Acid shikimic có tính chất dễ tan trong nước, methanol, ethanol, không tan trong aceton, ethyl acetat. Trong phương pháp tinh chế acid shikimic, các tác giả sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - ethyl acetat để kết tinh lại acid shikimic.
Tham khảo tài liệu [3], phưoTig pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết methanol gồm các giai đoạn;
- Ngâm lạnh dược liệu trong methanol, thỉnh thoảng khuấy trộn.
- Rút dịch chiết, cô cao đặc, hòa tan trong nước để loại tạp không tan trong nước.
- Cô bớt dung môi, để kết tinh, thu sản phẩm thô.
- Hòa tan sản phẩm thô vào methanol, tẩy màu bằng than hoạt, cô bớt dung môi, để kết tinh, lọc, thu sản phẩm tinh khiết.
Qua thực nghiệm cho thấy :
- Acid shikimic chiếm lượng lớn trong quả đại hồi ( >8%) nhưng rất khó phân lập, kết tinh nếu trong dịch chiết xử lý còn lẫn tạp. Vì vậy, cần phải xử lý, loại hết tạp trong dịch chiết.
- Trong quá trình tinh chế cần phải hạn chế sự có mặt của nước. Nước hòa tan rất tốt acid shikimic lại khó bay hơi vì vậy trong dịch chiết xử lý phải loại hết nước để có thể kết tinh acid shikimic. Loại nước bằng cách: cô dưới áp suất giảm, sấy chân không...
- Đe acid shikimic kết tinh được trong hỗn hợp dung môi methanol/aceton, cần phải giảm dần độ tan của acid shikimic trong hỗn hợp bằng cách làm bay hơi bớt methanol và giảm nhiệt độ.
Đối với dịch chiết nước, các giai đoạn tinh chế được tiến hành như sau: - Chiết nóng dược liệu với nước ở nhiệt độ 100°c trong 1 giờ, có khuấy
trộn.
- Rút dịch chiết, cô cao đặc, hòa tan cao đặc trong methanol, loại tạp không tan trong methanol.
- Cô dung dịch acid shikimic trong methanol thành cao lỏng 4:1. Thêm aceton, để kết tinh, lọc thu sản phẩm thô.
- Hòa tan sản phẩm thô trong methanol, tẩy màu bằng than hoạt. Cô bớt dung môi, thêm aceton để kết tinh, lọc và thu sản phẩm tinh khiết.
a. Sơ đồ phương pháp ( hình 3.7).
b. M6 ta phiromg phap:
Can 200g bot dai h6i cho vao binh non lOOOmL, them 600mL nuac c4t. Dat len may khuay tir, khuay va dun den nhiet do 100®C, trong 1 gia. Lam nguoi. Gan, loc liy dich chiet. Ba dirge lieu tien chilt Ian 2, l4n 3, moi Ian voi 150mL nuac cat. Gop dich chiet 3 Ian, dem c6 duoi ap suat giam, thanh cao dac ( khoang 25mL).
H6a tan cao dac trong 150mL MeOH, khuay ky, de yen 2 gio cha lang tua. Loc loai tiia, rua tua 3 Ian, moi Ian 20mL MeOH. Phin dich loc dugfc c6 bat t h ^ cao long 4:1 ( khoang 50mL)
Them vao cao long 150mL aceton. Khuay ky, dl kit tinh 2 ngay. Loc lay tinh the, rua tinh the 3 Ian, moi Ian 30mL aceton. Thu dugfc san pham tho mau vang nau, xop, khoi lugng 18,85g ( hinh 3.8 ).
Hòa tan sản phẩm thô vào khoảng lOOmL MeOH, đun nóng, thêm Ig than hoạt để loại tạp chất màu. Lọc loại bỏ than hoạt, dịch lọc trong suốt được cô bớt còn khoảng 20mL, thêm 50mL aceton,
Để yên cho acid shikimic kết tinh. Lọc, rửa tinh thể 3 lần, mỗi lần 15mL aceton, sấy. Thu sản phẩm acid shikimic kết tinh màu trắng.
Sản phẩm acid shikimic sau khi sấy có dạng bột kết tinh màu trắng, tơi xốp, khối lượng: 13,22g. ( hình 3.9)
Hình 3.9: Hình ảnh acỉd shikimỉc tỉnh khiết.
Định lượng sản phẩm bằng HPLC: hàm lượng acid shikimic trong sản phẩm đạt 98,67%.
Như vậy, hiệu suất của phương pháp chiết xuất và tinh chế acid shikimic: 74,54% so với lượng acid shikimic có trong đại hồi.
Nhận xét:
So sánh với các phương pháp tinh chế trước đó, phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước tiến hành đơn giản, tiết kiệm, sử dụng dung môi thông dụng. Hiệu suất của quá trình chiết xuất và tinh chế khá cao (74,54%), sản phẩm acid shikimic thu được có độ tinh khiết cao.
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KẾT LUẬN
Qua những kết quả đã thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau: 1. Đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước.
- Kích thước tiểu phân dược liệu từ 0,25 ^l,00m m cho hiệu suất chiết cao hơn so với 2 phân đoạn: KTTP < 0,25mm và 1,00 ^ l,50mm.
- Nhiệt độ chiết xuất hiệu quả nhất là 100°c. Thời gian đạt cân bằng là sau 1 giờ, với hiệu suất trên 93%.
- Tỷ lệ dược liệu/ dung môi 5% cho hiệu suất chiết cao hơn tỷ lệ 10%, tuy nhiên, với sự chênh lệch hiệu suất không lớn.
- Chiết xuất bằng dung dịch acid sulfuric ở nhiệt độ 30°c cho hiệu suất cao hơn chiết bằng dung môi nước cất, song sự chênh lệch này rất nhỏ. 2. Đã xây dựng được phưong pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước. Sử dụng hỗn họp dung môi methanol - aceton (1:3) để kết tinh acid shikimic. Phương pháp tinh chế này đơn giản, ít tốn kém, chỉ sử dụng dung môi thông dụng để loại tạp chất và kết tinh acid shikimic.
KIÉN NGHỊ
Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Chúng tôi đề n g h ị:
Nghiên cứu triển khai chiết xuất đại hồi bằng nước trên quy mô lớn hofn để đánh giá kết quả sát với điều kiện thực tế và có thể ứng dụng trong sản xuất.
Khảo sát thêm phương pháp chiết xuất acid shikimic bằng dung dịch acid sulftiric 0,5%, và phưong pháp tinh chế acid shikimic khi dùng dung dịch acid sulfuric làm dung môi chiết xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Quyết Chiến, Đoàn Thị Mai Hương, Phạm Văn Cường, Trần Thị Thu Thủy, Lê Anh Tuấn, Phạm Xuân Vũ, Nguyễn Văn Hùng (2006), “Phân lập axit shikimic từ quả hồi Việt Nam ụilicium verum Hook.f- Illciaceae)”, Tạp chí hóa học, 6, tr. 745-748.
2. Nguyễn Quyết Chiến (2006), “Chọn lựa một hướng đi trong nghiên cứu tổng hợp Oseltamivir (Tamiflu) ở Việt Nam”, Tạp chỉ hóa học, 45, tr.
199-206.
3. Nguyễn Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu chiết xuất acid shikỉmic từ đại hồi, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ khóa 2005-2010, Trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
4. Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuât sản xuầt dược phẩm /, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 137-146.
5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 323-324, tr. 524-525.
6. Nguyễn Đình Luyện (2006), “Chiết xuất acid shikimic từ hoa hồi (Illicium verum H o o k . fTạp chỉ Dược học, 358, tr. 8-9.
7. Phạm Xuân Sinh (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học, tr. 144-145.
8. Hà Thị Mai Trang (2007), Nghiên cứu định lượng acid shỉkimỉc trong đại hồi bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ khóa 2002-2007, Trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
9. Bogosian p. et al. (2008), “Use of glyphosate to produce shikimic acid in microorganisms”, World intellectual property organization, 128076.
10. Dangschat G., Ho. F, (1950), “Configurational relationships between naturally occurring cyclic plant acids and glucose; transformation of quinic acid into shikimic acid”, Biochim Biophys Acta, 4(1-3), pp. 199-204.
11. Davies GM, Baưett-Bee KJ, Jude DA, Lehan M, Nichols w w , Pinder PE, Thain JL, Watkins WJ, Wilson RG. (1994), “(6S)-6-fluoroshikimic acid, an antibacterial agent acting on the aromatic biosynthetic pathway”,
Antimicrob Agents Chemother., 38(2), pp. 403-406.
12. Enrich L. B., Scheuermann M. L., Mohadjer A., Matthias K. R., Eller c . F., Newman M. s., Fujinaka M., Poon T., (2008), “Liquidambar styraciflua: a renewable source of shikimic acid”, Tetrahedron Letters, 49, 2503-2505.
13. Herrmann M. K. (1995), “The Shikimate Pathway : Early Steps in the Biosynthesis of Aromatic Compounds”, American Society o f Plant Physiologists, The Plant Cell, 7, pp. 907-919.
14. Huang I. et al. (2002), “Anti-Platelet and Anti-Thrombotic Effects of Triacetylshikimic Acid in Rats”, Journal o f Cardiovascular Pharmacology,
39(2), pp. 262-270.
15. Kudo Y., Oka J., Yamada K. (1981), “Anisatin, apotent GABA antagonist, isolated from Illicium anisatum”. Neuroscience Letters, 25, pp. 83-88.
16. List H. P., Schmidt c . p. (2000), Phytopharmaceutical Technology,
CRC Press, pp. 105-107.
17. Ludlow I. D., Ragone s., Bruck I. s., Bernstein J. N., Duchowny M., Garcia Pen'a B. (2004), “Neurotoxicities in Infants Seen With the
Consumption of Star Anise Tea ”, American Academy o f Pediatrics, 144(5), pp. 653 - 656.
18. Ohira H., Torii N., Aida M. T., Watanabe M., Smith L. R. (2009), “Rapid separation of shikimic acid from Chinese star anise (Illicium verum Hook, f ) with hot water extraction”. Separation and Purification Technology, 69, p. 102-108.
19. Payne R., Edmonds M. (2005), “Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed”, Journal o f Chemical Education, 82(4), pp. 599-600.
20. Raphael R. A., McCrindle R., Overton K. H. (1960), “A stereospecific total synthesis of D-(-)-shikimic acid”. Journal o f the Chemical Society, pp.
1560-1565.
21. Rohloff J. C. et al,(1998), “Practical total synthesis of the Anti- Influenza drug GS-4104 ”, Journal o f Organic Chemistry, 63, pp. 4545-4550. 22. Singh G., Jiang S. (1998), “Chemical synthesis of shikimic acid and its analogues”, Tetrahedron, 54, pp. 4697-4753.
23. Smissman E. E., Suh J. T., Oxman M., Daniels R. (1959), “A stereospecific synthesis of DL - shikimic acid 1 “, Journal o f the American Chemical Society, 81(11), 2909-2910.