chiết trên không ảnh hưởng đến hoạt chất Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết Soxhlet với dung môi cồn 96° trong thời gian 13 giờ để tiến hành khảo sát định lượng hàm lượng acid shikimic trong đại hồi 22.23... tiến hành nghiên cứu trên 3 mẫu hồi được phân loại dựa theo hình dáng quả để so sánh hàm lượng acid trong các loại khác nhau Đó là: • Mẫu 1: hồi có 7-8 đại đều nhau, mỗi đại mang một hạt • Mẫu 2: có 1-3 đại bị lép, màu đen Mỗi đại có một hạt • Mẫu 3: có nhiều hơn 3 đại bị lép, màu đen Các mẫu đều được sấy khô, xay nhỏ, chiết, xử lý và tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện - Hoá chất: • Acid shikimic. .. lý để đinh lượng - Chiết bằng bộ chiết Soxhlet Cân chính xác một lượng dược liệu, gói trong túi giấy lọc, cho vào thiết bị và chiết với dung môi cồn 96° trong 13 giờ (đến khi dịch chiết hết màu) Dịch chiết thu được đem xử lý và chạy sắc ký ♦> Định lượng dịch chiết đại hồi: Dịch chiết đại hồi được xử lý và chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn, từ đó xác định hàm lượng acid shikimic 2.1.4 Phương pháp... lượng acid shikimic thu được là quá thấp sau thời gian chiết trên Như vậy, phương pháp siêu âm không thể chiết kiệt được acid shikimic trong đại hồi với thời gian chiết 4x40 phút 2.22.2 Khảo sát phương pháp chiết bằng thiết bị Soxhlet: Cân chính xác khoảng 25,Og hồi khô, gói trong túi giấy lọc và cho vào thiết bị Soxlet, chiết với 130ml dung dịch cồn 96° Dịch chiết được xử lý và chuẩn bị mẫu định lượng. .. dựng phương pháp định lượng acid shỉkỉnức bằng HPLC: 2.2.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký: Chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng căn cứ vào tài liệu đinh lượng acid shikimic trong rượu vang của Federico Castelluci vói điều kiện sắc ký như sau: Hệ thống cột phân tích gồm có một cột C18 (dài 200-250mm, đường kính trong 4-4,6mm) cặp đôi với một cột trao đổi cation (dài 300mm, đường kính trong 4-7,8mm,... kín để tránh bay hơi dung môi, bảo quản trong tủ lạnh Sau 3 ngày lấy mẫu định lượng lần hai như trên Đồng thời chuẩn bị một mẫu chuẩn theo mục (2.2.1.2) Một tuần sau lần định lượng đầu, tiến hành lấy mẫu và chuẩn bị mẫu chuẩn để định lượng lần 3 Sau hai tuần, định lượng lần 4 Kết quả của 4 lần định lượng được trình bày trong bảng 6: Bảng 6: Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu Lần Chuẩn Thử Sp^CmAU) C(mgA) ... dng phng phỏp nh lng acid shikimic qu hi: - Hin cha cú ti liu no cụng b phng phỏp nh lng acid shikimic i hi, ú chỳng tụi cn c vo phng phỏp nh lng acid shikimic ru vang bng HPLC ca Federico Castellucci... iu kin ó nờu Hm lng phn trm acid shikimic i hi c tớnh theo cụng thc: in a v.f s x% = -c T T T X100% m T Vc fc s c Trong ú: x%: hm lng acid shikimic i hi mc: lng acid shikimic chun mT: lng i hi... hm lng acid shikimic t 5,80% - Loi 2: cú 1-3 i lộp, mi i cũn li u mang ht, hm lng acid shikimic l 4,90% - Loi 3: hi xụ, cú nhiu hn i lộp, mu en, hm lng acid t 3,69% Nh vy, hm lng acid shikimic