Chuẩn bị cỏc mẫu sau: 1. Mẫu trắng
2. Mẫu acid oleanolic chuẩn pha trong MeOH 3. Mẫu thử
So sỏnh cỏc pic trờn cỏc sắc ký đồ thu được từ việc phõn tớch cỏc mẫu trờn.
2.3.2.2. Tớnh tuyến tớnh và khoảng nồng độ
Chuẩn bị 1 dóy dung dịch chuẩn acid oleanolic pha trong MeOH cú nồng độ như sau: 5 - 10 - 20 - 25 - 35 μg/ml.
Tiến hành phõn tớch cỏc mẫu. Xõy dựng phương trỡnh hồi quy và xỏc định hệ số tương quan r.
2.3.2.3. Độ lặp lại
Tiến hành phõn tớch 1 mẫu thử 5 lần song song (xử lý mẫu, sắc ký), xỏc định kết quả định lượng theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong cựng điều kiện. Xỏc định độ lặp lại bằng cỏch tớnh độ lệch chuẩn tương đối giữa giỏ trị của cỏc lần định lượng.
2.3.2.4. Độ đỳng
Độ đỳng được xỏc định bằng phương phỏp thờm chuẩn vào mẫu thử sao cho nồng độ acid oleanolic vẫn nằm trong khoảng tuyến tớnh đó khảo sỏt.
Tiến hành:
Chuẩn bị cỏc dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn cú nồng độ thớch hợp - Dung dịch thử
28
- Dung dịch thử thờm chuẩn: Thờm vào mẫu thử (dược liệu và cao)
một lượng chớnh xỏc chất chuẩn bằng khoảng 40% lượng acid oleanolic cú trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký
theo quy trỡnh đó xõy dựng
Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thờm chuẩn sẽ tớnh được phần trăm tỡm lại so với lượng chuẩn thờm vào mẫu thử.
2.3.2.5. Độ ổn định của acid oleanolic trong thời gian phõn tớch
Để đỏnh giỏ độ ổn định của acid oleanolic trong quỏ trỡnh định lượng, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic trong điều kiện sắc ký đó lựa chọn.
Xỏc định độ ổn định bằng cỏch pha một dung dịch chuẩn cú nồng độ nằm trong khoảng tuyến tớnh. Cứ sau 4 giờ thỡ tiờm lặp lại dung dịch một lần, tiến hành phõn tớch trong 24 giờ. Xỏc định sự thay đổi nồng độ acid oleanolic theo thời gian.
2.3.3. Ứng dụng
Áp dụng phương phỏp đó xõy dựng và thẩm định, tiến hành định tớnh, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu dược liệu và cao khụ đinh lăng, bao gồm: cỏc mẫu dược liệu thu hỏi ở Hũa Bỡnh (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu), Đắcknụng (3 mẫu) và cỏc mẫu cao khụ đinh lăng thu hỏi ở Hũa Bỡnh (1 mẫu), Nam Định (5 mẫu) do Cụng ty Traphaco cung cấp.
2.3.4. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm Microsoft Office Word 2007 để xử lý số liệu và trỡnh bày kết quả.
29
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRèNH XỬ Lí MẪU VÀ LỰA CHỌN
ĐIỀU KIỆN SẮC Kí
3.1.1. Lựa chọn dược liệu
Dược liệu đinh lăng do Cụng ty Traphaco cung cấp cho nghiờn cứu, được thu mua ở cỏc vựng trồng dược liệu khỏc nhau như Hũa Bỡnh, Nam Định, Đắcknụng.
Trước tiờn, dược liệu được xỏc định đỳng tờn khoa học là
Polyscias fruticosa, họ Nhõn sõm Araliaceae.
Bào chế cao khụ đinh lăng từ dược liệu đinh lăng bằng cụng nghệ sấy phun. Đối tượng nghiờn cứu của đề tài bao gồm dược liệu đinh lăng và cao khụ đinh lăng.
3.1.2. Xõy dựng quy trỡnh xử lý mẫu
Qua tham khảo một số tài liệu [4], [16], [17], [18], [37] chỳng tụi tiến hành khảo sỏt một số quy trỡnh xử lý mẫu như sau.
3.1.2.1. Quy trỡnh 1
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết hồi lưu với 30 ml tetrahydrofuran (THF) để loại chất bộo;
- Chiết hồi lưu với 50 ml EtOH 80%, đõy là loại dung mụi vạn năng cú khả năng hũa tan khụng chọn lọc, cú thể chiết xuất hầu hết cỏc hoạt chất cú trong dược liệu;
- Bay hơi ethanol;
30
- Lắc với BuOH bóo hũa nước (3 lần x 10 ml), để chiết chọn lọc lấy thành phần saponin;
- Thu hồi dung mụi BuOH;
- Dịch nước thu được để nguội, rút từ từ vào khoảng 30 thể tớch ether, để lạnh qua đờm, để thu lấy saponin kết tinh (do saponin khụng tan trong ether); - Rửa tủa saponin thu được với ether;
- Hũa tan tủa saponin thu được trong 10 ml cồn 700 ;
- Thờm 30 ml dung dịch HCl 1N, đun sụi hồi lưu cỏch thủy 2h để thủy phõn saponin thành sapogenin;
- Lắc với CHCl3 (2 lần x 15 ml), để hũa tan sapogenin, cụ trờn cỏch thủy đến cạn (mục đớch giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);
- Hũa tan cắn trong 10 ml MeOH sắc ký, lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiờm sắc ký.
3.1.2.2. Quy trỡnh 2
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu, chiết với MeOH, đõy là loại dung mụi vạn năng cú khả năng hũa tan khụng chọn lọc, cú thể chiết xuất hầu hết cỏc hoạt chất cú trong dược liệu;
- Thờm 20 ml dung dịch HCl đặc, đun sụi hồi lưu cỏch thủy 2h, với mục đớch thủy phõn để cắt bỏ phần đường trong phõn tử saponin;
- Để lạnh để tủa hết phần sapogenin;
- Hũa tan sapogenin trong cắn trong 25 ml CHCl3, cụ trờn cỏch thủy đến cạn (mục đớch giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);
- Hũa tan cắn (sapogenin) trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 àm được dung dịch tiờm sắc ký.
31
3.1.2.3. Quy trỡnh 3
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết siờu õm với MeOH (3 lần x 20 ml);
- Cụ dịch lọc trờn cỏch thủy đến cạn;
- Hũa tan cắn trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 àm được dung dịch tiờm sắc ký.
Lựa chọn quy trỡnh mà khi phõn tớch bằng HPLC cho pic acid oleanolic tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp trong mẫu và cho kết quả nồng độ acid oleanolic (àg/ml) cao nhất với cựng một lượng mẫu thử. Kết quả nồng độ acid oleanolic thu được từ 3 quy trỡnh xử lý mẫu trờn được trỡnh bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 – Nồng độ acid oleanolic thu được từ cỏc quy trỡnh xử lý mẫu khỏc nhau
Khối lượng dược liệu Quy trỡnh Nồng độ acid oleanolic thu
được (àg/ml)
2,5 gam bột dược liệu
1 17,15
2 18,00
3 8,98
1,25 gam cao khụ dược liệu
1 23,11
2 23,40
3 10,47
Nhận xột:
Mẫu thử của cả 3 quy trỡnh 1, 2, 3 khi đem phõn tớch bằng phương phỏp HPLC đều cho pic acid oleanlic tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp.
Quy trỡnh 3 cho kết quả nồng độ acid oleanolic thấp hơn nhiều so với hai quy trỡnh 1 và 2. Nồng độ acid oleanolic thu được từ hai quy trỡnh 1 và 2 tương đương nhau. Tuy nhiờn quy trỡnh 1 sử dụng nhiều dung mụi hữu cơ nờn khụng
32
kinh tế, độc hại do đú chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh 2 và tiếp tục khảo sỏt thay đổi cỏc điều kiện chiết xuất như: Nồng độ acid thủy phõn saponin, thời gian
chiết, thời gian thủy phõn.
Khảo sỏt nồng độ dung dịch HCl sử dụng:
Mục đớch sử dụng dung dịch HCl là để thủy phõn saponin thu được thành sapogenin (cắt bỏ phần đường) nhằm tạo thuận lợi cho quỏ trỡnh tinh chế trong quy trỡnh xử lý mẫu, đồng thời thuận lợi cho quỏ trỡnh phõn tớch bằng HPLC.
Chỳng tụi khảo sỏt 2 mức nồng độ acid thủy phõn: dung dịch HCl đặc và dung dịch HCl ẵ (pha loóng 2 lần từ HCl đặc). Kết quả được trỡnh bày ở
bảng 3.2.
Bảng 3.2 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi nồng độ acid thủy phõn
Khối lượng dược liệu Nồng độ acid sử dụng Nồng độ acid oleanolic thu
được (àg/ml)
2,5 gam bột dược liệu HCl đặc 17,30
HCl ẵ 34,20
1,25 gam cao khụ dược liệu HCl đặc 23,21
HCl ẵ 40,27
Kết quả thu được ở trờn cho thấy sử dụng HCl ẵ cho hiệu quả tốt hơn (đối với cả bột dược liệu và cao khụ dược liệu), do đú chỳng tụi sử dụng chiết bằng MeOH rồi acid húa bằng HCl ẵ cho cỏc khảo sỏt tiếp theo.
Khảo sỏt sự thay đổi thời gian chiết với methanol và thủy phõn với dung
dịch HCl ẵ
Lựa chọn quy trỡnh phõn tớch thu được giỏ trị nồng độ acid oleanolic cao nhất (trờn cựng một mẫu thử với khối lượng như nhau) trong thời gian ngắn nhất.
33
Khảo sỏt thời gian chiết với Methanol: 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h; 3,5h và cố định thời gian thủy phõn với HCl là 2h. Kết quả cho thấy thời gian chiết với methanol là 3h cho đỏp ứng tương tự như 3,5h. Do đú, chỳng tụi lựa chọn thời gian chiết methanol là 3h cho cỏc khảo sỏt tiếp theo.
Khảo sỏt thời gian thủy phõn bằng dung dịch HCl ẵ: Cố định thời gian chiết với methanol 3h và thay đổi thời gian thủy phõn với HCl là 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h; 3,5h. Kết quả cho thấy thời gian thủy phõn với HCl là 3h cho đỏp ứng tương tự như 3,5h.
Do đú, chỳng tụi lựa chọn chiết mẫu thử bằng methanol trong 3h sau đú thủy phõn bằng dung dịch HCl ẵ trong 3h.
Kết quả cụ thể được trỡnh bày ở bảng 3.3 và hỡnh 3.1.
Bảng 3.3 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi thời gian chiết và thủy phõn
Bột dược liệu Cao dược liệu
Cố định thời gian
thủy phõn HCl (2h) chiết methanol (3h) Cố định thời gian thủy phõn HCl (2h) Cố định thời gian chiết methanol (3h) Cố định thời gian
Thời gian chiết (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian thủy phõn (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian chiết (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian thủy phõn (giờ) Nồng độ (àg/ml) 1,0 18,62 1,0 26,24 1,0 20,46 1,0 33,43 1,5 27,89 1,5 34,23 1,5 32,70 1,5 45,21 2,0 34,24 2,0 43,34 2,0 40,24 2,0 52,09 2,5 39,45 2,5 49,80 2,5 47,90 2,5 58,80 3,0 43,40 3,0 54,04 3,0 52,17 3,0 61,00 3,5 43,45 3,5 54,10 3,5 52,16 3,5 61,18
34
Hỡnh 3.1 – Kết quả khảo sỏt thời gian chiết acid oleanolic
Trong đú:
A: cố định thời gian thủy phõn 2h, thay đổi thời gian chiết trờn mẫu bột DL
B: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phõn trờn mẫu bột DL
C: cố định thời gian thủy phõn 2h, thay đổi thời gian chiết trờn mẫu cao DL
D: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phõn trờn mẫu cao DL
(DL: dược liệu) Từ cỏc kết quả khảo sỏt thu được, chỳng tụi lựa chọn được cỏc điều kiện xử lý mẫu như sau:
Lựa chọn quy trỡnh 2 để xử lý mẫu
Sử dụng dung dịch HCl ẵ để thủy phõn saponin thành sapogenin
Thời gian chiết với MeOH là 3h và thời gian thủy phõn với dung dịch HCl ẵ là 3h 0 10 20 30 40 50 60 70 A B C D N ồn g độ ac id ol ean ol ic (à g/ m l)
Sự thay đổi nồng độ acid oleanolic khi thay đổi thời gian chiết xuất
1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ 3,5 giờ
35
3.1.3. Khảo sỏt và lựa chọn điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký: Chỳng tụi tiến hành khảo sỏt trờn cỏc cột:
Cột Inertsil ODS (250 ì 4,6 mm; 5 àm)
Cột Germmini Luna C18 (250 ì 4,6 mm; 5 μm)
Chỳng tụi thấy cột Inertsil ODS (250 ì 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ cột 400 C là phự hợp, cú khả năng tỏch tốt và chọn lọc acid oleanolic trong mẫu phõn tớch.
- Pha động: Khảo sỏt khả năng tỏch acid oleanolic với cỏc hệ pha động sau:
MeOH : H2O (95 : 5)
MeCN : dung dịch H3PO4 0,1% (MeCN 60 – 70 – 80%) Cựng với tốc độ dũng 1,2 ml/phỳt
Kết quả chỳng tụi thu được cỏc sắc ký đồ sau.
Hỡnh 3.2 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động MeOH : H2O (95 : 5)
36 (a) (b) (c)
Hỡnh 3.3 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động MeCN : H3PO4 0,1% cú tỷ lệ khỏc nhau
a) MeCN : H3PO4 0,1% = 60 : 40 b) MeCN : H3PO4 0,1% = 70 : 30 c) MeCN : H3PO4 0,1% = 80 : 20
37
Hỡnh 3.4 – Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN : H3PO4 0,1% (70 : 30)
Hỡnh 3.5 – Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN : H3PO4 0,1% (80 : 20)
38
Nhận xột:
Kết quả cho thấy, pha động MeOH : H2O (95 : 5) (hỡnh 3.2) cho pic acid oleanolic chuẩn cú nhiễu đường nền lớn (do tiến hành đo ở bước súng thấp, mà MeOH cú UV – cut off ở khoảng 210 nm), do đú chỳng tụi khụng lựa chọn hệ dung mụi này làm pha động trong phõn tớch.
Pha động MeCN : H3PO4 0,1% (tỷ lệ MeCN thay đổi từ 60 đến 80%) cho pic acid oleanolic cõn đối, sắc nột (Hỡnh 3.3). Tuy nhiờn, với tỷ lệ MeCN 60%
(Hỡnh 3.3 a) cho pic acid oleanolic cú thời gian lưu quỏ dài (tR = 64 phỳt) do đú
phương phỏp khụng thực sự hiệu quả về mặt thời gian, khụng thớch hợp trong việc ỏp dụng thực tế. Tỷ lệ MeCN 70% (Hỡnh 3.3 b) hoặc MeCN 80%
(Hỡnh 3.3 c) đều cho pic acid oleanolic với thời gian lưu chấp nhận được
(28 phỳt và 14 phỳt tương ứng).
Tuy nhiờn, khi phõn tớch cỏc mẫu thực, với tỷ lệ MeCN 80% cho thời gian phõn tớch tương đối ngắn (khoảng 20 phỳt) song pic acid oleanolic cú thể khụng tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp trong mẫu (Hỡnh 3.5). Hệ dung mụi MeCN : dung dịch H3PO4 0,1% (70 : 30) là cú khả năng tỏch tốt nhất, pic sắc nột, chõn pic gọn, cỏc pic tỏch rời nhau và thời gian phõn tớch hợp lý. Do đú, chỳng tụi lựa chọn hệ dung mụi trờn làm pha động (Hỡnh 3.4).
- Tốc độ dũng: Chỳng tụi khảo sỏt sự thay đổi tốc độ dũng từ 0,8 – 1,6 ml/phỳt.
Kết quả khảo sỏt cho thấy, với tốc độ dũng 0,8 ml/phỳt cho pic acid oleanolic cú thời gian phõn tớch khỏ dài – khoảng 50 phỳt đồng thời chõn
pic doóng. Khi tăng tốc độ dũng lờn 1,2 ml/phỳt, cho thời gian phõn tớch giảm xuống cũn khoảng 35 phỳt đồng thời pic acid oleanolic sắc nột, gọn, tỏch riờng biệt. Tuy nhiờn, khi tăng tốc độ dũng lờn tới 1,6 ml/phỳt, pic acid oleanolic cú
39
khả năng khụng tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp, đồng thời ỏp suất cột lớn. Do đú, chỳng tụi lựa chọn tốc độ dũng 1,2 ml/phỳt vỡ vừa tỏch riờng được chất phõn tớch, vừa cú thời gian phõn tớch hợp lý.
Hỡnh 3.6 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với tốc độ dũng 0,8 ml/phỳt
- Thể tớch tiờm mẫu: Khảo sỏt cỏc thể tớch tiờm mẫu tăng dần. Chỳng tụi nhận thấy: Khi tăng thể tớch tiờm mẫu, đỏp ứng phõn tớch tăng dần, do đú tăng độ chớnh xỏc cho phộp định lượng. Tuy nhiờn, thể tớch tiờm mẫu càng lớn thỡ khả năng gõy nhiễm bẩn cột càng tăng, đặc biệt với đối tượng phõn tớch là cỏc mẫu dược liệu cú rất nhiều tạp chất. Do đú, chỳng tụi lựa chọn thể tớch tiờm mẫu nhỏ nhất mà vẫn đảm bảo cho đỏp ứng pic phự hợp, cho độ chớnh xỏc đảm bảo là 10 àl.
- Detector: Qua tham khảo tài liệu, để định lượng acid oleanolic cú thể sử dụng cỏc loại detector UV, FLD, MS. Với điều kiện trang thiết bị hiện cú là mỏy HPLC với detector UV, FLD; trong khi đú, việc sử dụng detector FLD yờu cầu
40
quỏ trỡnh dẫn chất húa trước cột phức tạp, gõy nhiều sai số. Do đú, chỳng tụi lựa chọn sử dụng detector UV. Ngoài ra, acid oleanolic là chất khụng chứa cỏc nhúm mang màu, hấp thụ UV ở bước súng thấp, do đú chỳng tụi đó lựa chọn sử dụng detector UV với bước súng phỏt hiện là 208 nm.
3.1.4. Quy trỡnh phõn tớch acid oleanolic trong đinh lăng
Từ kết quả thực nghiệm, chỳng tụi đó lựa chọn được quy trỡnh xử lý mẫu và điều kiện sắc ký cú thể tỏch được acid oleanolic ra khỏi cỏc pic tạp cú trong cỏc mẫu dược liệu và cao khụ đinh lăng như sau:
Quy trỡnh xử lý mẫu
41
+ 40 ml MeOH
+ Đun sụi hồi lưu cỏch thủy 3h + Lọc
Hỡnh 3.7 – Sơ đồ quy trỡnh xử lý mẫu đinh lăng
2,5g bột dược liệu hoặc 1,25g cao khụ dược liệu
Dịch lọc
Cắn
Dịch lọc
Cắn
+ 40 ml dung dịch HCl ẵ + Đun sụi hồi lưu cỏch thủy 3h + Làm lạnh, lọc, rửa tủa bằng
nước đến hết acid
+ Sấy khụ ở 600C khoảng 15 phỳt + Thờm 25 ml Cloroform
+ Đun cỏch thủy khoảng 10 phỳt + Lọc Cụ cỏch thủy đến cạn Dịch tiờm sắc ký + Định mức trong 10 ml MeOH + Lọc qua màng lọc 0,45 μm
42
Điều kiện sắc ký
Cột: Inertsil ODS (250 ì 4,6 mm; 5μm), bảo vệ cột Inertsil ODS (10 ì 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ cột 400
C
Pha động: MeCN : dung dịch H3PO4 0,1% (70 : 30)
Detector UV với λ = 208 nm Tốc độ dũng: 1,2 ml/phỳt Thể tớch tiờm: 10 μl 3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1. Chuẩn bị dung dịch Dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: Cõn chớnh xỏc khoảng 10 mg chất đối chiếu acid oleanolic, hũa tan và định mức trong bỡnh định mức 10 ml bằng MeOH