2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng acid shỉkỉnức bằng HPLC:
2.2.1.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký:
Chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng căn cứ vào tài liệu đinh lượng acid shikimic trong rượu vang của Federico Castelluci vói điều kiện sắc ký như sau:
Hệ thống cột phân tích gồm có một cột C18 (dài 200-250mm, đường kính trong 4-4,6mm) cặp đôi với một cột trao đổi cation (dài 300mm, đường kính trong 4-7,8mm, pha tĩnh là sulfonat sterene-divinylbenzen)
Pha động: dung dịch acid sulíuric 0,0IM Bước sóng phát hiện: 210nm.
Tốc độ dòng: 0,4ml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 5ịlx1
Nhiệt độ cột trao đổi cation: 65°c.
Tuy nhiên, do pH của pha động là quá thấp (pH=l,7) sẽ làm hỏng cột C18 hiện có nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát để nâng pH lên. Kết quả cho thấy nếu pH pha động lên tới 4 thì peak sẽ có vai (Hình 2), không đạt yêu cầu, còn khoảng pH từ 2,2 - 2,7 cho peak nhọn, cân đối. Chúng tôi quyết định chọn pH của pha động là 2,7 để có thể đảm bảo tuổi thọ cho cột phân tích.
Hơn nữa, dịch chiết đại hồi sau khi xử lý không còn tạp có khả năng ảnh hưởng đến quá trình sắc ký và acid shikimic cũng có thể tách khỏi các chất khác rất dễ dàng nên việc sử dụng hệ thống hai cột như trên là không cần thiết, đồng thời còn kéo dài thời gian phân tích. Do vậy chúng tôi chỉ dùng một cột C18. Kết quả thu được hoàn toàn thoả mãn yêu cầu phân tích (Hình 3).
Mriies
Hình 2: sắc ký đồ của mẫu chuẩn tại pH=4
—EDV210nm 15Ũ Sikữĩicadd Q d at 125 10Q rrA u 75 3D 25 0 t M , TT I ■ , T| ■ , r i Ị. .1 1 | , IT I I I r n | . m I M 1 * J 'r~r~r T I T~TT' T f~TT T 1 j"T T ĩ |~Ỵ T"T T r Ị T ĩ I T J r I I T I 1 I 11 I ■ I . . ! I I . , I ■ I I"T I 1 T T T I I 1 n I n M I n ! I p , II r , I 1- p - TT 1- p . ■ T"p r T 1 T~J I I I T Ị M r 1 • 0.0 0.2 Q4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 20 22 2 4 26 28 ao M nies
Hình 3: sắc ký đồ mẫu chuẩn tại pH=2,7
C
3
C
Từ các khảo sát trên, chúng tôi định lượng acid shikimic trong đại hồi theo các điều kiện sắc ký sau:
Cột: Supelco C18.
Pha động: dung dịch acid sulfuric pH = 2,7, đã được lọc. Bước sóng phát hiện: 21Qnm.
Tốc độ dòng: lml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 20^1.
Nhiệt độ lò cột: 50°c.
2.2.1.2. Cách tiến hành: Pha mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 20,00mg acid shikimic chuẩn vào cốc có mỏ, hoà tan bằng pha động và chuyển dần vào bình định mức 100,00ml. Thêm pha động cho đủ thể tích, được dung dịch có nồng độ khoảng 200,00mg/l. Lấy chính xác 5,00ml dung dịch này vào bình định mức 10,00ml, thêm pha động cho đủ thể tích. Hút chính xác 5,00ml dung dịch trên vào bình định mức 10,00ml, bổ sung pha động đến vạch, ta thu được dung dịch chuẩn (50,00mg/0-
Pha mẫu thử:
- Xử lý dịch chiết: dịch chiết đại hồi được đem lọc và cất quay đến dạng siro, rồi thêm khoảng 200ml nước cất, đun đến 80°c để loại tinh dầu. Tinh dầu sẽ tạo thành một lớp váng đen ở trên bề mặt dung dịch. Cho vào bình gạn, gạn bỏ lớp váng đen đó. Đun sôi dịch gạn khoảng 5 phút. Để lạnh, lọc loại bỏ tủa.
- Cho dịch lọc vào bình định mức 200,00ml, thêm nước cho đủ thể tích.
Lấy chính xác l,00ml dịch chiết vào bình định mức 25,00ml, thêm pha động cho đủ thể tích. Lấy chính xác 2,00ml dung dịch này vào bình định mức 10,00ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Ta được dung dịch thử.
Dung dịch chuẩn và thử được lọc qua màng lọc milipore 0,45|0,m rồi đem chạy sắc ký theo các điều kiện đã nêu.
Hàm lượng phần trăm acid shikimic trong đại hồi được tính theo công thức:
in . a . v. f .s
x% = -c T T T X100%
m .V .f .s
T c c c
Trong đó:
x%: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi. mc: khối lượng acid shikimic chuẩn.
mT: khối lượng đại hồi đem chiết.
sc, Sp diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu thử.
a: hàm lượng acid shikimic chuẩn.
v c, VT: thể tích của dung dịch chuẩn và thử: v c=100,00ml; V7=200,00ml.
fc, fT: hệ số pha loãng của dung dịch chuẩn và thử: fc=4; ff=125.
2.2.1.3. Các kết quả khảo sát phương pháp định lượng acid shikimic:
♦> Xác định khoảng tuyến tính của phép đo:
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn của acid shikimic trong pha động với các nồng độ: 12,5; 25; 50; 100 (mg/1). Tiến hành pha như mục (2.2.1.2) và tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Mỗi mẫu chạy sắc ký hai lần rồi lấy giá tri trung bình.
Bảng 1: Sự phụ thuộc giữa diện tích peak thu được và nồng độ dung dịch TT Nồng độ (mg/1) Diện tích peak (mAU) 1 12,5 ý 394338 2 25,0 786207 3 50,0 1557831 4 100,0 3079069
Hình 4: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak thu được vào nồng độ dung dịch
Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích peak thu được và nồng độ dung dịch: y = 3065lx + 17595.
Hệ số tương quan R2=l.
Như vậy, hệ số tương quan của đường hồi qui bằng 1. Tất cả các giá trị đo đều nằm trên đường hồi qui.
Phép đo là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 12,5 đến 100mg/l.
❖ Khảo sát độ lặp lại của phương pháp:
Tiến hành định lượng dịch chiết đại hồi với 5 phép thử song song. Dịch chiết được xử lý và chuẩn bị như mục (2.2.1.2).
Khối lượng mẫu chuẩn là 20,10mg, lượng hồi đem chiết để định lượng là 25,05g.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
TT Diện tích peak (mAU) . Nồng độ (mg/1) % 1 1820934 57,47 116,70 2 1827779 57,69 117,14 3 1824182 57,57 116,89 4 1816790 57,34 116,43 5 1818842 57,41 116,57 Chuẩn 1560424 49,25 100,00 Giá trị trung bình: X = 116,746% Độ lệch chuẩn: s = 0,2779
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% =0,238% < 2% Vậy phương pháp chính xác và có độ lặp lại cao.
Khảo sát độ đúng của phương pháp dựa vào phương pháp thêm. Nguyên tắc của phương pháp là thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào mẫu đã được xác định nồng độ sao cho lượng hoạt chất thêm vào và lượng chất có sẵn trong mẫu thử vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp.
Cách pha dung dịch để tiến hành khảo sát độ đúng:
Dung dịch thử là dịch chiết đại hồi đã được xác định nồng độ khi khảo sát tính chính xác của phương pháp.
Lấy chính xác 2,00ml dung dịch chuẩn vào bình định mức 10,00ml. Thêm dung dịch mẫu thử cho đủ thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45|im và tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.
Bảng 3: Xác định tính đúng của phương pháp TT Lượng thêm (mg) Lượng tìm lại mg % 1 0,0985 0,0965 97,97 2 0,0985 0,1014 102,94 3 0,0985 0,1012 102,74 4 0,0985 0,1001 101,62 5 0,0985 0,0991 100,61 Giá trị trung bình: x = 101,176% Độ lệch chuẩn: s = 2,022
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = 1,998%
Kết quả trên cho thấy tỉ lệ thu hồi của acid shikimic nằm trong khoảng 97,98-102,20%. Vậy phương pháp cho kết quả đúng.
Kết luận: Với tính đúng, tính chính xác cao và với sự tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích peak thu được với nồng độ acid shikimic trong khoảng khảo sát cho thấy phương pháp này có thể áp dụng để định lượng acid shikimic trong dịch chiết đại hồi.
2.2.2. Khảo sát phương pháp và thời gian để chiết kiệt acid shikừmc trong đại hồi:
2.22.1. Khảo sát phương pháp chiết bằng siêu âm:
Cân chính xác khoảng 25,Og quả hồi khô cho vào cốc có mỏ, thêm lOOml cồn 96° cho ngập dược liệu, lắc siêu âm trong 40 phút. Gạn lấy dịch chiết, bã được chiết tiếp 4 lần như trên. Gộp chung các dịch chiết thu được , lọc bằng giấy lọc và đem cất quay loại cồn đến dạng siro. Thêm khoảng 200ml nước cất, đun đến 80°c, loại bỏ váng tinh dầu trên bề mặt dung dịch bằng bình gạn. Dịch gạn được đun sôi, để lạnh và lọc loại bỏ kết tủa.
Dịch lọc được cho vào bình định mức 200,00ml, thêm nước cất cho đủ thể tích. Lắc đều, lấy chính xác l,00ml dung dịch này cho vào bình định mức 25,00ml, thêm dung dịch acid sulĩuric pH=2,7 đến vạch. Lắc đều. Lấy chính xác 2,00ml dung dịch pha loãng 5 lần trong bình định mức 10,00ml bằng dung dịch acid trên, ta thu được dung dịch thử.
Chuẩn bị mẫu chuẩn để so sánh theo mục (2.2.1.2).
Mẫu chuẩn và mẫu thử được lọc qua màng 0,45 |j,m và đem sắc ký theo các điều kiện khảo sát ở mục (2.2.1.1). Mỗi mẫu đều được sắc ký hai lần và lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Diện tích peak của mẫu chiết bằng siêu âm
Mẫu Diện tích peak (mAƯ)
Chuẩn 1561452
Kết quả trên cho thấy lượng acid shikimic thu được là quá thấp sau thời gian chiết trên. Như vậy, phương pháp siêu âm không thể chiết kiệt được acid shikimic trong đại hồi với thời gian chiết 4x40 phút.
2.22.2. Khảo sát phương pháp chiết bằng thiết bị Soxhlet:
Cân chính xác khoảng 25,Og hồi khô, gói trong túi giấy lọc và cho vào thiết bị Soxlet, chiết với 130ml dung dịch cồn 96°. Dịch chiết được xử lý và chuẩn bị mẫu định lượng như khi chiết bằng siêu âm và đem sắc ký.
Tiến hành chiết 6 mẫu với thời gian lần lượt là 9, 10, 11, 12, 13, 14 giờ và đem định lượng để xác định thời gian chiết kiệt acid shikimic.
Chuẩn bị một mẫu chuẩn để so sánh. Mỗi mẫu chạy sắc ký hai lần lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày như bảng 5 và đồ thị hình 5.
Bảng 5: Khảo sát thời gian chiết xuất với thiết bị Soxhlet
Mẫu Khối lượng cân
(g)
Thòi gian chiết (h) Diện tích peak (mAU) Chuẩn 0,0203 1557831 Thử 1 25,13 9 1672715 Thử 2 25,13 10 1709111 Thử 3 25,13 11 1747706 Thử 4 25,13 12 1782381 Thử 5 25,13 13 1823075 Thử 6 25,13 14 1820568
Hình 5: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào thời gian chiết
Qua bảng 5 và hình 5 ta thấy rằng khi chiết bằng thiết bị Soxhlet trong 13 giờ sẽ chiết kiệt được hoạt chất phân tích trong đại hồi. Mặt khác, acid shikimic là một chất bền với nhiệt, nên nhiệt độ chiết cách thuỷ và thời gian chiết trên không ảnh hưởng đến hoạt chất.
Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp chiết Soxhlet với dung môi cồn 96° trong thời gian 13 giờ để tiến hành khảo sát định lượng hàm lượng acid shikimic trong đại hồi.
22.23. Khảo sát độ Ổn định của mẫu thử:
Do thời gian chiết lâu (13 giờ), lại cần nhiều mẫu để tiến hành khảo sát các điều kiện và định lượng, nên chúng tôi phải bảo quản mẫu trong tủ lạnh. Để đảm bảo sự chính xác của kết quả định lượng, chúng tôi đã tiến hành khảo sát độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản.
Tiến hành chiết một mẫu hồi theo phương pháp đã chọn. Dịch chiết được xử lý và chuẩn bị mẫu thử định lượng theo mục (2.2.1.2 và 2.2.1.1). Song song chuẩn bị một mẫu chuẩn và tiến hành sắc ký cả hai mẫu, được kết quả lần 1.
Phần dịch chiết còn lại bịt kín để tránh bay hơi dung môi, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 3 ngày lấy mẫu định lượng lần hai như trên. Đồng thời chuẩn bị một mẫu chuẩn theo mục (2.2.1.2).
Một tuần sau lần định lượng đầu, tiến hành lấy mẫu và chuẩn bị mẫu chuẩn để định lượng lần 3.
Sau hai tuần, định lượng lần 4.
Kết quả của 4 lần định lượng được trình bày trong bảng 6:
Bảng 6: Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu
Lần Chuẩn Thử %
Sp^CmAU) C(mgA) Speak(mAU) C(mg/1)
1 1583014 49,37 1825310 56,93 115,31 2 1590098 49,49 1826618 56,85 114,87 3 1604528 49,735 1845652 57,21 115,03 4 1607604 49,56 1849669 57,02 115,05 Giá trị trung bình: X = 115,065% Độ lệch chuẩn: s = 0,182
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = 0,158%
Kết luận: Mẫu dịch chiết đại hồi vẫn ổn định sau hai tuần bảo quản trong tủ lạnh, đảm bảo tính chính xác của kết quả định lượng.
2.2.3. áp dụng phương pháp để định lượng dịch chiết đại hồi:
Để định lượng 3 mẫu hồi khảo sát, chúng tôi tiến hành chiết theo mục (2.2.2.2) rồi xử lý, chuẩn bị mẫu và tiến hành định lượng theo mục (2.2.1).
Kết quả được trình bày ở bảng 7.
Lượng mẫu chuẩn cân là 20,20mg. Lượng hồi đem chiết là 25,Og.
Bảng 7: Kết quả định lượng các mẫu hồi
Mẫu Diện tích peak
(mAU) Hàm lượng (%) Chuẩn 1562013 1 1829847 5,80 2 1548073 4,90 3 1165645 3,69
Như vậy hàm lượng acid shikimic trong đại hồi Việt Nam từ 3,69 - 5,80%. Sở dĩ có sự dao động như vậy là do nguồn gốc các mẫu và chất lượng hổi trên thị trường khác nhau nhiều. Và cũng có thể do lượng hạt trong mỗi mẫu khác nhau.
30C 290 200 -FDY210 Shikinicadd C3.dat rrA - 10C -300 -293 -230 -1S0 -100 -30 'TTTXT-pt r t r p - m y m - r p m r - p - m p r r I I I I . I I I M I I I M I 0.0 Q2 0.4 0.6 Q8 1.0 111" " ỉ''" I'" 1.2 1.4 " I ' rr-r-pr-r-r-rp . M , I I r r p - r 1.8 20 22 " I " 1 ■ I ■' ■ ' I 11 1 111111 1111 2 4 2 6 28 1.6 Mnies
Hình 6: sắc kỷ đồ của mẫu chuẩn
ao
E < : —PDA-210 Siikừricacid 1 M2.dat / V , ỉ " " I ... ... T-n-T-TT . TTT '■ ■ I ,-T-. ■ I I r i , I I , r . ... , I I , I , T-, T , 1 . T7 1 ■ , , T T I , , i p T . ' ! , r T . T , , r r r p ■ , T f . » ■ . r T ■ ■ , p -TT T , ,■TT' T T , , T I , ■ . , ■ T , , ■ I , ! , , I . I ! , I I 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 20 22 24 26 28 ao Mnies Hình 8: sắc kỷ đồ của mẫu 2 Minutes Hình 9: sắc ký đồ của mẩu 3 c = 3
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
Kết luận:
Như vậy sau 3 tháng làm khoá luận tốt nghiệp tôi đã thu được các kết quả sau:
1. Chúng tôi đã xây dựng được chương trình chạy sắc ký trên máy HPLC để định lượng acid shikimic trong dịch chiết đại hồi với các điều kiện:
Cột sắc ký: C18.
Pha động: acid sulíiiric pH=2,7.
Bước sóng phát hiện: 210nm.
Tốc độ dòng: lml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 20[il.
Nhiệt độ cột: 50°c.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
Phương pháp có độ chính xác cao với RSD = 0,238%.
Tính tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ 12,5 - lOOmg/1 với hệ số tương quan R2= 1.
Cho kết quả đúng với phần trăm tìm lại từ 97,98-102,2%.
2. Đã khảo sát một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi: phương pháp chiết bằng siêu âm và phương pháp chiết bằng Soxhlet; khảo sát thời gian chiết và độ ổn định của mẫu. Qua đó xây dựng được phương pháp chiết kiệt acid shikimic trong đại hồi, đáp ứng yêu cầu về mẫu định lượng theo phương pháp HPLC, cụ thể là chiết bằng thiết bị Soxhlet, dung môi chiết là cồn 96° trong
3. ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để xác định hàm lượng acid shikimic trong 3 loại hồi khác nhau trên thị trường, đó là:
- Loại 1: hồi đại hồng, có 7-8 đại đều nhau, mỗi đại mang 1 hạt, có hàm lượng acid shikimic đạt 5,80%.
- Loại 2: có 1-3 đại lép, mỗi đại còn lại đều mang 1 hạt, hàm lượng acid shikimic là 4,90%.
- Loại 3: hồi xô, có nhiều hơn 3 đại lép, màu đen, hàm lượng acid đạt 3,69%. Như vậy, hàm lượng acid shikimic trong đại hồi Việt Nam nằm trong khoảng từ 3,69 - 5,80%. Hàm lượng acid có thể dao động do phụ thuộc nhiều vào chất lượng hồi và lượng hạt trong mỗi quả.
Đề nghị:
Qua quá trình thực nghiệm và dựa trên những kết quả thu được, chúng tôi