Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế Trờng đại học Dợc hà nội Chử Thị Thanh Huyền Nghiên cứu định lợng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao luận văn thạc sỹ dợc học Hà nội 2012 Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế Trờng đại học Dợc hà nội Chử Thị Thanh Huyền Nghiên cứu định lợng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao luận văn thạc sỹ dợc học Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất mã số: 60 73 15 Ngời hớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Hà nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Huy Văn, ThS. Lâm Thị Bích Hồng, DS. Nguyễn Thị Vân Anh – cán bộ Công ty cổ phần Traphaco đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, Bộ môn Hóa phân tích – độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 24 tháng 9 năm 2012 Học viên Chử Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG , BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG І: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây đinh lăng và các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật 3 1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 3 1.1.3. Thành phần hóa học 4 1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của đinh lăng 4 1.1.5. Các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 5 1.2. Tình hình tiêu chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm đông dược ở Việt Nam và thế giới 6 1.2.1. Về dược điển Việt Nam 6 1.2.2. So sánh với dược điển của một số quốc gia khác trên thế giới 8 1.2.3. Xu hướng nghiên cứu dược liệu và chế phẩm đông dược gần đây tại Việt Nam 8 1.3. Tổng quan nhóm saponin và acid oleanolic 12 1.3.1. Tổng quan về nhóm saponin 12 1.3.2. Tổng quan về acid oleanolic 14 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và thẩm định quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 1.4.2. Thẩm định quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1. Nguyên vật liệu 23 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị 23 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu 24 2.2. Nội dung nghiên cứu 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký 29 3.1.1. Lựa chọn dược liệu 29 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29 3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 35 3.1.4. Quy trình phân tích acid oleanolic trong đinh lăng 40 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 42 3.2.1. Chuẩn bị dung dịch 42 3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký 43 3.2.3. Tính chọn lọc 43 3.2.4. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ 51 3.2.5. Độ lặp lại 53 3.2.6. Độ đúng 54 3.2.7. Độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic 55 3.3. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng 57 3.3.1. Ứng dụng định tính acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng 57 3.3.2. Ứng dụng định lượng 61 Chương IV: BÀN LUẬN 64 4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam 64 4.2. Về quy trình xử lý mẫu 67 4.3. Phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng 68 4.4. Bàn luận về kết quả định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng khác nhau 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 A. Kết luận 71 B. Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AR: Thuốc thử dùng trong phân tích (Analysis Reagent) BuOH: Butanol DAD: Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd: Dung dịch EtOH: Ethanol FLD: Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) GC: Sắc ký khí (Gas chromatography) GC – MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography – Mass spectrometry) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) HPLC – MS/MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High performance liquid chromatography – Mass spectrometry) HPTLC: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer chromatography) IR: Hồng ngoại (Infrared) MeCN: Acetonitril MeOH: Methanol MS: Khối phổ (Mass spectrometry) NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) UV: Tử ngoại (Ultraviolet) λ em : Bước sóng phát xạ (emission) λ ex : Bước sóng kích thích (exitation) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng Nội dung Trang 1.1 Các dược liệu nghiên cứu và phương pháp sử dụng nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn 9 1.2 Hoạt tính sinh học của acid oleanolic trong một số dược liệu 15 1.3 Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 16 3.1 Nồng độ acid oleanolic thu được từ các quy trình xử lý mẫu khác nhau 31 3.2 Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi nồng độ acid thủy phân 32 3.3 Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi thời gian chiết và thủy phân 33 3.4 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 42 3.5 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 43 3.6 Điều kiện khối phổ 47 3.7 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic 52 3.8 Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu bột dược liệu 53 3.9 Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu cao khô dược liệu 53 3.10 Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu bột dược liệu 54 3.11 Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu cao khô dược liệu 55 3.12 Kết quả độ ổn định của mẫu acid oleanolic 56 3.13 Thời gian lưu và thời gian lưu tương đối của các pic lựa chọn 58 3.14 Bảng định tính các mẫu dược liệu đinh lăng dựa trên thời gian lưu tương đối của cụm 6 pic so với pic acid oleanolic 59 3.15 Hàm lượng acid oleanolic trong một số mẫu dược liêu đinh lăng 62 3.16 Hàm lượng acid oleanolic trong một số mẫu cao khô đinh lăng 63 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết acid oleanolic 34 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động MeOH: H 2 O (95:5) 35 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động MeCN: H 3 PO 4 0,1% có tỷ lệ khác nhau 36 3.4 Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H 3 PO 4 0,1% (70:30) 37 3.5 Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H 3 PO 4 0,1% (80:20) 37 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với tốc độ dòng 0,8 ml/phút 39 3.7 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu đinh lăng 41 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá tính chọn lọc) 44 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic nồng độ 5 µg/ml 44 3.10 Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng 45 3.11 Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng 45 3.12 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic phân tích bằng LC – MS/MS 48 3.13 Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS 49 3.14 Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS 50 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng phân tích bằng LC – MS/MS 51 3.16 Sắc ký đồ các mẫu acid oleanolic chuẩn nồng độ 5 - 35 µg/ml 52 3.17 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic 52 3.18 Sắc ký đồ một số mẫu đinh lăng 58 3.19 Sắc ký đồ HPLC dược liệu ngưu tất 60 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đinh lăng là một cây thuốc đã được đưa vào dược điển Việt Nam, có tác dụng bổ ngũ tạng, tiêu thực, lợi sữa… Đây là một vị dược liệu có mặt trong nhiều bài thuốc Đông y để chữa mệt mỏi, sốt lâu ngày, sưng vú, mẩn ngứa do dị ứng, liệt dương, sốt rét…[1]. Theo GS. Ngô Ứng Long, đinh lăng có nhiều tác dụng giống nhân sâm, đặc biệt là tác dụng tăng lực, tăng sức đề kháng, tăng khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi [14]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đinh lăng được thực hiện nhiều vào những năm 70-90 với một các công trình nghiên cứu của Ngô Ứng Long [15], Nguyễn Khắc Viện [21], Nguyễn Thới Nhâm [11] với các nghiên cứu sâu về tác dụng bổ chung, tác dụng tăng lực, tác dụng sinh thích nghi, tác dụng trên tim mạch, tiết niệu, hệ thống máu, hệ thần kinh trung ương, hoạt động sinh dục và hệ thống enzym. Giai đoạn những năm 90 các nghiên cứu về thành phần hoá học ở mức độ cao hơn đã được tiến hành, đã xác định cấu trúc phân tử của các hoạt chất bằng các thiết bị phân tích hiện đại như UV, IR, NMR [20], [29], các nghiên cứu này đều cho thấy trong đinh lăng có chứa các saponin triterpenoid với một genin đã được xác định là acid oleanolic. Trong những năm gần đây, cây đinh lăng cũng trở thành nguồn nguyên liệu được đưa vào sản xuất thuốc Đông dược với sự ra đời của nhóm các sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não. Xã hội ngày càng phát triển, sức ép về công việc tăng lên, nhu cầu về thuốc bổ thần kinh, tăng tuần hoàn não, đặc biệt thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng tăng. Sự phát triển của nhóm thuốc Đông dược nói chung và các chế phẩm có chứa đinh lăng nói riêng trên thị trường Việt Nam đã đặt ra yêu cầu cấp thiết về đảm bảo chất lượng thuốc. Trong điều kiện, xu hướng 2 trên thế giới hiện nay và theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới về nghiên cứu thuốc từ dược liệu, ngoài các yếu tố như hiệu quả lâm sàng, độ an toàn, nghiên cứu về cơ chế tác dụng, cần phải có các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu một cách khoa học và đầy đủ. Tiêu chuẩn hóa sản phẩm với các tiêu chí rõ ràng, kiểm soát được các thành phần hoạt chất cụ thể (định tính, định lượng) là một trong những điều kiện tiên quyết để sản phẩm có thể hội nhập vào thị trường thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây về đinh lăng chủ yếu mới chỉ đưa ra các kết quả nghiên cứu về tác dụng dược lý mà chưa đề cập đến việc kiểm soát chất lượng dược liệu hoặc đi sâu vào nghiên cứu thành phần hóa học, cấu trúc phân tử mà chưa đưa ra phương pháp định tính, định lượng cụ thể. Trong khi đó, các nghiên cứu trước đây đã cho thấy trong đinh lăng chứa thành phần hoạt chất chính là saponin trong đó có một sapogenin đã được xác định là acid oleanolic, do đó acid oleanolic có thể được coi là “dấu vân tay” của dược liệu đinh lăng. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn acid oleanolic là đối tượng và thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng (dược liệu và cao) bằng phương pháp HPLC. 2. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng (dược liệu và cao). [...]... (Araliaceae) Bảo vệ gan [35] Carissa macrocarpa (Apocynaceae) Kháng khuẩn và chống bám dính 1.3.2.4 Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 15 Bảng 1.3 – Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tài liệu Mẫu thử [43] Bột quả cây Macrocarpium officinalis [46] Vi nhũ tương [45] Lá cây Mã đề (Plantago major) [26]... pháp hiện đại như HPLC, HPTLC trong định tính, định lượng dược liệu là một xu hướng nghiên cứu mới trong giai đoạn hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà ở cả các nước khác trên thế giới Do đó, nhằm nâng cao khả năng kiểm soát chất lượng dược liệu đinh lăng, chúng tôi dự định tiến hành xây dựng phương pháp định tính, định lượng dược liệu đinh lăng sử dụng chất đối chiếu là acid oleanolic để góp phần xây dựng... mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký 2.3.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong đinh lăng như nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Ánh Tuyết [20], Võ Duy Huân [29] đều cho thấy trong đinh lăng có chứa các saponin triterpenoid với một sapogenin đã được xác định là acid oleanolic Vì vậy, để chiết xuất acid oleanolic trong đinh lăng, chúng tôi tiến hành... liệu và cao) một lượng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lượng acid oleanolic có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính được phần trăm tìm lại so với lượng chuẩn thêm vào mẫu thử 2.3.2.5 Độ ổn định của acid oleanolic trong thời gian phân tích Để đánh giá độ ổn định của acid oleanolic trong quá... hóa học Trong đinh lăng đã tìm thấy có các saponin, alcaloid, glucosid,, flavonoid, tanin, các vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C) và 20 acid amin trong đó có các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, tryptophan, cystein) [1], [10], [14] Một số tài liệu nghiên cứu về saponin trong đinh lăng cho thấy trong đinh lăng có chứa saponin trong đó có một sapogenin đã được xác định là acid oleanolic. .. Bình định mức, pipet, ống đong,… 23 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu Dược liệu đinh lăng được thu hái từ các vùng khác nhau của ba tỉnh Hòa Bình (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu) và Đắcknông (3 mẫu) và cao khô đinh lăng thu hái ở Hòa Bình (1 mẫu), Nam Định (5 mẫu) được bào chế bằng phương pháp phun sấy do Công ty Traphaco cung cấp 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng quy trình định lượng acid oleanolic trong. .. oleanolic trong dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng bằng phương pháp HPLC  Quy trình chiết tách: Khảo sát một số quy trình chiết tách sapogenin để từ đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết tách acid oleanolic phù hợp với yêu cầu phân tích  Lựa chọn điều kiện sắc ký: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích acid oleanolic có trong mẫu như: - Cột sắc ký - Thành phần, tỷ lệ,... mẫu 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích Thẩm định phương pháp phân tích đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, độ ổn định của dung dịch chuẩn 2.2.3 Ứng dụng Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng... của acid oleanolic trong quá trình định lượng, chúng tôi tiến hành khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic trong điều kiện sắc ký đã lựa chọn Xác định độ ổn định bằng cách pha một dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Cứ sau 4 giờ thì tiêm lặp lại dung dịch một lần, tiến hành phân tích trong 24 giờ Xác định sự thay đổi nồng độ acid oleanolic theo thời gian 2.3.3 Ứng... âm để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với đối tượng nghiên cứu là dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng 2.3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng acid oleanolic trong đinh lăng Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện như sau - Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo của các hãng khác nhau; - Pha động: Qua tham khảo tài . lượng acid oleanolic trong đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với 2 mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng (dược liệu và cao) . Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và thẩm định quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 1.4.2. Thẩm định quy trình. ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic 55 3.3. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng 57 3.3.1. Ứng dụng định tính acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng