Qua tham khảo một số tài liệu [4], [16], [17], [18], [37] chỳng tụi tiến hành khảo sỏt một số quy trỡnh xử lý mẫu như sau.
3.1.2.1. Quy trỡnh 1
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết hồi lưu với 30 ml tetrahydrofuran (THF) để loại chất bộo;
- Chiết hồi lưu với 50 ml EtOH 80%, đõy là loại dung mụi vạn năng cú khả năng hũa tan khụng chọn lọc, cú thể chiết xuất hầu hết cỏc hoạt chất cú trong dược liệu;
- Bay hơi ethanol;
30
- Lắc với BuOH bóo hũa nước (3 lần x 10 ml), để chiết chọn lọc lấy thành phần saponin;
- Thu hồi dung mụi BuOH;
- Dịch nước thu được để nguội, rút từ từ vào khoảng 30 thể tớch ether, để lạnh qua đờm, để thu lấy saponin kết tinh (do saponin khụng tan trong ether); - Rửa tủa saponin thu được với ether;
- Hũa tan tủa saponin thu được trong 10 ml cồn 700 ;
- Thờm 30 ml dung dịch HCl 1N, đun sụi hồi lưu cỏch thủy 2h để thủy phõn saponin thành sapogenin;
- Lắc với CHCl3 (2 lần x 15 ml), để hũa tan sapogenin, cụ trờn cỏch thủy đến cạn (mục đớch giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);
- Hũa tan cắn trong 10 ml MeOH sắc ký, lọc qua màng lọc 0,45 àm, tiờm sắc ký.
3.1.2.2. Quy trỡnh 2
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu, chiết với MeOH, đõy là loại dung mụi vạn năng cú khả năng hũa tan khụng chọn lọc, cú thể chiết xuất hầu hết cỏc hoạt chất cú trong dược liệu;
- Thờm 20 ml dung dịch HCl đặc, đun sụi hồi lưu cỏch thủy 2h, với mục đớch thủy phõn để cắt bỏ phần đường trong phõn tử saponin;
- Để lạnh để tủa hết phần sapogenin;
- Hũa tan sapogenin trong cắn trong 25 ml CHCl3, cụ trờn cỏch thủy đến cạn (mục đớch giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);
- Hũa tan cắn (sapogenin) trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 àm được dung dịch tiờm sắc ký.
31
3.1.2.3. Quy trỡnh 3
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết siờu õm với MeOH (3 lần x 20 ml);
- Cụ dịch lọc trờn cỏch thủy đến cạn;
- Hũa tan cắn trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 àm được dung dịch tiờm sắc ký.
Lựa chọn quy trỡnh mà khi phõn tớch bằng HPLC cho pic acid oleanolic tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp trong mẫu và cho kết quả nồng độ acid oleanolic (àg/ml) cao nhất với cựng một lượng mẫu thử. Kết quả nồng độ acid oleanolic thu được từ 3 quy trỡnh xử lý mẫu trờn được trỡnh bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 – Nồng độ acid oleanolic thu được từ cỏc quy trỡnh xử lý mẫu khỏc nhau
Khối lượng dược liệu Quy trỡnh Nồng độ acid oleanolic thu
được (àg/ml)
2,5 gam bột dược liệu
1 17,15
2 18,00
3 8,98
1,25 gam cao khụ dược liệu
1 23,11
2 23,40
3 10,47
Nhận xột:
Mẫu thử của cả 3 quy trỡnh 1, 2, 3 khi đem phõn tớch bằng phương phỏp HPLC đều cho pic acid oleanlic tỏch rời hoàn toàn khỏi cỏc pic tạp.
Quy trỡnh 3 cho kết quả nồng độ acid oleanolic thấp hơn nhiều so với hai quy trỡnh 1 và 2. Nồng độ acid oleanolic thu được từ hai quy trỡnh 1 và 2 tương đương nhau. Tuy nhiờn quy trỡnh 1 sử dụng nhiều dung mụi hữu cơ nờn khụng
32
kinh tế, độc hại do đú chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh 2 và tiếp tục khảo sỏt thay đổi cỏc điều kiện chiết xuất như: Nồng độ acid thủy phõn saponin, thời gian
chiết, thời gian thủy phõn.
Khảo sỏt nồng độ dung dịch HCl sử dụng:
Mục đớch sử dụng dung dịch HCl là để thủy phõn saponin thu được thành sapogenin (cắt bỏ phần đường) nhằm tạo thuận lợi cho quỏ trỡnh tinh chế trong quy trỡnh xử lý mẫu, đồng thời thuận lợi cho quỏ trỡnh phõn tớch bằng HPLC.
Chỳng tụi khảo sỏt 2 mức nồng độ acid thủy phõn: dung dịch HCl đặc và dung dịch HCl ẵ (pha loóng 2 lần từ HCl đặc). Kết quả được trỡnh bày ở
bảng 3.2.
Bảng 3.2 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi nồng độ acid thủy phõn
Khối lượng dược liệu Nồng độ acid sử dụng Nồng độ acid oleanolic thu
được (àg/ml)
2,5 gam bột dược liệu HCl đặc 17,30
HCl ẵ 34,20
1,25 gam cao khụ dược liệu HCl đặc 23,21
HCl ẵ 40,27
Kết quả thu được ở trờn cho thấy sử dụng HCl ẵ cho hiệu quả tốt hơn (đối với cả bột dược liệu và cao khụ dược liệu), do đú chỳng tụi sử dụng chiết bằng MeOH rồi acid húa bằng HCl ẵ cho cỏc khảo sỏt tiếp theo.
Khảo sỏt sự thay đổi thời gian chiết với methanol và thủy phõn với dung
dịch HCl ẵ
Lựa chọn quy trỡnh phõn tớch thu được giỏ trị nồng độ acid oleanolic cao nhất (trờn cựng một mẫu thử với khối lượng như nhau) trong thời gian ngắn nhất.
33
Khảo sỏt thời gian chiết với Methanol: 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h; 3,5h và cố định thời gian thủy phõn với HCl là 2h. Kết quả cho thấy thời gian chiết với methanol là 3h cho đỏp ứng tương tự như 3,5h. Do đú, chỳng tụi lựa chọn thời gian chiết methanol là 3h cho cỏc khảo sỏt tiếp theo.
Khảo sỏt thời gian thủy phõn bằng dung dịch HCl ẵ: Cố định thời gian chiết với methanol 3h và thay đổi thời gian thủy phõn với HCl là 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h; 3,5h. Kết quả cho thấy thời gian thủy phõn với HCl là 3h cho đỏp ứng tương tự như 3,5h.
Do đú, chỳng tụi lựa chọn chiết mẫu thử bằng methanol trong 3h sau đú thủy phõn bằng dung dịch HCl ẵ trong 3h.
Kết quả cụ thể được trỡnh bày ở bảng 3.3 và hỡnh 3.1.
Bảng 3.3 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi thời gian chiết và thủy phõn
Bột dược liệu Cao dược liệu
Cố định thời gian
thủy phõn HCl (2h) chiết methanol (3h) Cố định thời gian thủy phõn HCl (2h) Cố định thời gian chiết methanol (3h) Cố định thời gian
Thời gian chiết (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian thủy phõn (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian chiết (giờ) Nồng độ (àg/ml) Thời gian thủy phõn (giờ) Nồng độ (àg/ml) 1,0 18,62 1,0 26,24 1,0 20,46 1,0 33,43 1,5 27,89 1,5 34,23 1,5 32,70 1,5 45,21 2,0 34,24 2,0 43,34 2,0 40,24 2,0 52,09 2,5 39,45 2,5 49,80 2,5 47,90 2,5 58,80 3,0 43,40 3,0 54,04 3,0 52,17 3,0 61,00 3,5 43,45 3,5 54,10 3,5 52,16 3,5 61,18
34
Hỡnh 3.1 – Kết quả khảo sỏt thời gian chiết acid oleanolic
Trong đú:
A: cố định thời gian thủy phõn 2h, thay đổi thời gian chiết trờn mẫu bột DL
B: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phõn trờn mẫu bột DL
C: cố định thời gian thủy phõn 2h, thay đổi thời gian chiết trờn mẫu cao DL
D: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phõn trờn mẫu cao DL
(DL: dược liệu) Từ cỏc kết quả khảo sỏt thu được, chỳng tụi lựa chọn được cỏc điều kiện xử lý mẫu như sau:
Lựa chọn quy trỡnh 2 để xử lý mẫu
Sử dụng dung dịch HCl ẵ để thủy phõn saponin thành sapogenin
Thời gian chiết với MeOH là 3h và thời gian thủy phõn với dung dịch HCl ẵ là 3h 0 10 20 30 40 50 60 70 A B C D N ồn g độ ac id ol ean ol ic (à g/ m l)
Sự thay đổi nồng độ acid oleanolic khi thay đổi thời gian chiết xuất
1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ 3,5 giờ
35