Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước

ĐẬT VẤN ĐỀAcid shikimic là một hợp chất quan trọng có trong nhiều loài thực vật và vi sinh vật. Nó là chất trung gian trong quá trình tổng họp các acid amin thơm, alkaloid...Gần đây, acid shikimic còn được dùng làm nguyên liệu để điều chế oseltamivir phosphat (oseltamivir phosphat là hoạt chất trong chế phẩm Tamiflu của Roche có tác dụng chống cúm). Mặc dù dịch cúm đã chấm dứt nhưng luôn có nguy cơ bùng phát, nhu cầu thuốc chống cúm vẫn rất bức thiết. Vì vậy rất cần các nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu và phương pháp hiệu quả nhằm thu được acid shikimic với hiệu suất cao.Đại hồi là nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất acid shikimic. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi có thể từ 57%, nên đại hồi là nguyên liệu chính để sản xuất oseltamivir. Ngoài đại hồi, acid shikimic được tìm thấy trong một số loài khác như : cây bạch quả {Ginkgo biloba), quả sau sau (chi Liquidambar), bạch đàn (Chi Eucalyptus)... hoặc được sinh tổng hợp nhờ vi khuẩn Escherichia coli hay tổng hợp hóa học theo nhiều con đưòng khác nhau. Tuy nhiên các phương pháp này thường phức tạp, hiệu suất thấp vì vậy chưa đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, ở nước ta, đại hồi cũng là một nguồn dược liệu lớn, tiềm năng.Đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic trong đại hồi, song các dung môi được sử dụng đều là dung môi hữu cơ, gây độc hại cho môi trường và người nghiên cứu. Trong khi đó, acid shikimic lại tan rất tốt trong nước, nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu chiết xuất acidshỉkimỉc từ đại hồi bằng nước” với những mục tiêu sau:1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất acid shikimic trong đại hồi bằng nước.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước.

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Đỏ THỊ LOAN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI BẰNG NƯỚC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC s ĩ Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Hân Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược TRƯỜNG ĐH ĐƯỢC HÀ NỘI /I HÀ NỘI-2011 Trong qua trinh thuc hien de khoa luan nay, toi da nhan dugc sir hirong dan va giiip da tan tinh ve moi mat tir cac thay c6 , ban be. Nhan dip nay, toi xin dugc bay to long kinh trong va biet on sau sac ta i: TS. Nguyen Van Han Nguai thay da danh cho toi su huong dan, giup da quy bau. Toi cung xin bay to long biet an sau sac doi vai sir giup da nhiet tinh cua cac Thay c6 giao, anh chi ky thuat vien a Bo mon Cong nghiep dugc, cac thay c6 trong Ban giam hieu, Phong dao tao cung toan the cac thay c6, can bg trong truang dai hoc Dugc Ha Ngi da tao mgi dieu kien giup da toi hoan thanh khoa luan. Toi xin cam an gia dinh va ban be da dong vien, ho trg toi trong suot qua trinh hgc tap va thirc hien khoa luan nay. Ha Ngi, thang 05 nam 2011. Sinh vien. l 6 i c a m o n Do Thi Loan MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC CÁC BẢNG 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, sơ Đ ồ 5 ĐẶT VẤN ĐÈ 6 CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 7 1.1. Tổng quan về add shikỉmỉc 7 1.1.1 Công thức hóa học, tính chất 7 1.1.2 Nguồn gốc acid shikimic 7 1.1.3 Vai trò acid shikimic : 9 1.2 Tồng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acỉd shỉkỉmỉc từ đại hồi 13 1.2.1 Vài nét về cây đại hồi 13 1.2.2 Một số phương pháp chiết xuất, tinh chế acid shikimic từ đại hồi:. 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị : 18 2.1.1 Nguyên vật liệu và hóa chất: 18 2.1.2 Máy móc, thiết bị : 18 2.2 Nội dung nghiên cứu: 19 2.2.1 Khảo sát các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng tới hiệu suất chiết xuất: 19 2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 19 2.3.2 Phương pháp định lượng 20 2.3.3 Phương pháp tinh chế acid shikimic 22 CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xác định hàm lượng acid shỉkimic trong đại hồi 23 3.2 Khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng đến qua trình chiết xuất 24 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước tiểu phân dược liệu 24 3.2.2 Khảo sát yếu tố nhiệt độ chiết xuấ'^ 26 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ DL/DM 28 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH 29 3.3 Xây dựng quy trình tinh chế 30 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO M Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt. Cao lỏng SA/ MeOH : cao chứa shikimic acid trong methanol. Dd: dung dịch. DL/ DM: Khối lượng dược liệu / thể tích dung môi. Dm: dung môi. Dung dịch SA/ MeOH : Dung dịch chứa shikimic acid trong methanol. KTTP : Kích thước tiểu phân. Danh mục các bảng. Bảng 1: Kết quả hàm lượng acid shikimic trong các mẫu có kích thước khác nhau 25 Bảng 2: Kết quả hàm lượng acid shikimic chiết ở các nhiệt độ khác nhau 26 Bảng 3: Hàm lượng acid shikimic ở 2 tỷ lệ DL/ DM 28 Bảng 4: Hàm lượng acid shikimic chiết bằng 2 dung môi có pH khác nhau 29 Danh mục các hình vẽ, sơ đồ. Hình 1.1: Sơ đồ tổng họp acid shikimic theo Raphael (1960) và Smissman (1959) 9 Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp Acid Shikimic theo Dangschat, G. (1950) 9 Hình 1.3: Sơ đồ con đường Shikimat 10 Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp Oseltamivir từ acid shikimic theo Rohloff và các cộng sự 12 Hình 3.1 : sắc ký đồ của dung dịch acid shikimic chuẩn 23 Hình 3.2 : sắc ký đồ của dung dịch mẫu định lượng 24 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của KTTP đến hiệu suất chiết xuất 25 Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất 27 Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưcmg của tỷ lệ DL/DM tới hiệu suất chiét xuất . 28 Hình 3.6: Đồ tìiị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết xuất 29 Hình 3.7: Sơ đồ chiết xuất tinh chế acid shikimic 32 Hình 3.8: Hình ảnh acid shikimic thô 33 Hình 3.9: Hình ảnh acid shikimic tinh khiết 34 ĐẬT VẤN ĐỀ Acid shikimic là một hợp chất quan trọng có trong nhiều loài thực vật và vi sinh vật. Nó là chất trung gian trong quá trình tổng họp các acid amin thơm, alkaloid Gần đây, acid shikimic còn được dùng làm nguyên liệu để điều chế oseltamivir phosphat (oseltamivir phosphat là hoạt chất trong chế phẩm Tamiflu của Roche có tác dụng chống cúm). Mặc dù dịch cúm đã chấm dứt nhưng luôn có nguy cơ bùng phát, nhu cầu thuốc chống cúm vẫn rất bức thiết. Vì vậy rất cần các nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu và phương pháp hiệu quả nhằm thu được acid shikimic với hiệu suất cao. Đại hồi là nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất acid shikimic. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi có thể từ 5-7%, nên đại hồi là nguyên liệu chính để sản xuất oseltamivir. Ngoài đại hồi, acid shikimic được tìm thấy trong một số loài khác như : cây bạch quả {Ginkgo biloba), quả sau sau (chi Liquidambar), bạch đàn (Chi Eucalyptus) hoặc được sinh tổng hợp nhờ vi khuẩn Escherichia coli hay tổng hợp hóa học theo nhiều con đưòng khác nhau. Tuy nhiên các phương pháp này thường phức tạp, hiệu suất thấp vì vậy chưa đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, ở nước ta, đại hồi cũng là một nguồn dược liệu lớn, tiềm năng. Đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic trong đại hồi, song các dung môi được sử dụng đều là dung môi hữu cơ, gây độc hại cho môi trường và người nghiên cứu. Trong khi đó, acid shikimic lại tan rất tốt trong nước, nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu chiết xuất acid shỉkimỉc từ đại hồi bằng nước” với những mục tiêu sau: 1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất acid shikimic trong đại hồi bằng nước. 2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về acid shikỉmic ^ O ^ O H 1.1.1 Công thửc hóa học, tính chất Công thức hóa học : C7H10O5 Công thức cấu tạo : Hơ"'" ổH Tên khoa học : acid (3R,4S,5R) - 3,4,5 - trihydroxy -1-cyclohexen -1- carboxylic . Phân tử lượng : 174,15. Tính chất: Acid Shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước (18%), tan trong methanol, ethanol tuyệt đối, không tan trong ethylacetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa. Nhiệt độ nóng chảy : 183 - 184,5^. Năng suất quay cực [a]*^=-183,8° (C = 4,03/H2O). Dung dịch acid Shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213 nm[24]. 1.1.2 Nguồn gốc acid shikimỉc Acid shikimic được chiết xuất lần đầu tiên bởi Eykman từ 1 loại hồi Nhật Bản shikimi-no-ki ( tên khoa học là Illỉcium religiosum Sỉeb. et Zucc.) vào năm 1885. Do đó tên acid shikimic xuất phát từ tên loài hồi này. [6],[22],[24], Acid shikimic có trong nhiều loài cây, vi sinh vật và có vai trò then chốt trong quá trình sinh tổng hợp. Nhưng chỉ có một số ít loài thực vật có chứa một lượng đáng kể acid shikimic trong đó quan trọng nhất là đại hồi ụilỉcium verum). Cho đến nay đã có nhiều tài liệu nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với tỉ lệ hàm lượng acid shikimic chiết được từ 5 - 7% . Năm 2005, Richard Payne đã chiết tách và phân lập được 7% acid shikimic từ đại hồi. ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu chiết tách acid shikimic tương tự. Nguyễn Quyết Chiến và cộng sự (2006) đã phân lập được 7,02 % acid shikimic từ hồi Việt Nam ụ.verum) [1]. Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2006) thực hiện nghiên cứu chiết tách acid shikimic tại trường đại học Dược - Hà Nội cho tỉ lệ phần trăm acid shikimic từ 5 - 7% [6]. Ngoài ra acid shikimic có thể được chiết xuất từ hạt của quả sau sau (chi Liquidambar) rất phổ biến ở Bắc Mỹ, với hiệu suất khoảng 2 - 4% [12]. Một số loài thực vật khác có chứa acid shikimic bao gồm nho, táo, bạch quả {Ginkgo biloba), liễu (Salix nigra), một số cây thuộc chi Eucalyptus {E.sieberiana F.Muell, E.citriodora), đinh hưoTig {Syzygium aromatỉcum, Myrtaceae), quả cây lý gai ( chi Gooseberry), cây việt quất châu Mỹ và châu Âu {Vaccinium macrocarpon, v.oxycocos, V.myrtilỉus) [S'. Ngoài ra, acid Shikimic còn có thể được tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid Shikimic từ 1,3- butadien-l,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Aider (hình 1.1) [20],[22],[23]. Grewe (1964) và cộng sự tổng hơp acid Shikimic từ 1,3- butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose ( hình 1.2) [10],[22;. OAc hydroquinone 85-90 °c ỌAc X C02H OSO4, EtgO Py, CH2N2 OAc OAc OAc COaMe ốAc 9 HCI acetone OAc 0/, Mg0.290^C d^'Y OAc X OAc H2O, AcOH KOH, Me0H-H20 HO'' i) AC2 O, Py ii) (-)-quinine, MeOH iii) KOH, M6 OH-H2 O OAc QO2H HO'' ^OH OH Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp acid shikimỉc theo Raphael (1960) và Smissman (1959). HO, PO 2H HO^ ìF^2NH2 p-TsCi, Pỵ 37 °c, 7 days CN H O ''' ' V ' ^O H 0 H (-)-quinìc acỉd •O A c V^Ổ C O 2H 'O A c V -n C O 2H aq. NaOH reflux 2.5 h aq. H2 SO4 reflux í > V- 0 'OH H O '' ' Ỵ ' "'OH 0 H Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp Acid Shikỉmic theo Dangschat, G. (1950) 1.1.3 Vai trò acid shikimic : Trong tự nhiên, acid shikimic là một nguyên liệu cần thiết cho quá trình sinh tổng họp các acid amin thơm như L-phenylalanin, L-tyrosin và L- tryptophan hay các chất có nhân thơm trong cây (flavonoid, coumarin), indol [...]... cũng tiến hành chiết xuất và tinh chế acid shikimic từ đại hồi theo phương pháp tương tự Hiệu suất quá trình đạt 5,4% [2] Hiroki Ohira (2009) cùng các cộng sự đã chiết acid shikimic từ đại hồi bằng cách bơm nước nóng ở các nhiệt độ khác nhau dưới áp suất cao qua cột chiết xuất Dịch chiết thu được sau mỗi khoảng thời gian được xác định hàm lượng acid shikimic bằng máy HPLC Hiệu suất chiết xuất của phương... đánh răng Quả hồi là một thành phần không thể thiếu trong một số gia vị như bột cà ri, bột nêm ngũ vị hương, nước dùng phở 16 1.2.2 Một số phương pháp chiết xuất, tinh chế acid shikimic từ đại hồi: Dung môi phân cực có khả năng hòa tan tốt acid shikimic và được lựa chọn làm dung môi chiết xuất hợp chất này Có nhiều phưong pháp chiết đã được áp dụng để chiết acid shikimic từ đại hồi : chiết Soxhlet... (2010) chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng methanol, theo phưong pháp ngâm lạnh và tinh chế bằng hỗn hợp dung môi methanol - ethyl acetat Hiệu suất đạt được 6,68%[3’ Như vậy, ta thấy acid shikimic trong đại hồi rất dễ tan trong nước nóng Đe đảm bảo hiệu suất chiết cao mà phương pháp tinh chế đon giản, tốn ít dung môi ta phải nghiên cứu khảo sát cáo yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất nhằm... sản xuất thuốc phòng chống cúm trong trường hợp xảy ra đại dịch Tuy nhiên cho đến nay các phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đều trải qua quá trình tinh chế bằng trao đổi ion phức tạp, tốn kém khi áp dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp Vì vậy cần phải có nghiên cứu các phương pháp chiết xuất, tinh chế đơn giản, hiệu quả, và kinh tế hơn 1.2 Tổng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết. .. sản phẩm bằng HPLC: hàm lượng acid shikimic trong sản phẩm đạt 98,67% 35 Như vậy, hiệu suất của phương pháp chiết xuất và tinh chế acid shikimic: 74,54% so với lượng acid shikimic có trong đại hồi Nhận xét: So sánh với các phương pháp tinh chế trước đó, phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước tiến hành đơn giản, tiết kiệm, sử dụng dung môi thông dụng Hiệu suất của quá trình chiết xuất và... phương pháp rất cao và thời gian chiết ngắn: hiệu suất chiết xuất acid shikimic so với lượng acid shikimic trong dược liệu đạt 97% sau 10 phút ở nhiệt độ 70°c, đạt hiệu suất 100% sau 5 phút khi chiết ở nhiệt độ 120°c với áp suất 15Mpa [18] Nguyễn Đình Luyện (2006) chiết acid shikimic từ đại hồi với nước nóng ở 60°c (đun cách thủy), chiết kiệt trong 10 giờ ( theo dõi bằng sắc ký lóp mỏng), quy trình... chế đơn giản, hiệu quả, và kinh tế hơn 1.2 Tổng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi 1.2.1 Vài nét về cây đại hồi Cây đại hồi còn có tên khác là đại hồi hưong hay bát giác hồi hương Tên khoa học là Illicium verum Hook.f, họ Hồi ( Illiciacea) 14 Đặc điểm thực vật: cây đại hồi là cây gỗ nhở, cao 6 - lOm Thân thẳng to, cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt sau chuyển... dược liệu/ dung môi chiết xuất: nhằm tìm 1 tỷ lệ dược liệu/ dung môi cho hiệu suất chiết cao, tốn ít dung môi - Ảnh hưởng của pH 2.2.2 Xây dựng phương pháp tinh chế Xây dựng phương pháp hiệu quả, đơn giản tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất Áp dụng phương pháp chiết nóng có khuấy trộn Tiến hành: 20 Xử lý dược liệu: Đại hồi được loại tạp,... shikimic từ đại hồi : chiết Soxhlet với ethanol 96%, chiết bằng nước nóng, phương pháp hồi lưu trong ethanol, phương pháp siêu âm Richard Payne (2005) chiết acid shikimic từ đại hồi bằng thiết bị soxhlet với dung môi ethanol 95% Sau khi loại tạp chất trong dịch chiết: gạn loại dầu, dùng formaldehyd loại tạp và cất loại dung môi, acid shikimic được tinh chế bằng phương pháp trao đổi ion (dùng nhựa trao đổi... trong dịch chiết xử lý phải loại hết nước để có thể kết tinh acid shikimic Loại nước bằng cách: cô dưới áp suất giảm, sấy chân không - Đe acid shikimic kết tinh được trong hỗn hợp dung môi methanol/aceton, cần phải giảm dần độ tan của acid shikimic trong hỗn hợp bằng cách làm bay hơi bớt methanol và giảm nhiệt độ Đối với dịch chiết nước, các giai đoạn tinh chế được tiến hành như sau: - Chiết nóng . trường và người nghiên cứu. Trong khi đó, acid shikimic lại tan rất tốt trong nước, nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : Nghiên cứu chiết xuất acid shỉkimỉc từ đại hồi bằng nước với những. đáng kể acid shikimic trong đó quan trọng nhất là đại hồi ụilỉcium verum). Cho đến nay đã có nhiều tài liệu nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với tỉ lệ hàm lượng acid shikimic chiết. pháp chiết xuất, tinh chế đơn giản, hiệu quả, và kinh tế hơn. 1.2 Tổng quan về Đại hồi và một số phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi. 1.2.1 Vài nét về cây đại hồi Cây đại hồi còn