Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Nghiên cứu định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và hoặc acid succinic trong thành phẩm viên nén artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trang 1

Tran Thi Lan Huong

NGHIEN CUU BINH LUONG ARTESUNAT

KHI CO MAT DIHYDRO ARTEMISININ VA/HOAC ACID SUCCINIC

TRONG THANH PHAM VIEN NEN ARTESUNAT 50MG BANG PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - độc chat

Trang 2

LO CAM ON

?ruóc hél, lôi xi bảy tổ lòng biết ơn ơn sâu sắc nÄất tới DCẻ 7Š Trân Đúc liệu nguci thdy dé tan tinh chỉ bảo, hướng dẫn, giúp dé tôi hoàn thành luận văn nảy

Nhân cÍp nảy, củo tơi được bảy tô lòng biết ơn chân thành đÊên:

G6 1® Trấn Tử Án, Thưởng bộ mơn liố phân tích, Trường Dai hoc Dược

He Nou

PG&.TS lé Thành Dhước, Trưởng bộ mén Hoé vd ca, Trtang Dai hoc Ditoe Hi

Nội

7ö Trân Viết lùng, Trưởng phòng Dâo tạo, Trưởng Dụi học Dược lià Nội

D8 Duong Viel Mau, Phong Déo tac sau dat hoc, Truong Dai hoc Duce Ha Noi

Téi xin chan thinh cém on Ban Giản hiệu nhà trường tập thể eda bộ phòng Đảo

tạo - Trường Dụ! học Dược Hà NỘi đã quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi cđo tơi

trong suốt quả trinh học tập và ngÌiÊn cứu

Trong quá irinh thực hiện và hoàn thành cÊ ldj tôi đã nhân được sự stip dé nhiél

tình của các thây, cô và kỹ thuật viên trong Bộ môn Hod duoc, BG mén Hot vd cd, BS mơn liố phân tích, tập thể cán bộ phong Dio tao sau dai hoc, thư viện Trưởng Ly học Dược /là NỘI Tôi xía chân thành bảy tô lồng biết ơn aâu sắc cÕï vớï tất ca su giúp đố quí báu nảy

Cố cùng xin cam on gla dinh và bạn bẻ đã liôn động viên, khích Ê, giúp đỠ tô

tận tí

Trang 4

DANH MỤC CÁC BẢNG mẫu thuốc số 4

SIT| Ký hiệu Nộidug | Trang

| : Day dung dich khao sát khoảng tuyến tính của

3 | Bang 3.2 - 4l |

| phương pháp

4, | Bảng 3.3 ' Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Artesunat | 4I | — 5 | Bảng 3.4 | Kết quả đánh giá tính chính xác của phương pháp | 43

6, | Bang 3.5 | Kết quả đánh giá tính dúng của phương pháp | 44

1 Độ phân giải giữa céc pic Acid succinic, Artesunat |

7 | Bang 3.6 | | 49 |

| và DHA |

đó, Một số mâu thuốc viên nén Artesunat 50mg tiến |

S$ | Bảng 3.7 | | 32 |

| hanh dinh luong | |

an Kết quả đánh giá độ đồng đều về khối lượng viên -

9 | Bang3.8 | ,„ - N | 33

| của mâu thuốc số | | |

| của mâu thuốc số 3 |

Trang 5

tích pic và nồng độ dung dịch Artesunat

Sự tương quan giữa lượng Artesunat ban đầu và

3 | Hình 3.3 45

lượng tìm lại

trong mau tu lao |

9 | Hinh 3.9 | Sac ky đồ dung dịch định lượng của mâu thuốc số! 61

10 | Hinh 3.10 ¡ Sắc ký đồ dung địch định lượng của mẫu thuốc số 2|_ 62 II ¡ Hình 3.11 | Sắc ký đồ dung dịch định lượng của mẫu thuốc số 3'_ 62

Trang 6

MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục [anh mục các chữ viết tắt [XJanh mục các bảng Danh mục các hình DAT VAN DE

Chương 1 TONG QUAN 1.1 Cay Thanh hao hoa vang

1.2 Dai cuong vé Artcsunat

I.3 Một số phương pháp định lượng Artesunat

|.4 Các phương pháp định lượng Artcsunat trong viên nén

I.5 Nhận xét và lựa chọn

|.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nang cao

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT- THIẾT BỊ

NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Dung cu, hoa chat

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

t~ 3.1 Phuong phap nghiên cứu

2 3.2 Nội dung nghiên cứu

.3.3 Phương pháp xử lý và dánh giá kết quả

Chương 3 THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Trang 7

3,1,3 Điều kiện sác ký đã chọn

3.2 Lựa chọn dung môi để hoà tan và chiết xuất Artesunat hoàn

toàn ra khỏi viên nén Artesunat

.3 Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng Artcsunalt trong

"12

viên nén Artesunat 50mg bằng phương pháp HPLC

3.3.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

3.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng

3.3.3 Đánh giá phương pháp định lượng

3.4 Kết quả

3.5 Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Artcsunat trong viên nén Artcsunat 50mg của một số cơ sở sản xuất

Trang 8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đốt rét là một bệnh xã hội do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium gây ra

Bệnh phát triển mạnh ở những vùng có khí hậu nóng, ẩm, mưa nhiều như châu

A, chau Phi và châu Mỹ La tinh Tác nhân truyền bệnh là muỗi, vì thế nếu

không phòng ngừa và ngăn chặn kịp thời, bệnh có thể lan tràn thành dịch rất

nguy hiểm Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì số

người mắc bệnh sốt rét hàng năm có khoảng từ 100 đến 200 triệu người, trong đó có từ I đến 1,5 triệu ca tử vong[22],[36] Theo Bộ Y tế, ở Việt Nam, hàng

năm có trên l triệu ca sốt rét, trong đó có hơn 30 nghìn ca là sốt rét ác tính

[25] Việc kiểm soát sốt rét rất khó khăn, có tới 1,7 tỷ người hiện đang sinh

sống tại những vùng mà trước đây sốt rét đã bị đẩy lùi nhưng đang phát triển

trở lại Điều đáng lo ngại là ký sinh trùng sốt rét đã và đang trở nên kháng hầu hết các loại thuốc quen thuộc như Quinin, Cloroquin, Mefloquin, Primaquin,

Quinacrin [31]

Vào năm 1972, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được từ cây Thanh hao hoa vàng một chất có tác dụng điều trị sốt rét gọi là Quinghaosu (Artemisinin) Chất này đã chứng tỏ hiệu lực điều trị sốt rét nhanh trên hàng ngàn bệnh nhân bị sốt rét do nhiễm chủng P falciparum kháng các thuốc

khác Hơn thế, Artemisinin và dẫn chất có khả năng vượt qua hàng rào máu

não nên rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [15], [44] Tuy nhiên, khả

năng hoà tan của Artemisinin kém, tỷ lệ tái phát sau khi dùng cao nên tác

dụng điều trị có phần còn hạn chế Để hoàn thiện hơn tác dụng điều trị của

Artemisinin, các nhà khoa học Trung Quốc và thế giới đã bán tổng hợp ra một luạt các dẫn chất của Artemisinin trong đó đáng chú ý là Artesunalt Với ưu

điểm là có hoạt lực điều trị mạnh hơn Artemisinin, Artesunat hiện đang được

sử dụng rộng rãi

Trang 9

Hiện nay, ở Việt Nam có hai phương pháp chính thức để định lượng viên

nén Artesunat là phương pháp ghi trong tiêu chuẩn ngành (phương pháp đo quang phổ tử ngoại) và phương pháp ghi trong tiêu chuẩn cơ sở (phương pháp chuẩn độ acid-base) Trên thực tế, khi áp dụng các phương phap này, kết quả

thường không phù hợp Các kết quả định lượng cho thấy, các phương pháp này

là đúng, chính xác song không đặc hiệu Các sản phẩm phân huỷ trong quá trình bảo quản và nguyên liệu dùng để điều chế Artesunat (DHA và acid

sucinic) ảnh hưởng rất lớn tới kết quả định lượng Khi trong chế phẩm cần

định lượng có lẫn 1% acid sucinic thì kết quả định lượng theo phương pháp

ghi trong tiêu chuẩn cơ sở tăng khoảng 6,5% Khi trong chế phẩm cần định lượng có lần 1% DHA thì kết quả định lượng theo phương pháp ghi trong tiêu chuẩn ngành tăng khoảng 1,4% Vì vậy, các phương pháp này chỉ có thể áp

dung để định lượng các mẫu Artesunat không lẫn hoặc lẫn rất ít tạp chất Nếu Artesunat đã lẫn tạp chất DHA hoace acid succinic thi két qua định lượng theo

cac phuong phap noi tren bao gis cling cao hon thuc té [12]

Để xây dựng một phương pháp định lượng Artesunat có tính đặc hiệu

cao, đồng thời góp phần làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định lượng Artesunat khi có mặt Dihydroartemisinin và/hoặc Acid succinic trong thành phẩm viên nén Artesunat 50mg bằng phương pháp sắc ký lông hiệu năng cao (HPLC}" với những mục tiêu sau:

- Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng Artesunat khi có mặt

dihydroartemisinin và/hoặc acid succinic trong viên nén Artesunat 50mg bằng phương pháp HPLC

- Đánh giá phương pháp xây dựng, đặc biệt chú ý tới tính đặc hiệu của phương pháp

- Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng một số chế phẩm viên

nén có chứa Artesunat 50mg hiện đang được sản xuất và lưu hành tại Việt

Trang 10

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Cay Thanh hao hoa vang

- Tén khoa hoc: Artemisia annua L Asteraceae

- Tên gọi khác: Ngải si, ngái đắng, ngải hoa vang, cay 14 ngai

- Đặc điểm thực vật:

Cây thảo sống hàng năm, cao từ I- 1,5 m, than cé rãnh, gần như không lông, lá xẻ lông chim 2 lần, thành phiến hẹp, phủ lông mềm, phiến lá hình

xoan, không lông Cụm hoa đầu hợp thành 1 chùm kép, lá bắc tổng bao hình

trứng hoặc hình bầu dục Hoa màu vàns nhạt, mỗi cụm hoa pồm 6 hoa, giữa là hoa lưỡng tính, xung quanh là hoa cái Quả bế hình trứng, dài Í mm, không có

mào lông, mặt vỏ có tuyến chứa tinh dầu Ra hoa tháng 6 -11, qua thang 3 -

10, thường lụi vào tháng 5 Trên thị trường, thường bị lẫn với một cây khác gọi là hoàng cao hay xú cao cũng họ Cúc nhưng lá quanh năm màu vàng lục và có mùi hôi, còn cây thanh hao hoa vàng thật thì chỉ về mùa thu lá mới vàng, trước

đó có màu lục [I§] [37] [39]

Cây mọc ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu tập trung ở những nơi có khí hậu nhiệt đới, ôn đới như: Bắc Mĩ, Nga, Trung Quốc, Mông Cổ, Nhat Ban, Ấn Độ Ở Việt Nam, cây mọc hoang thành từng cụm dọc ven sông, suối, chân

đồi nơi ẩm thấp, có nhiều ở các tỉnh phía Bắc: Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng

Ninh, Thái Nguyên và dọc các tính miền Trung Hiện nay, cây được trồng trên quy mô lớn ở nhiều nơi, chủ yếu là lấy lá để chiết xuất Artemisinin [17].[18]

Thanh hao hoa vàng là cây thuốc cổ truyền của Trung Quốc đã được sử

dụng lâu đời Trong các tài liệu y học cổ truyền của Trung Quốc có nói đến cây Quinghao là cây đã được ghi chép sớm nhất chữa được tới 52 loại bệnh, trong đó có sốt rét Từ đời Hán, những năm 168 trước công nguyên người ta

Trang 11

[18], [37]

Trên thé giới có nhiều loài Artemisia nhưng chỉ c6 Artemisia annua L

Asteraceae là chứa hàm lượng Artemisinin đáng kể [17], [45]

Ngoài Artemisinin là một secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân tử có tác dụng điều trị sốt rét, trong thành phần của cây còn có các secquiterpen khác như: acid artenuic, artemisiten, deoxy artemisinin Ngoai

ra, trong thành phần của cây còn có flavonoid và các tinh dau - phan lớn là các

mono terpen: camphor; 1, 8 cineol; B-caryophylen [18]

1.2 Dai cuong vé Artesunat

Sự phát hiện và phân lap Artemisinin tt Artemisia annua là một bước ngoặt lớn trong việc sử dụng dược liệu để điều trị sốt rét Artemisinin có hiệu lực mạnh và có tác dụng nhanh ngay cả với chủng Plasmodium đã kháng

Cloroquin Tuy nhiên, các thí nghiệm lâm sàng cho thấy rằng khi điều trị bằng

Artemisinin thì tỷ lệ tái phát xảy ra sớm hơn khi dùng Cloroquin mặc dù bệnh nhân đã sạch ký sinh trùng trong mau [31] Nhằm tăng độ tan và tăng hiệu lực điều trị của Artemisinin, vào những năm đầu của thập ky 80, các nhà khoa học Trung Quốc đã bán tổng hợp ra một loạt dẫn chất của Artemisinin trong đó đáng chú ý nhất là Artesunat hiện nay đang được sử dụng rất rộng rãi [35] L.2.1 Một số tính chất của Artesunat [4],[38], [42]

Trang 12

Công thức phân tử: CạH;¿O, Khối lượng phân tử: 384,43

Tên khoa học: (3B, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 108, 12R, 12aR) decahydro- 3,6,9

- trimethyl - 3,12 epoxy - 12H pyrano[4,3-j]-1,2 benzodioxepin -10-ol, hydrogen succinat

Tén khac: Acid Artesunic, Dihydro artemisinin -10 o - hemisuccinat Tính chất vật lý: Tình thể không màu hay bột kết tỉnh trắng, không mùi, không vị, dễ tan trong ethanol, aceton, cloroform, khó tan trong nước Dưới dạng muối natri, Artesunat lại dễ tan trone nước nên được dùng để chế dạng

thuốc tiêm Artesunat kém bền trong môi trường acid hoặc kiểm Năng suất quay cực : [z[Ƒ' =(+10)9 +(+14)°

1.2.2 Bán tổng hop Artesunat

Trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc, D.L

Klayman, P Brossi và cộng sự, Đỗ Hữu Nghị và cộng sự tại trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tổng hợp Artesunat qua 2

giai đoạn với hiệu suất cao [20]:

- Giai đoạn 1:

Artemisinin duoc khử hoá nhóm lacton thành Dihydro artemisinin (DHA), tac nhân khử là Natri Borohydrid (NaBH,) trong môi trường

Trang 13

tii bán tổng hợp ra Âriesunat

- Giai doan 2:

Có thể bán tổng hợp Artesunat tir DHA theo 2 phương pháp:

* DHA được ester hoá thành Artesunat khi tác dụng với anhydrid succimc hoặc succinyl chlorid, xúc tác là pyridin và 4- Dimethylaminopyridin (4-DMAP) hay hôn hop DMAP va

Dicycloheexyl carbodumid (DCC)

* DHA duoc ester hoa thanh Artesunat khi tác dụng với acid succinic, xúc tấc là hỗn hợp 4-DMAP và Dicyclohecxyl carbodiimid (DCC) Phương pháp đi từ anhydrid succinic cho hiệu suất cao hon rất Cth Ó—C—CH;—CH;—COOH CH DCC | COOH DHA Ar tesunat 1.2.3 Tac dung, co chế, dược động học của Artesunat 1.2.3.1 Tac dung

Kết quả thử dược lý lâm sàng cho thấy Artesunat là một trong những thuốc điều trị sốt rét có hiệu quả nhất hiện nay Tác dụng diệt ký sinh trùng

sốt rét của nó mạnh gấp 5,2 lần so với Artemisinin Artesunat diệt thể phân

Trang 14

tác dụng cắt cơn sốt nhanh Thuốc có tác dụng mạnh trên cả ký sinh trùng đã

kháng Cloroquin, Mefloquin, Fansidar Thuốc có tác dụng tốt với sốt rét thể

ác tính và sốt rét thể não [1ã], [44] 1.2.3.2 Cơ chế

Theo Gu va cong sự, tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rết của Artesunat là

do cầu nối peroxyd nội phân tử đã tạo ra các gốc tự do Các gốc tự do này tấn công vào những thành phần cơ bản trong tế bào Plasmodium và tiêu diệt

chúng Ở pH cao, Artesunat tạo ra tức thì các dạng hoạt động Cơ chế này khác hẳn với các thuốc tổng hợp trước đây Bằng phương pháp đánh dấu dùng Tri các nhà khoa học nhận thấy nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm

Plasmodium cao hon hản so với hồng cầu bình thường do Artesunat tấn công vao mang Plasmodium Ngoai ra, Artesunat natri còn ức chế hoạt tính của cytocrom oxydase và hệ vận chuyển Glutamin trong hồng cầu [ I5]

I.2.3.3 Dược động học

Theo đường uống, Ảrtesunat hấp thu từ 24- 64% Thời gian bán thải T,,

= 41 phút Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển hoá tại gan Thuốc qua được hàng rào máu thai nhi nên tránh dùng cho phụ nữ có thai Thuốc được thải trừ qua nước tiểu Các chất thải trừ tìm thấy trong nước tiểu là: deoxy artemisinin, 9-10 dihydro artemisinin , dihydro deoxy artemisinin [15]

I.2.3.4 Tác dụng trên lâm sàng

So sánh kết quả điều trị của Artesunat với Artemisinin thấy rằng: khi

dùng Artesunat 600mg (I00mg/ngàyx6) và dùng Artemisinn 3ø (50Dmg/ngàyx6) thì thời gian sạch kí sinh trùng khi dùng Artesunat là nhanh hơn (26,4 giờ so với 31 giờ của Artemisinin), thời gian cắt cơn sốt nhanh hơn (18,9 giờ so với 21,8 giờ của Artemisinin) và ti lệ tái phát khi dùng Artesunat thấp hơn (20% bệnh nhân so với 35% bệnh nhân điều trị bằng Artemisinin)

Trang 15

cầu nối peroxyd thì nó không còn tác dụng nita Boi vay, idc dung của

Artesunat bị giảm đi khi có mặt các chất phá huỷ nhóm chức peroxyd như: catalase, acid ascorbic, vitamin E, glutathion dạng khử

- Sự có mặt của các thuốc như: Miconasol, Doxarubicin có tác dụng

làm tăng hiệu lực điều trị của Artesunat

- Các thuốc chống sốt rét khác như Cloroquin, Mefloquin, Primaquin khi

phối hợp với Artesunat cho tác dụng hợp đồng tăng cường hoặc hợp đồng

cộng [ L5]

1.2.4 Doc tính 1.2.4.1 Doc tinh cấp

LD50 trên chuột nhất = 1200 (1081-1331)mg/kg can nang bang dudng uống Khi cho chuột nhất trắng uống Artesunat liều 4mg/kg cân nang trong 5

ngày, không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận, cấu

trúc chung của mô gan và thận không thay đổi, có hiện tượng xung huyết các

mach mau trong than [3], [16]

1.2.4.2 Độc tính bán cấp

Cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch Artesunat Img/ml pha trong natri hydrocacbonat 5% với liều 20mg/kg/24h vào giờ nhất định trong ngày, cho uống liên tục 30 ngày chưa có độc tính bán cap [16]

1.2.4.3 Kha ndng gây đột biến của Âriesunat

Artesunat không làm tăng tần số rốt loạn nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ

xương hoặc tế bào tính hoàn, không làm xuất hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về sinh sản, các chuột con được đẻ ra không có đị

tật bẩm sinh Quan sát được ở cả FI và F2, số lượng cũng như khối lượng của

con chuột được đẻ ra là bình thường Khi chuột chửa uống Artesunat không

Trang 16

Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử

nghiệm Artesunat trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân nhiễm P falcIparun

không biến chứng Kết quả:

- Khi thử trên người khoẻ mạnh không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá, điện tim trước và sau khi thử Tại chô tiêm không có phản ứng, không đỏ, không mẩn ngứa Thuốc khuyếch tán nhanh Dấu hiệu chủ quan: người tình nguyện không thấy có cảm giác gì đặc biệt sau khi tiêm [3]

- Đối với bệnh nhân nhiễm P falciparum không biến chứng: Thuốc có hiệu quả điều trị trên mọi đối tượng bệnh (cả người lớn lẫn trẻ em), làm giảm

nhanh mật độ của kí sinh trùng (đa số trong vòng 24 giờ đầu), cắt sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng Thuốc không ảnh hưởng đến các chức năng gan thận, huyết học và hệ tim mạch [3]

1.2.5 Chế phẩm và chỉ định của Artesunat trong điều trị [I5],|44]

1.2.5.1 Các dạng bào chế của Artesunat

* Dạng viên nén 50 mg hoặc 100 mg Artesunat

# Dạng tiêm : Lọ chứa 60mg Artesunat kèm theo ống tiêm chứa Iml dung dịch natri hydrocarbonat 5% trong nước cất

* Thuốc đạn và viên nang đặt trực tràng chứa 00mg, 400mg Artesunat Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng I1 loại chế phẩm Artesunat:

* Viên nén Artesunat 50mg của Công ty Dược cổ phần Traphaco, Công

tý Dượe liêu TW l1, Xí ñghiệp DBETW 1, Xí nghiệp DPTW 24

* Viên nang Artesunat 50mg của Công ty Dược liệu TW 1 * Lo bét pha tiém Artesunat 60mg cua Xi nghiép DPTW 1 1.2.5.2 Chi dinh

Trang 17

1.2.5.3 Liéu diing * Dạng uống:

Điều trị : Iviên 50mg x 2 lần / ngày, uống trong 6 ngày

Phòng bệnh: uống 2 viên/ lần / tuần, uống trong vòng 5 tuần

* Dạng tiêm:

Người lớn: 1,2 - 6mg/kg/lan Trẻ em (dưới 6 tuổi ): Img/kg/lần

Tuỳ theo bệnh nhân, cứ sau 24- 48 giờ nhắc lại một lần như trên 1.3 Một số phương pháp định lượng Artesunat

1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại

Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại có bước sóng ngắn Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunat chuyển thành Q289 là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289 nm, do đó có thể định lượng

Artesunat trong chế phẩm và nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ của

Artesunat sau khi đun nóng trong môi trường kiểm trên mấy đo quang phổ ở bước sóng 289 nm [4], [6] Nhân xét: - Phương pháp có trong Dược điển Việt Nam III và nhiều tiêu chuẩn cơ SỞ - Phương pháp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị các cơ sở đều có thể có được

- Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là Artesunat mà là sản phẩm chuyển hoá của nó trong môi trường kiểm - Q289 Theo Nguyễn Mạnh Cường, điều kiện áp dụng là lượng dihydro artemisinin (DHA) trong chế phẩm phải rất nhỏ, khi đó phép định lượng mới có kết quả đúng Tuy nhiên, trong

Trang 18

II

1.3.2 Phương pháp đo kiêm trong môi trường nước

Nguyên tắc: Artesunat là ester của acid succinic và dihydro artemisinin

nên trong phân tử còn một nhóm chức acid tự do, do đó có thể định lượng trực

tiếp nhóm chức này bằng NaOH với chỉ thị phenolphtalein từ đo suy ra hàm lượng Artesunat [7] hoặc có thể định lượng Artesunat bằng phương pháp

chuẩn độ gián tiếp, cho Artesunat tác dụng với một lượng dư kiềm rồi chuẩn độ kiềm dư bàng dung dịch chuẩn acid [10]

Nhân xét: Theo Nguyễn Mạnh Cường [ I0]:

- Phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng được khi acid succinic tự

đo trong chế phẩm nhỏ hơn 0,2%; do đó khó có thể áp dụng cho việc định

lượng viên nén

- Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp chính xác, đúng, đặc hiệu, ít phụ thuộc vào sự có mặt của tạp chất, dễ thực hiện Tuy nhiên, phương pháp mới chỉ được nghiên cứu cho việc định lượng nguyên liệu Artesunat, muốn áp dụng phương pháp này trong định lượng các dạng bào chế của

Artesunat thì cần được nghiên cứu thêm

1.3.3 Phương pháp đo kiểm trong môi trường khan

Nguyên tắc: Cũng dựa vào nhóm chức acid tự do còn lại trong phân tử Artesunat để tiến hành định lượng Chế phẩm được hoà tan trong ethanol tuyệt đối, chuẩn độ bằng dung dich tetrabutylamonium hydroxyd trong 2- propanol Điểm kết thúc của phép định lượng được xác định bang chi thi tim tinh thé

trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm dừng [42]

Nhân xét: Acid succinic cũng tham gia phản ứng vì vậy tính đặc hiệu của phương pháp không cao

1.3.4 Phuong pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối

hydroxamat sắt

Cho Artesunat tác dụng với dung dịch hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm Trung hồ rồi acid hố dung dịch bằng acid hydroclorid và

Trang 19

Theo [13]: Phương pháp này không phụ thuộc vào sự cố mặt của acid succinic, song sự có mặt của DHA lại ảnh hưởng đến kết quả định lượng nên

tính đặe hiệu của phưỡng pháp chưa cao

1.3.5 Phuong phap HPLC voi detector UV 235nm

Định lượng Artesunat với pha động là acetonitril - đệm phosphat pH= 5,1 (tý lệ 38:62) hoặc với pha động acetonitril - đệm acetat pH=5,5 (tỷ lệ 1:1), bước sóng phát hiện là 235 nm [30]

Nhân xét: Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng

ngắn, trong phương pháp định lượng này bước sóng phát hiện là 235nm nên

lượng Artesunat tiêm vào máy phải rất lớn, mặt khác DHA (nếu có) có thể sẽ

ảnh hưởng đến kết quả định lượng

1.3.6 Phuong phap HPLC voi detector UV 210nm

Để định lượng Artesunat trong dược liệu, trong các dịch sinh vật, người ta đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trình sắc ký cột Lichrosorb Rp 60 - 5um, 125 x 4mm; pha động: 48% CH,CN + 31% dung dịch KH;PO, 0,05M trong nước + 20% nước; tốc độ dòng Iml/ phút; detector UV 210 nm

và thể tích tiêm 20 ul Với chương trình chạy sắc ký trên, Artesunat có tạ =

2,1 phút [37]

1.3.7 Phuong phap HPLC voi detector UV 2l6nm

* Định lượng Artesunat với cột CI§ (125 x 3 mm), cỡ hạt 5 um, pha động là acetonitril - đệm pH = 3 (tỷ lệ 50:50), tốc độ dòng 0,6ml/phút, thể tích

tiêm 20Hl (nồng độ dung dịch tiêm là 4mg/ml), bước sóng phát hiện là 216 nm [43]

Nhân xét: Chương trình sắc ký này chưa thấy đề cập đến độ ổn định của

mâu khi sử dụng đệm pH3 trong pha động (Artesunat không bền trong môi

trường acid) Chương trình này còn được áp dụng để xác định tạp DHA trong

nguyên liệu Artesunat nhưng đã thừa nhận rằng đáp ứng pic của các tạp chất

Trang 20

15

* Định lượng Artesunat với cột Nucleosil CI8 (250 x4.6 mm) cỡ hạt 5 um, pha động là acetonitril - methanol - đệm phosphat pH = 3,5 (tỷ lệ 10:50:40), tốc độ dòng 0,8ml/phit, thể tích tiêm 20ul (nồng độ dung dịch tiêm 1a 4mg/ml), bước sóng phát hiện là 216 nm [29]

Nhân xét: Trong chương trình sắc ký trên, DHA bị lưu giữ quá lâu, vì vậy

sẽ kéo dài thời gian chạy sắc ký nên không đạt yêu cầu về kinh tế và thời gian

khi cần xác định giới hạn tạp chất

1.3.8 Phương pháp HPLC với detector khúc xạ kế

Định lượng Artesunat với pha tĩnh là cột Rp I8 (125 x 3,5 mm), cỡ hạt 5

um, pha déng la acetonitril - dém phosphat pH = 3 với tỷ lệ 1:1, tốc độ dòng

0,6 ml/phút, nông độ dung dịch mẫu 4 mg/mIl, thể tích tiêm mẫu là 20 kỊ,

đetector khúc xạ kế [42]

1.3.9 Phuong phap HPLC voi detector dién hoa

Nguyên tắc: Trong phân tử Artemisinin và các dẫn xuất của nó chứa cầu

nối peroxyd nội phân tử, cầu nối này quyết định tác dụng điều trị sốt rét của

chúng; đồng thời, chính sự có mặt của cầu nối pcroxyd mà người ta đã sử

dụng phương pháp HPLC với detector điện hoá để định lượng Artesunat Quá trình khử điện hoá xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau [37], [46]: sẻ CH, CH; X Go O—“Z —— Q=⁄Z ˆ¬H ! ee “ee - a R Nhân xét: Phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp

trong việc định lượng Artesunat có hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật, tuy

nhiên phương pháp HPLC với detector điện hố khơng phải cơ sở nào cũng có

Trang 21

1.3.10 Các phương pháp định lượng khác

Cầu nối peroxyd nội phân tử của Artemisinin và Artesunat còn thể hiện

su đấp ứng trên điện cực giọt thuỷ ngân nên người ta còn dàng phương pháp

cực phổ để định lượng Ngoài ra phương pháp cực phổ xung và phân tích

phóng xạ miễn dịch đã được áp dụng để định lượng Artemisinin và các dẫn xuất của nó Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để định lượng Artemisinin và các dẫn xuất của nó trong mẫu thử sinh học

[35]:

- Phương pháp đo độ phóng xa: Sau khi uống thuốc đã được đánh dấu

bảng Tritium

- Phương pháp phân tích đo mật độ quang trong sắc ký lớp mỏng 1.4 Các phương pháp định lượng Artesunat trong viên nén

1.4.1 Định lượng Artesunat trong viên nén bằng phương pháp quang phổ Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 6Ômg Artesunat

cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml ethanol tuyệt đối và lác kỹ cho tan

hết hoạt chất, thêm ethanol đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu Hút chính xác 5ml dung dịch lọc vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch NaOH

0,1N đến vạch, đậy nút, sau đó để trong nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 500 + 1°C

trong | gid Lam nguội nhanh bằng nước lạnh Do độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 289 + Inm trong vòng 20 phút kể từ khi lấy ra khỏi nồi cách

thuỷ, cuvet dày Icm, mẫu trắng là dung dich NaOH 0,1N

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 60 mg Artesunat chuẩn cho vào

bình định mức 50ml và tiến hành như đã miêu tả ở trên [6]

Hàm lượng phần trăm Artesunat so với nhãn được tính theo công thức:

D,, JN,

C(%) = ane x by x100

chy

Trang 22

15

C,, : hàm lượng phần trăm Artesunat của mầu chuẩn Dạ, và D,„ : độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

mụ„, : khối lượng tính bảng gam của Ârtesunaf trong bột viên nén đã cân

để pha dung dịch mẫu thử (tính theo hàm lượng phi trên nhãn)

m,„„ : khối lượng tính bằng gam của Artesunat chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn

1.4.2 Định lượng Artesunat trong viên nén bằng phương pháp do kiêm

trong moi truong nước

Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 150mg Artesunat cho

vào bình nón dung tích 100ml, hoà tan bang ethanol tuyệt đối đã được trung tính trước với chỉ thị phenolphtalein và lắc kỹ Thêm 2 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt

bền vững trong 20 giây

Iml dung địch NaOH 0,05N tương ứng với 19,22mg Artesunat [7] 1.4.3 Định lượng Artesunat trong viên nén bằng phương pháp đo phổ hấp

thụ vùng khả kiến dưới dạng muối hydroxamat sắt

Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoang 110mg Artesunat cho vào cốc có mỏ, thêm vào cốc khoảng 5ml ethanol tuyệt đối và lắc kỹ cho tan hết hoạt chất rồi chuyển vào bình định mức 25ml Tiếp tục tráng cốc 3 lần, mỗi lần 5ml ethanol tuyệt đối Thêm ethanol tuyệt đối đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 5ml dịch lọc đầu và thu lấy dịch

loé Gon lai

Hút chính xác 5,0ml dung dịch lọc trên cho vào bình định mức 100m1

Thêm I0,Dml dung dịch hydroxylamin hydroclorid IN và 30,0ml dung dịch

NaOH 0,5N Lắc đều Để yên 15 phút Trung hoa dung dịch trên bằng dung

dịch HCI 2N, chỉ thị phenolphtalein thêm nước cất đến vạch

Hút chính xác 10,0ml dung dịch lọc trên cho vào bình định mức 25ml

Trang 23

Thêm nước cất đến vạch Lắc đều Để yên 15 phút Tiến hành mẫu trắng giống

như trên trong cùng điều kiện song không có hydroxylamin hydroclorid

Song song tiến hành như trên với mẫu Artesunat chuẩn (hay đối chiếu)

Đo độ hấp thụ của các dung dịch này ở bước sóng 506nm , cuvet day

lem [13]

Ham luong phan tram Artesunat so với nhấn được tính theo công thức:

C0)= wt x, x 100 +

„1n

~ ^^ anon anol fae

Trong đó: C(%):hầm lượng phần trăm Artesunat eủa mầu thử

Cụ, : hàm lượng phần trăm Artesunat của mầu chuẩn

Dạ, và D,„ : độ hấp thụ của dung dich thir va dung dịch chuẩn mụ, : khối lượng tính bằng gam của Artesunat trong bột viên

nén đã cân để pha dung dịch mẫu thử (tính thco hàm lượng ghi

trên nhãn)

m„ : khối lượng iính bằng gam của Âriesunat chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn

1.5 Nhân xét và lựa chọn

- Phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở 289nm cho kết quả không đúng vì DHA và các sản phẩm phân huỷ cũng hấp thụ ở bước sóng này [ 10]

- Phương pháp đo kiềm chỉ cho kết quả đúng khi không có acid succinic

trong chế phẩm, acid này lại thường có trong viên nén Artesunat [ lÔ]

- Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối hydroxamat sắt: Kết quả định lượng bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của DHA

[13]

- Phuong phap HPLC véi detector dién hoa, detector khúc xạ kế [37],

[46]: có kha nang phân tích tốt, tính đúng và tính đặc hiệu cao, song hiện nay

Trang 24

kể

- Các phương pháp HPLC với detector 235nm đến 253nm có thể không

phải trực tiếp định lượng Artesunat nên sản phẩm phân huỷ có thể ảnh hưởng

đến kết quả định lượng

- Phương pháp HPLC với detector 2l6nm của Dược điển quốc tế [43] chưa thấy đề cập đến ảnh hưởng của tạp acid succinic, chưa thấy đề cập đến độ ốn định của mẫu khi sử dụng đệm pH3 trong pha dong (Artesunat khong bền trong môi trường acid [38],[40])

- Phương pháp HPLC với detector 216 nm [29]: áp dụng định lượng được Artesunat, song khi cần xác định giới hạn tạp liên quan, phương pháp này không thuận tiện vì DHA có thời gian lưu quá dài

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng

rất rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm dược phẩm, đặc biệt là có sự ổn

định và độ chọn lọc cao Chính vì vậy, trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu cải tiến, xây dựng qui trình kĩ thuật mới để chiết tách hoàn toàn

Artesunat ra khỏi viên nén và định lượng Artesunat trong viên nén mà không bị ảnh hưởng bởi tạp chất (DHA và acid succinic) bằng phương pháp sắc ký long hiệu năng cao với detector UV

1.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

I.6.I Nguyên tắc

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý, dùng để tách

và định lượng các thành phần trong hôn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa

eáe ehất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hõà lân vào nhau: pha fính

(trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung địch của hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột, chúng sẽ tương tác với pha

nh (hấp phụ, liên kết, trao đổi ion ) tuỳ thuộc vào bản chất của cột và của

chất cần phân tích Khi ta bơm pha động qua cột với áp suất cao thì tuỳ thuộc

vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ đi chuyển qua cột với vận tốc khác

nhau dẫn đến sự phân tách

CH 364

Trang 25

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phat hiện gọi

là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra may in [14]

1.6.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyền với

một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra

khỏi cột Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình

rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc

ký của hỗn hợp nhiều thành phần, chúng ta có một sắc ký đồ gồm nhiều pic Nếu quá trình tách sắc ký tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất sẽ có bấy

nhiêu pic riêng biệt trên sắc ký đồ [14],[19]

1.6.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau đây:

- Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh

được áp suất (thường từ 0 - 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc

độ dòng ổn định , phù hợp với quá trình sắc ký

- Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi: Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tỉnh đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký

được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 km ) và đã đuổi khí

hoà tan Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình, trong phương pháp gradien cần phải có nhiêu bình

- Hệ tiêm mẫu: Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay

hay tiêm mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ

vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm (hệ tiêm mâu tự động) - Cột tách: Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc

Trang 26

19

trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar Trong cột được nhồi pha tĩnh Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ và mục đích

eủa quá trình sắc ký Nói chung, các cột phân tích thường có chiều đài từ 10 -

25 cm, đường kính trong từ 2 - 5 mm

- Detector: Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tuỳ theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau:

+ Detector hap thu UV — VIS

+ Detector phổ phát xạ nguyên tử

+ Detector huỳnh quang

+ Detector điện hoá

+ Detector khúc xạ kế + Detector đo độ dẫn điện

Detector hay được sử dụng nhất là detector hap thu UV — VIS (phat hién chất cần phân tích dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy của chất cần phân tích ở một bước sóng nhất định)

- Thiết bị hiển thị kết quả: Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để ghi tín hiệu đo dưới dang pic [1], [15], [19]

1.6.4 Các thông số của quá trình sắc ký

* Thời gian lưu tạ (phút): là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm

đến lúc xuất hiện đỉnh của pic), tạ càng lớn chất tan bị lưu giữ càng mạnh và

tốc độ đi chuyển của nó càng nhỏ Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính

của sắc đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi [ I5]

* Thời gian chết tạ: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh

* Thời gian lưu thực tạ”: tạ” = tạ - lạ

Trang 27

* Độ rộng ở day pic: W, * Hệ số phân bố K:

=r CSG,

C, va C,, la néng d6 chat tan ở pha tĩnh va pha động tương ứng, k là hệ số

phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ [15] * Hệ số dung lượng k`: là một đại lượng dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất k'= Up = fa ~o _ fe = 0 t t, fs

k’ phu thuéc vao ban chat của các pha, bản chất của chất tan, nhiệt độ và

đặc điểm của cột Với một chất k? càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp Nếu

k' lớn, pic bị doãng, độ nhạy kém Nếu k” nhỏ thì tạ cũng nhỏ và sự tách kém

Trong thực tế k' nằm trong khoảng từ 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k” khác nhau [1S]

Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích

sao cho:

I<k <8

Néu k < I thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp Nếu k > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài [1]

* Độ chọn lọc œ:

_#;_ br, — Íạ

k' Ep — Io

(vdi k’, > k’,) [32]

Trang 28

21 2 í N =16 i [15] hoặc W = sst5 fe (32],[34] h Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: 77 -= [15]

* Độ phân giải R: Đặc trưng cho mức độ tách của 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo

công thức [1Š]:

pn atm tm) _ MBs, te) _ VN (a -1)k, = : 321,[34

SW, +W,, Ws, + Was, 4.a(l+k;) (32),1241

R¿ phụ thuộc vào: hiệu lực cột, thừa số chọn loc a, thừa số dung lượng

k; ( hệ số dung lượng của cấu tử ra sau

Trong thực tế: Rạ tối ưu > l,5

Để tăng độ phân giải R¿ ta có thể tăng N (đùng cột đài hỡn, giảm tốc độ

dòng của pha động), tăng k (thay đổi thành phần pha động), tăng ơ (thay loại

pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động)

* Hệ số bất đối xứng AF [35]:

AP == [32]

Trong do:

W 129: chiéu réng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a — : khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pc

Trang 29

cuối của pic rất khó xác định, pic bị kéo đuôi dài, khi tính diện tích pic sẽ mắc

nhiều sai số

Trong phép định lượng, yêu cầu: ô,8< AF < 2,5

Muốn làm cho pic cân xứng hơn ta có thể làm giảm thể tích chết (đoạn nối từ cột đến detector), thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa

giải tăng lên, điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp, giảm

bớt lượng đưa mẫu vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thể

tích tiêm [1] [1Š], [34]

1.6.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.6.5.1 Lua chon pha tinh cho HPLC

Pha tinh trong HPLC 1a chat nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định

sự tách của mọt hỗn hợp nhiều chất Bản chất chính của sự tách sắc ký hấp

phụ là dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha tính Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ

Sắc ký hấp phụ gồm có hai loại:

* Sac ky hap phụ pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân

cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực

* Sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất

phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực Trong sắc ký

pha đảo, các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực ra sau

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:

* Tro và bền vững trong môi trường sắc ký

* Tính chất bề mặt ổn định

Trang 30

23

* Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong những điều kiện

sắc ký xác định

* Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

Pha tnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO;), nền oxyd nhôm

(AI;O;), nền hợp chất cao phan tu (cellulose) hay trén nén mạch carbon Trong

sắc ký hấp phụ, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt và được sử dụng nhiều nhất Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:

i

— TM HO đế

q on

*R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoac cac alkylamin - CH, - NH,, alkylnitril - CH; - CN Sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha

thuận để phản tích các chất ít hoặc không phân cực

*R là các nhóm ít phân cực như: octyl, octadecyl, phenyl; được điều chế

bằng cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc

alkyl - R của mạch carbon (C;, C,, C,;) hay các gốc carbon vòng (phenyl) Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R ky nước nên bề mặt trở

Trang 31

Bang 1.1 Mot vai loai cột thường dùng trong HPLUC Loại sắc ký Nhóm R Tên thương mại - OH Lichrosorb Si 60 Pha thuan Aminopropyl (- C,H,-NH,) Cyanopropyl (- C,H;-CN) Nucleosil C8 Lichrosorb RP§ we Supelcolsil LC8 Zorbax C8 Pha die Nucleosil C18 Lichrosorb RP18 Octadecyl ( - C,.H,;) Supelcolsil LC18 Zorbax ODS Partisil ODS] Phenyl ( - C,H) Lil

1.6.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nước,

dung môi hữu cơ hoặc hỗn hợp dung môi theo tï lệ nhất định

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quả trình sắc

ký như: độ chọn loc a, thời gian lưu tạ, hiệu lực tách của cột, độ phân giai Rg, độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy, việc chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của một pha động: * Trơ với pha tĩnh

Trang 32

25

* Bền vững theo thời gian * Có độ tinh khiết cao

* Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

* Phù hợp với Detector

* Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (ky nước) như: n- hexan, n- heptan, benzen, cloroform, Các pha động này thường được bão hòa nước

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như:

nước, methanol, acetonitrI hay hỗn hợp của chúng Các dung mơi này có

thể hồ tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ [14], [34]

Có 4 yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của

một hôn hợp mẫu:

* Bản chất của dung môi để pha pha động

* Thành phân của các chất trong pha động:

* pH của pha động

*Tốc độ dòng của pha động

Chon dém pH

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ồn định

pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký Thông thường với chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid

nhưng cũng có trường hợp đặc biệt, còn trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tuỳ

từng trường hợp

Tốc đô dòng của pha đông

Trang 33

tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế

1.6.5.3 Lua chon Detector

Khi hệ pha động rửa giải các chất ra khỏi cột, chúng được ghi nhận bởi

Detector và chuyển thành tín hiệu được ghi trên sắc ký do

- Detector huỳnh quang và detector điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao, chủ yếu được dùng trong phân tích vết và phân tích dịch sinh học

- Detector tử ngoại (đèn Dcutcrium) và khả kiến (đèn Tungsten) có thể

làm việc ở bước sóng tuỳ chọn theo tính chất hấp thụ của chất cần phân tích

Tuỳ theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác

nhau Khi các thành phần nằm trong dạng phối hợp, muốn định lượng đồng

thời ta phải chọn đặt bước sóng phù hợp với hỗn hợp cần phân tích bằng cách quét phố hấp thụ của dung dịch các chất đem chạy sắc ký được pha trong dung môi thích hợp, ưu tiên cho chất có độ hấp thụ riêng nhỏ hơn hoặc chất có nồng độ nhỏ nhất [14], [34]

1.6.6 Phương pháp dịnh lượng, cách đánh gia pic và tinh két qua trong

HPLC

1.6.6.1 Cach danh gid pic

- Đánh giá diện tích pic: Để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế

hoặc dung máy tính đã cài đặt sẵn chương trình

- Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k" là hằng định Do chiều cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình 1.6.6.2 Phitong phép dinh lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc điện tích pic của nó

Có hai phương pháp chính được đùng để định lượng trong sác ký [I],

[14]:

- Phương pháp chuẩn ngoại: Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu

Trang 34

21

lượng) của chất chưa biết được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất

chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn

nhau của chất chuẩn thứ hai vào cả dung dịch thử và dung dịch chuẩn, chất

này có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử trong cùng điều kiện sắc

ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội

Ngoài ra, người ta còn dùng một số phương pháp sau:

- Phương pháp thêm chuẩn: Được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng

của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp Dung dịch mâu thử được thêm

một lượng chính xác chất chuẩn Các pic thu được của dung dịch chuẩn và thử

được đo trong cùng một điều kiện sắc ký Phương pháp này có thể thực hiện nhiều lần Trường hợp đơn giản nhất, với một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích pic Với phương pháp thêm nhiều lần ở các

nồng độ khác nhau ta có phương pháp thêm đường chuẩn [14].[19]

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic: Là phương pháp hay dùng để

định lượng tạp chất trong mẫu thử Trong phương pháp này, người ta cho rằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của các chất trên sắc ký đồ tỉ lệ thuận với nồng độ của chúng trong mẫu phân tích Trong phương pháp HPLC, công thức này chỉ

đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau và tất cả các

Trang 35

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT- THIẾT BỊ

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Viên nén Artesunat 50mg do Công ty dược cổ phần Traphaco sản xuất Công thức: Artesunat 50mg Lactose [40mg Amidon 45 mg Avicel ¿JmE Magnenium stearat 1,3 mg Bot Tale 5,2 mg Aerosil 1,0 mg - Một số chế phẩm viên nén Artesunat 50mg hiện đang có tại Việt Nam 2.2 Dụng cụ, hoá chất 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị

- May sic ky long hiéu nang cao: DIONEX - detector UV diode array

- May quang pho UV - VIS Lambda EZ 210 - May lac siéu 4m - SONOREX

- May do pH Meter 3305 - Jenway - Máy lọc chân không Satorlus

- Cân phân tích Metler AB 204, độ chính xác 0 mg - Bình định mức 25,50,100,1000 mI

- Cốc đong 50, 100, 500, 1000 mI

- Pipet chính xác các loại, đũa thuỷ tinh, mang loc 0,45 um - Tủ sấy và các dụng cụ thuỷ tính cần thiết khác

2.2.2 Hoá chất

- Viên nén Artesunat 50mg do Công ty cổ phần dược phẩm Traphaco san

Trang 36

29

- Artesunat đối chiếu hàm lượng 98,6% (Số kiểm soát 019261) của Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế

- Dihydro artemisinin dạng nguyên liệu do Bộ môn Công nghiệp dược -

trường đại học Dược Hà Nội sản xuất

- Acid succinic dạng nguyên liệu do Trung Quốc sản xuất - Muối KH;PO,, H;PO, đặc, KOH: loại tinh khiết phân tích

- Methanol, acetonitril ding cho HPLC (hang Merk/ Prolabor)

- Nước cất 2 lần ding cho HPLC

- Lactose, Amidon, Avicel 101, Aerosil, Magnenium stearat, bột Talc và

một vài hoá chất khác

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

- Tham khảo các phương pháp định lượng Artcsunat đã công bố

- Tham khảo các phương pháp định lượng Artesunat trong viên nén đã công bố

- Tham khảo các tài liệu đánh giá các phương pháp định lượng Ảrtesunat,

đặc biệt là tính đặc hiệu

- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hoá học của Artesunat, DHA, acid suceinic cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Artesunat trong viên nén Ärtesunaf

50mg bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu cao 2.3:2: Nội dung nghiên cứu

2.3.2.1.Ngliên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp

a.Khảo sát điều kiên sắc ký

Chọn cột, pha động bước sóng phát hiện và tốc độ dòng thích hợp để

Trang 37

Trên cơ sở có sẵn cột Nucleosil C1§ (250 x 4,6 mm, 5 kim) - một loại cột

thường dùng trong các cơ sở kiểm nghiệm, chúng tôi tiến hành khảo sát các

điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký phù hợp

b Lựa chon dung môi để hoà tan và chiết xuất Artesunat hoàn toàn ra

khỏi viên nén

- Dựa vào tính chất của Artesunat và qua tham khảo các dung mơi để

hồ tan và chiết xuất Artesunat trong các tài liệu, bằng thực nghiệm chọn ra dung môi thích hợp có khả năng tách Artesunat hoàn toàn ra khỏi viên nén, đảm bảo Artesunat không bị thuỷ phân

2.3.2.2 Xây dựng, dánh giá phương pháp định lượng Arfesunat trong viên nén Artesunat 50mg

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- xây dựng phương pháp định lượng - Đánh giá phương pháp xây dựng:

e_ Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Artesunat và diện

tích pie trên sắc ký đồ

e_ Đánh giá tính chính xác của phương pháp e_ Đánh giá tính đúng của phương pháp

e_ Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp

Oa: Ap dụng phương pháp xây dựng tiển hành dinh luong Artesunat trong viên nén Artesunat 50mg

Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Artesunat trong viên nén Artesunat 50mg của một số cơ sở sản Xuất trong nước:

- Vién nén Artesunat 50mg Cong ty Traphaco

Trang 38

31

Tiến hành sắc ký theo chương trình đã chọn trên các mẫu thử, song song

với mẫu chuẩn

Trong khoảng tuyến tính, nồng độ chất tỉ lệ thuận với diện tích pic trên

sắc ký đồ So sánh điện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử để định lượng chất thử trong dung dịch phân tích, từ đó tính ra hàm lượng chất thử trong mẫu cần định lượng

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết qua

2.3.3.1 Đánh giá dung mơi hồ tan, chiết xuất

Dùng phương pháp HPLC đã xây dựng để đánh giá sự phù hợp, tính hiệu

quả của dung môi sử dụng để tách Ảrtesunat ra khỏi viên nén dựa trên kết quả

đánh giá tính chính xác, tính đúng của phương pháp

2.3.3.2 Định tính

Thời gian lưu và hình dạng pic của từng chất trên sắc ký đồ của mẫu thử

Trang 39

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký

Trên cơ sở có sản cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm; 5 km), qua tham

khảo các tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như pha

động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện cho phép tách được Artesunat khỏi các tạp chất (acid succinic, DHA, tá dược) trong dung dịch hôn hợp tự tạo chứa các chất đó

3.1.1 Khao sat chọn thành phần pha động và tốc độ dòng

3.1.1.1 Cơ sở lý thuyết

Tham khảo chương trình sắc ký để định lượng Artesunat trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng [29]:

- Cot Nucleosil C18 (250 x4,6 mm), co hat 5 um s4 - Pha động: acetonttril - methanol - đệm phosphat pH = 3 10:50:40) - Tốc độ dòng 0,8ml/phút ttn so — Wes — > - Thé tich tiém 20ul (néng dé dung dich tiém 14 4mg/ml) - Bước sóng phát hién la 216 nm Kết quả tách được acid succinic, Artesunat, DHA với thời gian lưu của 3 chất như sau:

- Thời gian lưu của acid succinic tạ= 2,673 phút - Thời gian lưu của Artesunat t,= 7,220 phút - Thời gian lưu của DHA t„= 27,540 phút

Trang 40

33

Tir phan tich ly thuyét, dua vao dac tinh cua acid succinic, Artesunat, DHA nhan thay:

- Acid succinic rat phan cuc nén bi luu gi = ngắn và ít phụ thuộc vào tỉ lệ ¡3 +, pha động

- DHA không phụ thuộc vào pH nhưng rất khó tan trong nước và dễ tan trong MeOH, vì vậy thời gian lưu của DHA sẽ phụ thuộc rất nhiều vào tỉ lệ MeOH trong pha động Tăng tỉ lệ MeOH trong pha động sẽ rút ngắn được thời gian lưu của DHA

- Thời gian lưu của Artesunat phụ thuộc vào pH Dưới dạng muối của kim loại kiềm, Artesunat tan trong nước nhiều hơn DHA Acid succinic có hai giá trị pKạ : pK„¡= 4,16; pK;;= 5.61 nên có thể dự đoán Artesunat có pKaz5

Như vậy, ở pH 7 thì 99% Artesunat tồn tại ở dạng anion, có khả nang tach ra khỏi DHA Mặt khác, Artesunat lại không bền trong môi trường acid và môi

trường kiềm, vì vậy nếu sử dụng pH trung tính mà vẫn tách được Artesunat sẽ đảm bảo Artesunat không bị thuỷ phân

- Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là acctonitril, methanol, nước hay hỗn hợp của acetonitril, methanol, nước Do Artesunat dễ tan trong MeOH nên có thể thay acetonitril (dung môi đắt hơn)

bằng MeOH, vừa giảm thành phần pha động, vừa đạt hiệu quả hơn về kinh tế

3.1.1.2 Chọn hệ đệm

Trên cơ sở phân tích lý thuyết trên, chúng tôi tiến hành khảo sát hệ pha

động là hỗn hợp MeØH với các dung dịch đệm phosphat 0,1M pH=7; đệm

phosphat O.01M pH=7, Ivà đệm phosphat 0,01M pH=7,2

Định dạng
Số trang	89
Dung lượng	31,23 MB