Nghiên cứu chiết xuất cofactor f420 từ mycobacterium smegmatis mc 2 4517

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT COFACTOR F420 TỪ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS MC2 4517 Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: NGUYỄN QUỐC THÁI Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT COFACTOR F420 TỪ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS MC2 4517 (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) / /2019) Nguyễn Quốc Thái Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC HÌNH III ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG – TỔNG QUAN .2 1.1 DEAZAFLAVIN COFACTOR F420 VÀ CÁC ENZYM PHỤ THUỘC F420 .2 1.2 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP F420 CHƯƠNG – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 CHỦNG SINH VẬT 2.1.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 2.1.3 TRANG THIẾT BỊ 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 NUÔI CẤY VÀ THU SINH KHỐI 2.2.2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F420 TỪ TẾ BÀO M SMEGMATIS 2.2.3 TINH CHẾ COFACTOR F420 TỪ DỊCH CHIẾT TẾ BÀO 2.2.4 XÁC ĐỊNH VÀ TÍNH TOÁN NỒNG ĐỘ COFACTOR F420 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS VÀ PHỔ HUỲNH QUANG 10 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 11 3.1 NUÔI CẤY VÀ THU SINH KHỐI 11 3.2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F420 TỪ TẾ BÀO M SMEGMATIS 11 3.2.1 RỬA CẮN TẾ BÀO 11 i 3.2.2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F420 11 3.3 TINH CHẾ COFACTOR F420 TỪ DỊCH CHIẾT TẾ BÀO 12 3.3.1 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION TRÊN CỘT Q-SEPHAROSE FF 12 3.3.2 SẮC KÝ TƯƠNG TÁC KỴ NƯỚC VỚI CỘT FLORISIL 14 3.3.3 CÔ QUAY CHÂN KHÔNG 15 3.4 XÁC ĐỊNH VÀ TÍNH TỐN NỒNG ĐỘ COFACTOR F420 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS VÀ PHỔ HUỲNH QUANG 15 3.4.1 QUANG PHỔ UV-VIS 15 3.4.2 QUANG PHỔ HUỲNH QUANG 15 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 18 KẾT LUẬN 18 ĐỀ NGHỊ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học F420 Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết M smegmatis qua cột trao đổi anion Q- 13 FF Sepharose Hình 3.2 Màu sắc cofactor F420 từ dịch chiết M smegmatis cột 13 trao đ ổi anion Q-FF Sepharose phân đo ạn sau khỏi cột Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết M smegmatis qua cột Florisil 14 Hình 3.4 Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến, phổ huỳnh quang kích thích 16 phát xạ F420 Hình 3.5 Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến, phổ huỳnh quang kích thích phát xạ F420 sau trình tinh chế iii 17 ĐẶT VẤN ĐỀ Cofactor F420 đồng yếu tố cho gặp tự nhiên, xuất giới hạn archaea actinomycete Những nghiên cứu gần F420 phân bố rộng rãi, có mặt 11% tất vi khuẩn archaea giải trình tự Đặc biệt, nghiên cứu nhóm thuốc điều trị lao đ a kháng thuốc với cấu trúc nitroimidazol pretomanid, delamanid, chế tác động nhóm liên quan đến phản ứng khử chọn lọc nhờ xúc tác enzym phụ thuộc F420 dạng khử (F420H2) Ngày nhiều enzym phụ thuộc F420 phát nghiên cứu ứng dụng xúc tác sinh học phát triển thuốc kháng lao Tuy nhiên, hạn chế lớn việc nghiên cứu enzym F420 cofactor chưa thương mại hố; nhóm nghiên cứu phải tự chiết xuất từ vi khuẩn Ở Việt Nam theo chúng tơi đư ợc biết chưa có nhóm nghiên cứu khảo sát chiết xuất tinh chế F420 Do đề tài chúng tơi tiến hành khảo sát việc chiết xuất cofactor điều kiện phịng thí nghiệm Hố sinh Việt Nam Chương – TỔNG QUAN 1.1 Deazaflavin cofactor F420 enzym phụ thuộc F420 Deazaflavin cofactor F420 chứa chromophor 7,8-didemethyl-8-hydroxy-5deazaisoalloxazin phân lập đ ầu tiên Methanobacterium bryantii (Hình 1.1) [1] Tên gọi F420 có nguồn gốc từ đỉnh hấp thu vùng khả kiến đ ặc trưng cofactor bước sóng 420 nm Hai dạng cofactor deazaflavin có hoạt tính sinh học 7,8-didemethyl-8-hydroxy-5-deazariboflavin (F0 hay FO, tương đương với riboflavin), dẫn xuất lactyl oligoglutamat phosphodiester F420 Những thay đổi dường nhỏ vòng isoalloxazin so sánh với flavin (N5 thay C, thiếu nhóm methyl vị trí 8, thêm nhóm hydroxy vị trí 8) dẫn đến tính chất lý hố deazaflavin khác biệt lớn so với cofactor flavin Trong flavin có khả trung gian chuyển electron phản ứng oxy hoá – khử phản ứng đư ợc với oxy phân tử, cofactor deazaflavin tham gia phản ứng chuyển nhóm hydrid phản ứng chậm với O2 Do đó, deazaflavin dường tương đồng nhiều với cofactor nicotinamid xem “một cofactor nicotinamid áo flavin” (“a nicotinamide in a flavin’s clothing”) [2] Mặc khác, deazaflavin oxy hố – khử thấp nhiều (−340 mV) so với giá trị flavin (−220 mV) chí nicotinamid (−320 mV), trở thành cofactor oxy hố khử oxy hoá – khử thấp hệ thống sinh học [3,4] Ban đầu người ta nghĩ F420 phân bố hẹp archaea số chủng actinomycete chọn lọc Tuy nhiên, nghiên cứu phân tích so sánh gen nhiều liệu hoá sinh học năm gần ngày cho thấy cofactor có mặt rộng khắp nhiều so với suy nghĩ trước [5], [6] Cụ thể loại cofactor flavin khơng điển hình cofactor dự đốn có mặt 11% số tất vi khuẩn archaea giải trình tự [7] O OH R= NH N N O H N O P O HO O OH OH O O R O O O O n n: số lượng nhóm glutamat, từ 2–9 tuỳ theo lồi Hình 1.1 Cấu trúc hố học F420 Mặc dù phân lập mô tả sớm từ năm 70 kỷ XX phòng thí nghiệm Wolfe’s laboratory [1], có nghiên cứu enzym sử dụng F420, chủ yếu tập trung nhóm chuyên archaea; nguyên nhân có lẽ cofactor chưa thương mại hố Tuy nhiên, thập kỷ gần cofactor nhận quan tâm lớn từ cộng động khoa học sau việc khám phá nhóm thuốc kháng lao mới—nhóm nitroimidazol Nhóm thuốc hoạt động tiền chất Mycobacterium tuberculosis (Mtb) hoạt hoá in vivo phản ứng khử chọn lọc xúc tác reductase phụ thuộc F420H2 chuyên biệt Rv3547 [8] Những thuốc nhóm nitroimidazol vịng đơi này, delamanid (OPC-67683) [9] pretomanid (PA-824) [10] thuốc có tiềm lớn chúng khơng tác dụng lên vi khuẩn nhân đơi mà cịn giết đư ợc trực khuẩn lao không nhân đôi Những vi khuẩn đ ang ngủ lý kéo dài thời gian điều trị nguyên nhân cho nhiễm lao tìm ẩn kháng hố trị liệu truyền thống [11] Quan trọng chưa thấy đề kháng chéo với thuốc kháng lao khác chế tác động nhóm thuốc Delamanid (biệt dược Deltyba) quan y tế châu Âu chấp thuận cho sử dụng nhiễm lao đa kháng thuốc năm 2013 Trong đó, pretomanid quan thực dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận cho sử dụng phối hợp thuốc khác lao kháng thuốc lao siêu kháng thuốc tháng năm 2019 Kết nghiên cứu enzym tương đồng với Rv3547 cho thấy tiềm phát triển nitroimidazol hệ với chế hoạt hoá dựa vào enzym khác ngồi Rv3547 từ giảm thiểu khả đề kháng chéo [6] Với oxy hoá khử thấp cofactor deazaflavin, reductase sử dụng F420H2 có khả xúc tác phản ứng cộng hydro cho nhiều nhóm hợp chất hữu enon [12-14] imin [15-17] nhiều loại dị vòng khác [18] 1.2 Chiết xuất phân lập F420 Mặc dù enzym sử dụng cofactor F420 có tiềm lớn ứng dụng nghiên cứu thuốc kháng lao làm xúc tác sinh học, rào cản việc nghiên cứu enzym nguồn cofactor F420 Trước đ ây, F420 chiết xuất chủ yếu từ archea Methanobacterium thermoautotrophicum địi hỏi điều kiện ni cấy chuyên biệt chúng thuộc chủng kỵ khí sinh khí methan đồng thời cho hiệu suất thấp (1,9 µmol F420/g tế bào khơ) Việc phân lập F420 trở nên dễ dàng quy trình chiết xuất cofactor từ Mycobacterium smegmatis tìm [19] Nhóm nghiên cứu đ ã khảo sát việc phân lập F420 từ nhiều chủng actinomycet khác sử dụng bình lắc hệ thống lên men fermentor Trong M smegmatis đ ánh giá vi khuẩn an toàn, không gây bệnh, dễ nuôi cấy cho hiệu suất F420 cao, có khả sản xuất quy mơ lớn sử dụng fermentor Một chủng M smegmatis cải tiến với khả sản xuất F420 hiệu suất cao khảo sát [20] Theo nghiên cứu việc phân lập cofactor F420 từ actinomycet nói chung M smegmatis nói riêng gồm bước sau [19]: – Nuôi cấy vi khuẩn môi trường giàu dinh dưỡng đ ể thu đư ợc sinh khối cao, thường sử dụng hệ thống lên men fermentor – Phá vỡ tế bào cách hấp tiệt trùng, tán siêu âm French press, thu dịch chiết có chứa F420 – Tinh chế F420 sắc ký trao đổi anion với Q-Sepharose chứa nhóm amoni bậc IV QAE-Sepharose (aminoethyl bậc IV) sau dùng cột sắc ký tương tác kỵ nước Florisil cột silica gel C18 Các mẫu cofactor F420 cần đ ộ tinh khiết cao tinh chế thêm sắc ký lỏng hiệu cao áp Tuỳ vào điều kiện trang thiết bị cụ thể phịng thí nghiệm mà q trình ni cấy tế bào quy trình chiết xuất cofactor F420 có biến thể định Trong khuôn khổ đề tài tiến hành khảo sát việc nuôi cấy, chiết xuất phân lập F420 từ M smegmatis điều kiện trang thiết bị phịng thí nghiệm Hố sinh, Cơng nghệ sinh học Việt Nam nói chung khoa Dược, đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh nói riêng 2.1.3 Trang thiết bị – Cân phân tích Sartarius – Tủ đơng –80 °C Sanyo – Nồi hấp tiệt trùng UC-280A – Máy ly tâm GmbH – Máy đo UV-Vis SP 8001 – Máy đọc đĩa Synergy MX (Biotek) – Máy đo pH NeoMet pH-200L – Máy lắc GryroTwister – Hệ thống Akta Purifier (GE Healthcare) – Cột sắc ký nhồi Q-Sepharose FF Florisil – Máy khuấy từ gia nhiệt – Máy cô quay Rotavap (Buchi) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nuôi cấy thu sinh khối Nuôi cấy tế bào M smegmatis Dịch chứa môi trường tăng sinh sau đư ợc gây nhiễm chủng M smegmatis mc2 4517 nuôi bình nón 250 mL vịng 48 máy lắc 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Dịch tăng sinh sau dùng để cấy nhiễm cho mơi trường MSR (thể tích sử dụng 10% thể tích mơi trường MSR) Vi khuẩn tiếp tục ni bình nón 500 mL có vách máy lắc 37 °C với tốc độ lắc 200 vòng/phút vòng từ 4–5 ngày độ hấp thu 600 nm (OD600) dịch nuôi cấy đạt ~15 Thu sinh khối Tế bào thu cách ly tâm dịch nuôi cấy 20 phút °C với tốc độ 6000 × g Cắn tế bào cân để theo dõi khối lượng tế bào ướt 2.2.2 Chiết xuất cofactor F420 từ tế bào M smegmatis Rửa cắn tế bào Cắn tế bào rửa với đệm NaPO4 (25 mM, pH 7) với thể tích mL/ g tế bào ướt cách khuấy trộn với máy khuấy từ Sau dịch tế bào đệm ly tâm mục 2.2.1 Phần dịch chứa mơi trường MSR cịn sót lại loại bỏ Chiết xuất cofactor F420 Cắn tế bào sau rửa trộn với đệm NaPO4 (25 mM, pH 7,0) với thể tích mL/ g tế bào ướt cách khuấy trộn với máy khuấy từ Sau dịch tế bào đệm đun sơi khuấy trộn cốc có mỏ 20 phút máy khuấy từ gia nhiệt Hỗn hợp ly tâm 20 phút 4°C với tốc độ 6000 × g để thu dịch chiết Q trình phân tán cắn tế bào, đun sôi ly tâm để thu dịch chiết đư ợc lặp lại lần Dịch chiết từ lần đư ợc gom chung chỉnh pH 7,0 với NaOH 2.2.3 Tinh chế cofactor F420 từ dịch chiết tế bào Dịch chiết tế bào từ lần chiết ly tâm 30 phút °C với tốc đ ộ 14000 × g đư ợc lọc qua màng lọc 0,45 µm (GE Healthcare Life Science Whatman FP30/0,45 CA) Dịch chiết sau tinh chế để thu cofactor F420 qua giai đoạn: 2.2.3.1 Sắc ký trao đổi ion cột Q-Sepharose FF Sắc ký trao đổi ion cột Q-Sepharose FF với thể tích cột (CV) = 60 mL tiến hành với bước sau: – Cân cột trước 5CV dung dịch đệm NaPO4 mM (25 mM, pH 7,0) – Nạp dịch chiết tế bào sau lọc nạp lên cột – Rửa cột với 5CV dung dịch chứa NaCl nồng đ ộ 200 mM đ ệm NaPO4 (25 mM, pH 7,0) – Rửa giải F420 cách chạy gradient nồng đ ộ NaCl từ 200 mM đến M 10CV Quá trình rửa giải cột theo dõi bước sóng 420 nm (đỉnh hấp thu đặc trưng cofactor F420) Các phân đoạn nằm rửa giải peak sắc ký đồ khoảng nồng độ 600 mM NaCl chứa F420 thu lại 2.2.3.2 Sắc ký tương tác kỵ nước với cột Florisil Florisil vật liệu nhồi cột điều chế từ trình đồng kết tủa hỗn hợp silica gel magnesium oxid, bao gồm khoảng 84% silic dioxid, 15,5% magnesium oxid 0,5% natri sulfat Sắc ký cột Florisil (magnesium silica) với thể tích cột (CV) = 60 mL tiến hành với bước sau: – Chuẩn bị Florisil trước nhồi cột: + Hoạt hoá Florisil cách rửa với HCl M + Rửa lại Florisil với nước cất pH dịch rửa gần pH 7,0 + Rửa Florisil aceton + Florisil sau hoạt hố sấy khơ 80 °C – Cân cột Florisil với 5CV đệm Na acetat (25 mM, pH 4,7) – Các phân đo ạn chứa F420 rửa giải từ cột Sepharose đư ợc trộn chung ều chỉnh pH 4,7 với acid acetic nạp lên cột Florisil – Rửa cột nạp dịch chiết F420 qua bước sau, lần 5CV: 1) Đệm natri acetat (25 mM, pH 4,7) chứa 400 mM NaCl 2) Đệm natri acetat (25 mM, pH 4,7) chứa 100 mM NaCl 3) Đệm có natri acetat (25 mM, pH 4,7) – Rửa giải F420 đệm chứa 25 mM NH4HCO3 Theo dõi trình rửa giải độ hấp thu bước sóng 420 nm 2.2.3.2 Cô quay chân không Phân đo ạn F420 sau tinh chế qua cột Florisil cô quay cho đ ến thể tích mẫu thay đổi vịng 30 phút Mẫu F420 thu kiểm tra nồng độ trữ −20 °C để sử dụng cho thử nghiệm enzym 2.2.4 Xác định tính toán nồng độ cofactor F420 phương pháp quang phổ UV-vis phổ huỳnh quang 2.2.4.1 Quang phổ UV-vis 200 µL dịch chiết đư ợc cho vào đĩa 96-giếng quét phổ hấp thu từ 300–700 nm máy đ ọc đĩa Synergy MX (Biotek) Đ ộ hấp thu 420 nm đư ợc sử dụng đ ể tính tốn nồng đ ộ F420 với hệ số hấp thu mol ε420 nm = 41,4 mM−1 cm−1 [21,22] 2.2.4.2 Quang phổ huỳnh quang 200 µL dịch chiết cho vào đĩa 96-giếng máy đ ọc đĩa Synergy MX (Biotek) tiến hành quét phổ kích thích phổ phát xạ bước sóng phát xạ 470 nm bước sóng kích thích 420 nm 10 Chương – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nuôi cấy thu sinh khối M smegmatis mc2 4517 nuôi môi trường MSR sau 4–5 ngày độ hấp thu 600 nm (OD600) dịch nuôi cấy đ ạt ~15 thu khoảng 50 g tế bào ướt/ L dịch nuôi cấy Nhận xét Môi trường MSR (Modified Strullu and Roman) giàu chất dinh dưỡng, có bổ sung glucose, sắt đ ệm phosphat nên có khả trì cho vi khuẩn phát triển đến ngày đạt mức sinh khối cao 3.2 Chiết xuất cofactor F420 từ tế bào M smegmatis 3.2.1 Rửa cắn tế bào Chúng thêm bước rửa cắn tế bào với đệm NaPO4 (25 mM, pH 7) trước tiến hành phá vỡ tế bào Nhận xét Ở thí nghiệm ban đầu bỏ qua bước dịch chiết tế bào đậm màu chứa mơi trường MSR cịn sót lại dễ bám tạp MSR lên cột Q-Sepharose 3.2.2 Chiết xuất cofactor F420 Tế bào rửa phân tán đệm NaPO4 (25 mM, pH 7,0) phá vỡ cách đun sơi sau ly tâm 20 phút °C với tốc độ 6000 × g để thu dịch chiết Quá trình lặp lại lần thu dịch chiết có màu vàng suốt Nhận xét 11 Trong quy trình gốc, nhóm tác giả Isabel [19] sử dụng phương pháp hấp tiệt trùng để chiết xuất F420 Thực nghiệm chúng tơi nhận thấy phương pháp có nhiều hạn chế như: – Thời gian hấp tương đương với quy trình đ un sơi tổng thời gian thực thí nghiệm dài gấp đơi q trình nồi hấp hạ nhiệt độ cần nhiều thời gian – Dịch chiết có nhiều tạp chất dễ gây nghẽn lọc 0,45 µm, dịch sau lọc không suốt – Dịch chiết sau tinh chế qua cột Q-Sepharose gây bẩn cột có nhiều chất màu tạo phóng thích q trình hấp nhiệt độ cao Khảo sát số lần chiết đun sôi cho thấy tăng số lần chiết lên 4–5 không tăng hiệu suất chiết làm tăng đáng kể thời gian thí nghiệm chúng tơi chọn chiết lần đun sôi 3.3 Tinh chế cofactor F420 từ dịch chiết tế bào Dịch chiết tế bào từ lần chiết ly tâm 30 phút °C với tốc đ ộ 14000 × g lọc qua màng lọc 0,45 µm nhằm loại bỏ chất khơng tan dịch chiết làm nghẽn cột Dịch chiết sau tinh chế để thu cofactor F420 qua giai đoạn: 3.3.1 Sắc ký trao đổi ion cột Q-Sepharose FF Sắc ký trao đổi anion cột Q-Sepharose FF sử dụng với trình rửa giải cột đư ợc theo dõi bước sóng 420 nm (đỉnh hấp thu đ ặc trưng cofactor F420, đường màu hồng hình 3.1) Các phân đoạn nằm rửa giải peak sắc ký đồ (Hình 3.1) khoảng nồng độ 600 mM NaCl chứa F420 thu lại F420 có màu vàng phát huỳnh quang xanh dương ánh mặt trời quan sát mắt thường lưu giữ lại cột phân đoạn sau rửa giải (Hình 3.2) 12 Hình 3.2 Sắc ký đ dịch chiết M smegmatis qua cột trao đ ổi anion Q-FF Sepharose Hình 3.2 Màu sắc cofactor F420 từ dịch chiết M smegmatis (trái) cột trao đổi anion Q-FF Sepharose (phải) phân đoạn sau khỏi cột Tính tốn lượng F420 thu đư ợc dựa vào đ ộ hấp thu 420 nm ta thu đư ợc sau bước tinh chế qua cột Q-FF Sepharose 1,85 µmol/ L dịch ni cấy 13 3.3.2 Sắc ký tương tác kỵ nước với cột Florisil Các phân đo ạn chứa F420 rửa giải từ cột Sepharose đư ợc trộn chung điều chỉnh pH 4,7 với acid acetic nạp lên cột Florisil Khi giảm dần nồng đ ộ muối tăng pH đ ệm ta quan sát thấy F420 rửa giải khỏi cột (theo dõi độ hấp thu 420 nm) (Hình 3.3) Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết M smegmatis qua cột Florisil Tính tốn lượng F420 thu đư ợc dựa vào đ ộ hấp thu 420 nm ta thu đư ợc sau bước tinh chế qua cột Florisil 1,46 µmol/ L dịch ni cấy Nhận xét – Nếu bỏ qua giai đoạn hoạt hoá Florisil với HCl N làm giảm chí khả gắn giữ mẫu Do đ ó sau lần chạy phải tái xử lý hoạt hoá Florisil theo quy trình mục 2.2.3.2 – Nhóm tác giả Isabel [19] sử dụng nước cất đ ể rửa giải F420 Thực nghiệm nhận thấy việc rửa giải nước dẫn đ ến lượng dịch rửa giải 14 lớn, thời gian rửa giải dài (đến độ hấp thu 420 nm dịch rửa giải khơng thay đổi) Do chúng tơi điều chỉnh quy trình rửa giải F420 đệm chứa 25 mM NH4HCO3 cho thấy khả rửa giải tốt hơn, thu đư ợc khoảng 200 mL dịch chứa F420 cho mẻ vi khuẩn từ L dịch tế bào 3.3.3 Cô quay chân không Phân đo ạn F420 sau tinh chế qua cột Florisil đư ợc cô quay để loại bỏ NH4HCO3 hợp chất bay khác lẫn dịch chiết đồng thời cô đặc mẫu để sử dụng cho thử nghiệm enzym 3.4 Xác định tính tốn nồng độ cofactor F420 phương pháp quang phổ UV-vis phổ huỳnh quang 3.4.1 Quang phổ UV-vis 200 µL dịch chiết quét phổ hấp thu từ 300–700 nm cho thấy đỉnh hấp thu đặc trưng F420 vùng khả kiến 420 nm (Hình 3.4, 3.5a) Độ hấp thu bước sóng sử dụng để tính tốn nồng độ F420 mẫu thơng qua độ hấp thu mol 3.4.2 Quang phổ huỳnh quang F420 sau tinh chế thể phổ huỳnh quang đặc trưng (Hình 3.4, 3.5b, c): Khi qt phổ huỳnh quang kích thích bước sóng phát xạ 470 nm F420 cho đỉnh kích thích đặc trưng bước sóng 420 nm Khi quét phổ huỳnh phát xạ bước sóng kích thích 420 nm F420 cho đỉnh phát xạ đặc trưng bước sóng 470–480 nm Nhận xét Qua q trình tinh chế ta thu cofactor F420 có đỉnh hấp thu đặc trưng phổ hấp thu tử ngoại khả kiến phổ huỳnh quang đ ặc trưng Trong thí nghiệm enzym thường quy sử dụng cofactor cho phản ứng xúc tác enzym phụ thuộc cofactor F420 đề tài khác 15 Những trường hợp cần cofactor F420 với độ tinh khiết cao thí nghiệm đồng kết tinh nhúng tinh thể protein vào dung dịch F420 để chụp nhiễu xa tinh thể tia X tiếp tục tinh chế F420 với sắc ký lỏng hiệu cao Hình 3.4 Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến (đường liền nét, bên trái), phổ huỳnh quang kích thích (đường đứt nét) phát xạ (đường liền nét, bên phải) F420 [23] a) E8 1,800 Mean Max OD 1,600 1,400 1,200 W at Mean Max OD OD 1,000 0,800 0,600 0,400 Mean Min OD 0,000 300 350 400 450 500 550 Wavelength (nm) 16 600 650 700 W at Mean Min OD 0,200 b) E8 60000 Mean Max RFU 50000 W at Mean Max RFU RFU 40000 30000 20000 10000 W at Mean Min RFU Mean RFU Min 300 250 350 400 450 600 650 500 Wavelength (nm) c) E8 60000 50000 Mean Max RFU 30000 20000 W at Mean Max RFU RFU 40000 10000 W at Mean Min RFU Mean Min RFU 500 450 550 700 Wavelength (nm) Hình 3.5 a) Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến, (b) phổ huỳnh quang kích thích (c) phát xạ (đường liền nét, bên phải) F420 sau trình tinh chế 17 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Với mục tiêu nghiên cứu quy trình ni cấy chiết xuất cofactor F420 từ vi khuẩn M smegmatis mc24517, đề tài thu kết sau: Quy trình ni cấy M smegmatis mc2 4517 với mơi trường MSR bình lắc thu sinh khối cao (~50 g tế bào ướt/ L dịch nuôi cấy) Quy trình chiết xuất F420 từ tế bào M smegmatis cách đun sôi ly tâm thu dịch chiết, tiết kiệm thời gian thu dịch chiết tạp so với phương pháp hấp tiệt trùng báo cáo [19] Quy trình tinh chế F420 qua bước sắc ký trao đ ổi anion cột Q-FF Sepharose sắc ký tương tác kỵ nước cột Florisil thu 1,46 µmol F420/ L dịch ni cấy Cofactor F420 sau tinh chế có phổ hấp thu tử ngoại khả kiến đặc trưng phổ huỳnh quang đặc hiệu phù hợp với phổ công bố Đề nghị Nếu đề tài tiếp tục đề nghị: Nghiên cứu nuôi cấy M smegmatis mc2 4517 quy mô lớn sử dụng fermentor để thu sinh khối cao Thay bước sử dụng cột Florisil (đòi hỏi phải xử lý hoạt hoá lần sử dụng) kỹ thuật chiết pha rắn với silica gel C18 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cheeseman P, Toms-Wood A & Wolfe RS (1972) Isolation and properties of a fluorescent compound, factor 420, from Methanobacterium strain M.o.H J Bacteriol 112, 527-531 Walsh C (1980) Flavin coenzymes: at the crossroads of biological redox chemistry Acc Chem Res 13, 148-155 de Poorter LM, Geerts WJ & Keltjens JT (2005) Hydrogen concentrations in methane-forming cells probed by the ratios of reduced and oxidized coenzyme F420 Microbiology 151, 1697-1705 Jacobson F & Walsh C (1984) Properties of 7,8-didemethyl-8-hydroxy-5deazaflavins relevant to redox coenzyme function in methanogen metabolism Biochemistry (NY) 23, 979-988 Ahmed FH, Carr PD, Lee BM, Afriat-Jurnou L, Mohamed AE, Hong N, Flanagan J, Taylor MC, Greening C & Jackson CJ (2015) Sequence–Structure– Function Classification of a Catalytically Diverse Oxidoreductase Superfamily in Mycobacteria J Mol Biol 427, 3554-3571 Greening C, Ahmed FH, Mohamed AE, Lee BM, Pandey G, Warden AC, Scott C, Oakeshott JG, Taylor MC & Jackson CJ (2016) Physiology, Biochemistry, and Applications of F420- and Fo-Dependent Redox Reactions Microbiol Mol Biol Rev 80, 451-493 Selengut JD & Haft DH (2010) Unexpected abundance of coenzyme F420dependent enzymes in Mycobacterium tuberculosis and other actinobacteria J Bacteriol 192, 5788-5798 Taylor M, Scott C & Grogan G (2013) F420-dependent enzymes-potential for applications in biotechnology Trends Biotechnol 31, 63-64 19 Matsumoto M, Hashizume H, Tomishige T, Kawasaki M, Tsubouchi H, Sasaki H, Shimokawa Y & Komatsu M (2006) OPC-67683, a nitro-dihydroimidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice PLoS Med 3, e466 10 Stover CK, Warrener P, VanDevanter DR, Sherman DR, Arain TM, Langhorne MH, Anderson SW, Towell JA, Yuan Y & McMurray DN (2000) A small-molecule nitroimidazopyran drug candidate for the treatment of tuberculosis Nature 405, 962-966 11 Nathan C (2008) Microbiology An antibiotic mimics immunity Science 322, 1337-1338 12 Taylor MC, Jackson CJ, Tattersall DB, French N, Peat TS, Newman J, Briggs LJ, Lapalikar GV, Campbell PM & Scott C (2010) Identification and characterization of two families of F420H2-dependent reductases from Mycobacteria that catalyse aflatoxin degradation Mol Microbiol 78, 561-575 13 Lapalikar GV, Taylor MC, Warden AC, Scott C, Russell RJ & Oakeshott JG (2012) F420H2-dependent degradation of aflatoxin and other furanocoumarins is widespread throughout the Actinomycetales PLoS One 7, e30114 14 Lapalikar GV, Taylor MC, Warden AC, Onagi H, Hennessy JE, Mulder RJ, Scott C, Brown SE, Russell RJ & Easton CJ (2012) Cofactor promiscuity among F420-dependent reductases enables them to catalyse both oxidation and reduction of the same substrate Catalysis Science & Technology 2, 1560-1567 15 Coats JH, Li GP, Kuo MS & Yurek DA (1989) Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis J Antibiot (Tokyo) 42, 472-474 16 Li W, Chou S, Khullar A & Gerratana B (2009) Cloning and characterization of the biosynthetic gene cluster for tomaymycin, an SJG-136 monomeric analog Appl Environ Microbiol 75, 2958-2963 20 17 Li W, Khullar A, Chou S, Sacramo A & Gerratana B (2009) Biosynthesis of sibiromycin, a potent antitumor antibiotic Appl Environ Microbiol 75, 28692878 18 Schrittwieser JH, Velikogne S & Kroutil W (2015) Biocatalytic imine reduction and reductive amination of ketones Advanced Synthesis & Catalysis 357, 1655-1685 19 Isabelle D, Simpson DR & Daniels L (2002) Large-scale production of coenzyme F420-5,6 by using Mycobacterium smegmatis Appl Environ Microbiol 68, 5750-5755 20 Bashiri G, Rehan AM, Greenwood DR, Dickson JM & Baker EN (2010) Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis PLoS One 5, e15803 21 Eirich LD, Vogels GD & Wolfe RS (1978) Proposed structure for coenzyme F420 from Methanobacterium Biochemistry (N Y ) 17, 4583-4593 22 Purwantini E, Mukhopadhyay B, Spencer RW & Daniels L (1992) Effect of temperature on the spectral properties of coenzyme F420 and related compounds Anal Biochem 205, 342-350 23 Ashby KD, Casey TA, Rasmussen MA & Petrich JW (2001) Steady-state and time-resolved spectroscopy of F420 extracted from methanogen cells and its utility as a marker for fecal contamination J Agric Food Chem 49, 1123-1127 21 ... 11 3 .2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F 420 TỪ TẾ BÀO M SMEGMATIS 11 3 .2. 1 RỬA CẮN TẾ BÀO 11 i 3 .2. 2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F 420 11 3.3 TINH CHẾ COFACTOR F 420 TỪ DỊCH CHIẾT TẾ... KHỐI 2. 2 .2 CHIẾT XUẤT COFACTOR F 420 TỪ TẾ BÀO M SMEGMATIS 2. 2.3 TINH CHẾ COFACTOR F 420 TỪ DỊCH CHIẾT TẾ BÀO 2. 2.4 XÁC ĐỊNH VÀ TÍNH TỐN NỒNG ĐỘ COFACTOR F 420 BẰNG PHƯƠNG PHÁP... .2 1.1 DEAZAFLAVIN COFACTOR F 420 VÀ CÁC ENZYM PHỤ THUỘC F 420 .2 1 .2 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP F 420 CHƯƠNG – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU